田紹銳，溫玉霞，馬 婷，陳海濤，徐 宸，汪代斌，孫現(xiàn)超*

1. 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶市北碚區(qū)天生路2 號 400715

2. 重慶煙草科學(xué)研究所，重慶市北碚區(qū)天生路216 號 400715

煙草病毒病是煙草生產(chǎn)上的重要病害之一［1］，一旦發(fā)生流行會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。因此，對煙草病毒病的有效防治已成為煙草生產(chǎn)上急需解決的問題［3］。據(jù)報道，煙草上已分離到的病毒種類有47種，我國煙草上已鑒定出的病毒有17種［4-5］，重慶煙區(qū)煙草上已鑒定出的病毒有9 種，包括煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃 瓜 花 葉 病 毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、馬鈴薯 Y 病毒（Potato virus Y，PVY）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、煙草番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）和馬鈴薯 X 病毒（Potato virus X，PVX）等［6-9］。辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）為（+）ssRNA 病毒，屬于馬鈴薯Y 病毒科馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus），主要為蚜蟲以非持久性方式進(jìn)行自然傳播，傳播擴(kuò)散速度快，該病毒在全球多個國家和地區(qū)廣泛發(fā)生，嚴(yán)重危害辣椒和煙草［10］。2000 年報道該病毒侵染煙草［11］，2015年首次報道在重慶辣椒上檢測出ChiVMV［12］。該病毒具有較強(qiáng)的致病性和破壞性，侵染煙草后會誘發(fā)系統(tǒng)性葉片枯斑，感病部位細(xì)胞壞死。隨著病毒的擴(kuò)散癥狀越發(fā)嚴(yán)重，煙草葉片自下而上干枯脫落甚至整株死亡［13］。隨著交通和物流業(yè)的快速發(fā)展，病毒的遠(yuǎn)距離傳播率增加。ChiVMV這個局部區(qū)域發(fā)生的病毒也開始在新的煙區(qū)出現(xiàn)。近兩年來，在重慶煙區(qū)發(fā)現(xiàn)了葉片出現(xiàn)黃化斑點、枯斑等癥狀的煙株，疑似報道的ChiVMV感染癥狀。為了明確發(fā)病植株中是否含有ChiVMV，以及是否為復(fù)合侵染，采用分子生物學(xué)檢測方法對重慶煙區(qū)出現(xiàn)疑似ChiVMV侵染癥狀的煙葉樣品進(jìn)行病毒種類檢測鑒定，并確定當(dāng)前煙草病毒的種類、發(fā)生及復(fù)合侵染情況，旨在有針對性地制定綜合防治措施，進(jìn)而有效控制病毒病。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

于2019—2020 年在重慶涪陵（11 份）和巫溪（6份）兩個煙區(qū)采集發(fā)病煙草樣品17份，在重慶北碚區(qū)西南大學(xué)煙草試驗田采集發(fā)病煙草樣品1份，煙葉表現(xiàn)出不同程度的花葉、黃化、皺縮、枯斑等癥狀。病原鑒定在西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物免疫與病害生態(tài)防控實驗室完成。

RNA 提取試劑 RNAiso Plus（Code No. 9109）、rTaqTMPolymerase［寶日醫(yī)生物技術(shù)（Takara）有限公司］；反轉(zhuǎn)錄試劑盒NovoScrip Plus All-in-onev1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（E047，蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司）；大腸桿菌Escherichia coli DH5α、T 載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；DNA 回收試劑盒Universal DNA Purification Kit（北京擎科生物科技有限公司）；所用引物均由深圳華大基因股份有限公司合成；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等均為分析純（重慶市鈦新化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用RNAiso Plus 進(jìn)行煙葉總RNA 提取，方法詳見 https：//www.takarabiomed.com.cn/DownLoad/91 08-9109.pdf。使用近岸蛋白NovoScrip Plus All-inonev1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參考說明書（https：//www.novoprotein.com.cn/Public/Uploads/uploadfile/files/Molecule_DS/E047.pdf）進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄體系：2×NovoScript Plus 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix 10 μL，RNA（100 ng）模板2 μL，gDNA Purge 1 μL，加入DEPC 處理水至20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：50 ℃反應(yīng)20 min，75 ℃終止反應(yīng)5 min，16 ℃保存5 min。

1.2.2 病毒外殼蛋白擴(kuò)增、克隆及測序

根據(jù)NCBI 已報道上述病毒的外殼蛋白序列并參考本實驗室的前期研究［14］，使用下列引物進(jìn)行試驗（表1）。PCR 擴(kuò)增體系為：2×PCR Mix 10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，模板DNA（100 ng）1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序按照近岸蛋白2×Taq Master Mix（https：//www.novoprotein.com.cn/Public/Uploads/uploadfile/files/Molecule_DS/E005.pdf）說明書設(shè)置。

表1 RT-PCR擴(kuò)增的特異性引物Tab.1 Specific primers used for RT-PCR

參考DNA回收試劑盒（北京擎科生物科技有限公司）操作說明（https：//tsingke-oss.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/prod/3d3703039c984637a97d8e033eb48 4c9.pdf）將目的條帶回收，并將回收的片段與pGEM-T Easy 載體連接后進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，于37 ℃條件下培養(yǎng)16 h 后挑選數(shù)個陽性克隆送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 進(jìn)化關(guān)系分析

使用 BLAST（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進(jìn)行序列比對，選擇同源性較近或GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的病毒，用MEGA 7.0 軟件中的Clustal-W 程序進(jìn)行比對分析，然后采用鄰近法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹，使用1 000 次自導(dǎo)復(fù)制驗證可信度［15-16］。使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列同源性比對分析［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病煙葉的癥狀分析

采集重慶涪陵（11 份）和巫溪（6 份）兩個煙區(qū)與北碚試驗田（1份）共18份發(fā)病煙葉樣品。樣品均表現(xiàn)出不同程度的花葉、黃化、皺縮和枯斑等癥狀。其中涪陵地區(qū)煙葉枯斑較多，巫溪地區(qū)發(fā)病煙葉有較多閃電斑點，北碚地區(qū)發(fā)病煙葉有較多黃色斑點狀病斑（圖1）。根據(jù)煙葉發(fā)病癥狀，推測巫溪地區(qū)煙葉樣品中可能含有PVY，且樣品中可能存在多種病毒復(fù)合侵染的情況。

圖1 病毒侵染煙葉樣品的癥狀表現(xiàn)Fig.1 Symptoms of tobacco samples infected by viruses

2.2 感病煙葉的RT-PCR分析

利用包括TMV CP、CMV CP、PVX CP、TSWV CP 和ChiVMV CP 在內(nèi)的多個病毒特異性引物，對重慶涪陵、巫溪2個煙區(qū)及北碚煙草試驗田發(fā)病煙葉樣品的總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并檢測涪陵、巫溪2個煙區(qū)及北碚煙草試驗田發(fā)病煙葉的病毒種類，結(jié)果見表2。涪陵煙區(qū)煙葉擴(kuò)增出TMV CP 和ChiVMV CP，沒有擴(kuò)增出 CMV CP、PVY CP 和TSWV CP。巫溪煙區(qū)煙葉中擴(kuò)增出TMV CP 和PVY CP，沒 有 擴(kuò) 增 到 CMV CP、TSWV CP 和ChiVMV CP，見圖2。北碚煙草試驗田發(fā)病煙葉中擴(kuò)增出ChiVMV CP，未檢出其他病毒。在18份樣品中，檢測到ChiVMV、TMV、PVY 3種病毒，總檢出率分別為66.67%、66.67%和22.22%。涪陵煙區(qū)煙葉樣品中檢測出ChiVMV和TMV，檢出率分別為100%和54.55%；巫溪煙區(qū)煙葉樣品中檢測出TMV 和PVY，檢出率分別為100%和66.67%；北碚煙草試驗田病葉樣品中檢測出ChiVMV，檢出率為100%。因此，重慶巫溪地區(qū)煙葉主要受TMV和PVY侵染，而涪陵地區(qū)煙葉主要受TMV和ChiVMV侵染。此次兩個煙區(qū)煙葉樣品中病毒檢測結(jié)果有所不同。涪陵煙區(qū)的11份煙葉樣品中均檢測出ChiVMV，其中有6份煙葉樣品中還檢測出TMV，形成“ChiVMV+ TMV”的復(fù)合侵染類型，復(fù)合侵染率為54.55%。ChiVMV的檢出率明顯高于TMV，可以推測在涪陵煙區(qū)ChiVMV 的侵染力強(qiáng)于TMV。巫溪煙區(qū)的6份煙葉樣品中均檢測出TMV，其中有4 份煙葉樣品中還檢測出PVY，形成“TMV+PVY”的復(fù)合侵染類型，復(fù)合侵染率為66.67%（表2）?？梢奣MV 的檢出率明顯高于PVY 的檢出率，推測在涪陵煙區(qū)TMV的侵染力強(qiáng)于PVY。

圖2 5種病毒CP RT-PCR擴(kuò)增的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram for detection of CP of 5 viruses amplified by RT-PCR

表2 煙草樣品的病毒侵染類型和檢出率Tab.2 Types and detection rates of viruses in tobacco samples

2.3 ChiVMV進(jìn)化關(guān)系分析

將獲得的ChiVMV CP 分離物上傳至NCBI，利用Blast 對其CP 序列進(jìn)行序列分析，將比對出的GenBank 中 12 個 ChiVMV CP 分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化分析結(jié)果（圖3）顯示，ChiVMV CP 重慶煙草分離物與其中4分離物形成1個分支，其他8個分離物共同形成另1個分支。重慶涪陵煙草分離物與中國瀘州煙草（GenBank 登錄號MK405594）親緣關(guān)系最近，同源性為99.11%（表3）。將上述分離物進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)各CP分離物的N端變異程度較低，C端變異程度高于N端（圖4）。

圖4 ChiVMV CP分離物的基因序列比對Fig.4 Gene sequence alignment of ChiVMV CP isolates

表3 基于ChiVMVCP分離物的基因序列相似性比較Tab.3 Sequence similarity of CP gene based on ChiVMV isolates

圖3 基于ChiVMV CP分離物的基因序列進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ChiVMV CP isolates

3 結(jié)論

①從重慶涪陵煙區(qū)煙葉樣品中檢測出ChiVMV和TMV，檢出率分別為100%和54.55%；重慶巫溪煙區(qū)煙葉樣品中檢測出TMV 和PVY，檢出率分別為100%和66.67%；重慶北碚煙草試驗田病葉樣品中檢測出ChiVMV，檢出率為100%。②在重慶涪陵、北碚地區(qū)煙葉樣品中首次檢測出ChiVMV。③重慶涪陵煙區(qū)煙葉樣品中檢測出的ChiVMV 的CP 序列與四川瀘州煙葉ChiVMV CP分離物親緣關(guān)系最近。