李沁，李海銘，陸信曜，宗紅，諸葛斌

(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122)

微生物基因組精簡是通過刪減非必需基因，簡化基因組組成，優(yōu)化生化代謝網(wǎng)絡(luò)，提高對底物和能量的利用效率，獲得更適用的宿主菌株[1-2]。微生物基因組簡化一般選用模式菌株，主要因其具有明晰的遺傳背景和成熟的遺傳學(xué)工具。近年來隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展和分子操作平臺的開發(fā)，非模式菌的基因組簡化和底盤化改造受到重視[3-4]。

微生物基因組的大片段刪除手段包括同源重組技術(shù)、CRISPR技術(shù)和轉(zhuǎn)座重組技術(shù)[5]。在釀酒酵母和粟酒裂殖酵母中，通過線性DNA片段同源重組已獲得了一系列基因組精簡菌株[6-8]。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的大片段刪除技術(shù)是利用成對sgRNA識別不同的靶位點，引導(dǎo)Cas9產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，進而刪除2個靶位點之間的序列[9]，可作為基因組刪減的工具。

產(chǎn)甘油假絲酵母(Candidaglycerinogenes)具有多重抗逆、可高溫濃醪發(fā)酵等優(yōu)點[10-11]，有成為強健工業(yè)生物宿主的潛質(zhì)。前期實驗室已完成全基因組測序和適合該菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建[12-13]?；谄涠喾N抗逆性，已成功改造應(yīng)用于2-苯乙醇[14]和纖維素乙醇等的合成[15-16]。為使產(chǎn)甘油假絲酵母底盤化，本研究以大片段刪除的方式對其基因組進行精簡，在獲得幾個不同缺失程度的突變株后，基于耐受能力和發(fā)酵特性進行表征分析，以期為非模式菌底盤化相關(guān)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究使用的菌株和質(zhì)粒參見表1。

表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

續(xù)表1

1.2 引物設(shè)計

本研究所用引物參見表2。

續(xù)表2

1.3 試劑與儀器

酵母膏、蛋白胨，Oxoid公司；實驗用各種限制性內(nèi)切酶、ExTaqDNA聚合酶，TaKaRa公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、柱回收試劑盒和酵母DNA提取試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；引物，上海亦欣生物科技有限公司。

P680高效液相色譜儀，美國戴安公司；ALS1296 PCR儀、PowerPac Basic瓊脂糖凝膠電泳儀、Aminex HPX-87H液相色譜柱，美國Bio-Rad公司；AlphaImager凝膠成像儀，Alpha Innotech公司。

1.4 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0。氨芐青霉素抗性平板需額外添加100 μg/mL氨芐青霉素。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0 g/L。

玉米漿種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100.0，尿素2.0，玉米漿8.0。

玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖300.0，尿素2.0，玉米漿8.0。

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)培養(yǎng)條件：挑取單菌落接種于10 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)，12 h后轉(zhuǎn)接50 mL YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始生物量控制為0.2，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵條件：挑取單菌落接種于50 mL玉米漿種子培養(yǎng)基，于往復(fù)式搖床32 ℃、110 r/min培養(yǎng)，19 h后轉(zhuǎn)接50 mL玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始生物量控制為0.5，于往復(fù)式搖床32 ℃、110 r/min培養(yǎng)。

1.5 pYM-sg的構(gòu)建

根據(jù)文獻[12]和[13]設(shè)計C.glycerinogenes敲除靶向目的片段兩端所用的sgRNA。具體來說，通過使用sgRNAcas9 V2.0.10信息學(xué)軟件比對基因組序列分析潛在靶點，來設(shè)計sgRNA引導(dǎo)序列，通過sg-F/R和6 bp-F/R進行反向擴增模板質(zhì)粒pMY-sgRNA，然后經(jīng)測序驗證成功獲得所需質(zhì)粒。

1.6 URA5回補片段的構(gòu)建

質(zhì)粒pMY-sgRNA上具有URA5基因表達框。

根據(jù)目的缺失片段設(shè)計帶有同源序列的引物Donor Le-F/R和Donor Ri-F/R，以C.glycerinogenesWT基因組為模板，經(jīng)PCR獲得URA5回補片段左側(cè)同源臂Donor Le和Donor Ri。將Donor Le與經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶XhoI線性化的pMY-sgRNA連接，這一步獲得的質(zhì)粒再經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶ClaI酶切線性化進一步與Donor Ri連接，即獲得含有目的片段同源區(qū)域的URA5回補片段。以Donor Le-F和Donor Ri- R為上下游引物、以構(gòu)建出的質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR可獲得相應(yīng)的URA5回補片段。

1.7 生物量測定

取1 mL發(fā)酵液適當(dāng)稀釋，使用分光光度計于600 nm下測定吸光值(OD600)。

1.8 發(fā)酵液中殘?zhí)?、甘油和乙醇含量測定

離心(10 000×g，10 min)收集發(fā)酵上清液，用微孔水系濾膜(0.22 μm)過濾，最后利用HPLC測定濃度。具體條件設(shè)置參照嵇豪[17]的方法。以甘油含量(g/L)與生物量(OD600)的比值作為單位菌體甘油產(chǎn)量。

1.9 實時熒光定量分析

挑取C.glycerinogenes單菌落于玉米漿種子培養(yǎng)基，32 ℃、往復(fù)式搖床110 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，19 h后轉(zhuǎn)接玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基，32 ℃、110 r/min培養(yǎng)24 h。總RNA提取參考JI等[18]的方法。RT-qPCR反應(yīng)體系與條件參見南京諾唯贊試劑盒說明書。引物序列見表1。相對轉(zhuǎn)錄水平的計算和分析參考LIVAK 等[19]的方法。

1.10 胞內(nèi)輔酶Ⅱ NADP(H)的測定

酵母細胞收集后用液氮淬滅，隨后使用輔酶Ⅱ檢測試劑盒對NADP(H)進行提取、測定，具體操作按蘇州科銘試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 成對sgRNA介導(dǎo)的大片段刪除菌株構(gòu)建

本研究將不含必需基因的長片段確定為敲除區(qū)域[20]。其中，7.8 kb長片段為2段互為回文序列9 537 bp IRL1(0～9 537 nt)和9 538 bp IRR2(22 173～31 711 nt)之間的非編碼區(qū)序列(經(jīng)NCBI BLAST后，未比對出基因，下同)(11 433～19 194 nt)(圖1-a)。50 kb片段組成為：一對基因組上的長重復(fù)區(qū)域9 537 bp IRL1(10 905～20 442 nt)和9 538 bp IRR2(33 078～50 093 bp)、一個含未知蛋白的10 905 bp DNA序列(1 650 bp假設(shè)蛋白C5L36_0A06700)、長重復(fù)序列間的非編碼區(qū)12 636 bp序列、另一個含未知蛋白的7 477 bp DNA序列(1 653 bp假設(shè)蛋白C5L36_0A06800)(圖1-b)。25 kb長片段是指含有非編碼區(qū)的1 296 bp DNA序列、一對長重復(fù)序列其中一支12.68 kb片段IRL2以及10 970 bp的非編碼區(qū)序列(圖1-c)。

a-7.8 kb長片段；b-50 kb片段；c-25 kb長片段圖1 本研究選擇的敲除區(qū)域示意Fig.1 Deletion areas selected in this study

以前期構(gòu)建的CRISPR/Cas9瞬時表達系統(tǒng)[12-13]為基礎(chǔ)，采用LiAc/SS carrier DNA/PEG的方法將敲除元件Cas9、若干成對的sgRNA和URA5回補片段轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株C.glycerinogenesURA5(圖2)。

圖2 成對sgRNA介導(dǎo)的大片段敲除示意圖Fig.2 Large fragment deletion guided by pairs of sgRNA

進行7.8 kb長片段敲除鑒定選用的引物如圖3-a所示，PCR驗證結(jié)果如圖3-b所示。經(jīng)類似過程，獲得25、50 kb片段的敲除菌(圖3)。

M-核酸分子標(biāo)準(zhǔn)；OUT-F/R-靶片段外部的PCR驗證引物；IN-F/R-靶片段內(nèi)部的PCR驗證引物；Le-F/R-靶片段上游的PCR驗證引物；Ri-F/R-靶片段下游的PCR驗證引物a-驗證缺失選用引物示意圖；b-核酸電泳驗證圖3 C.glycerinogenes片段缺失菌的構(gòu)建過程Fig.3 Construction of the genomic deletion C.glycerinogenes

2.2 缺失菌表型評價

表型分析發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)下Δ50 kb、Δ25 kb菌與野生菌的生物量相近，而Δ7.8 kb菌的最終生物量降低20%。42 ℃下，Δ50 kb菌的最終生物量相比對照無差異，Δ7.8 kb、Δ25 kb菌的生物量下降了20%左右(圖4-a)。Δ25 kb菌缺失了一段基因組上重復(fù)序列，真核生物基因組上的重復(fù)序列可能參與高溫脅迫下菌株的自我保護功能的發(fā)揮[21]，因而造成Δ25 kb菌的耐高溫性能減弱。在多種脅迫下，C.glycerinogenes的各缺失菌株仍持有耐受能力(圖4-b)，表明缺失的大片段DNA與上述脅迫下菌體抗逆能力無強關(guān)聯(lián)性。甘油發(fā)酵中(圖4-c)，12 h時Δ7.8 kb菌的生物量較野生菌高出14.0%。在72 h時相較野生菌，各缺失菌生物量均降低20.0%左右。缺失菌穩(wěn)定期生物量均低于對照，表明大片段缺失會導(dǎo)致最終生物量降低。發(fā)酵至108 h時，Δ7.8 kb菌殘?zhí)羌s為野生菌的62.5%，糖耗增加39.8 g/L，其他菌的殘?zhí)橇縿t遠高于對照菌，表明該7.8 kb片段缺失促進了糖耗。Δ7.8 kb菌甘油產(chǎn)量與野生菌相似，而單位菌體甘油產(chǎn)量達4.57，提高了22%，表明基因缺失促進了菌體的甘油合成能力。乙醇的合成是此發(fā)酵過程葡萄糖另一主要去向，野生菌和Δ7.8 kb菌乙醇產(chǎn)量分別為22.2和36.1 g/L，反映出Δ7.8 kb菌進入糖酵解途徑的碳流有所增大，從而表現(xiàn)為糖耗增加。

a-在30和42 ℃的YPD搖瓶生長曲線；b-在脅迫條件下進行點滴平板實驗；c-在高糖玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中進行甘油發(fā)酵能力測定圖4 缺失菌表型Fig.4 Characterization of genomic deletion strains

2.3 缺失菌表型差異分析

為了考察上述表型的變化與基因調(diào)控的潛在關(guān)系，以發(fā)酵初期生物量最大、單位菌體甘油產(chǎn)量最大的Δ7.8 kb菌為對象，考察葡萄糖代謝相關(guān)基因(HXT4、GLK1、PFK-α、PFK-β、PYK1)、高糖脅迫應(yīng)答相關(guān)基因(HOG1、RGT1、SKO1)、抗逆相關(guān)基因(OLE1、TPS1、FLO1)、甘油合成關(guān)鍵基因(GPD1)、還原力相關(guān)基因(G6PD、6PGDH)、競爭途徑乙醇合成關(guān)鍵基因(ALD1、ADH1)相對轉(zhuǎn)錄水平(圖5)。相比野生菌株，Δ7.8 kb菌的G6PD上調(diào)了10倍，6PGDH上調(diào)了29倍，而其他基因轉(zhuǎn)錄變化并不明顯，表明該菌的磷酸戊糖途徑更為活躍，主代謝途徑碳流可能受到了重新分配，使得菌株在發(fā)酵初期積累更高的生物量，同時能夠提供更多的還原力，強化了菌株的甘油合成能力。為明確Δ7.8 kb菌的磷酸戊糖途徑關(guān)鍵基因的過表達是否提高了該途徑的通量，本研究進一步分析了與該途徑密切相關(guān)的輔酶Ⅱ NADP(H)(表3)，胞內(nèi)NADPH水平明顯提高，且NADPH/NADP+比值提高了100%，反映磷酸戊糖途徑通量增加。C.glycerinogenes基因組片段的缺失可能對基因起到調(diào)控作用，改變了還原力水平，從而影響了生理特性。

圖5 C.glycerinogenesΔ7.8 kb缺失菌甘油發(fā)酵過程中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.5 Expression levels of genes related to glycerol ermentation in C.glycerinogenes Δ7.8 kb and WT

表3 野生型菌株與Δ7.8 kb菌胞內(nèi)NADP(H)含量Table 3 Contents of NADP(H) in C.glycerinogenes WT and Δ7.8 kb

3 結(jié)論

C.glycerinogenes具有優(yōu)良的抗逆性能和發(fā)酵性能，為了更好地適應(yīng)合成生物學(xué)改造的需要，對其進行基因組精簡化的底盤化策略。不同于以往僅應(yīng)用于靶點敲除，本研究發(fā)掘的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在C.glycerinogenes基因組上可以進行長達50 kb大片段敲除，為非模式菌底盤化提供可行思路。常規(guī)、高溫條件下的培養(yǎng)中，大片段缺失的菌株出現(xiàn)菌體量積累能力減弱。在高糖、高鹽、糠醛、乙醇的環(huán)境脅迫下，本研究中基因組不同程度缺失菌株的耐受性能仍然良好。甘油發(fā)酵中，缺失菌生物量均下降。而其中Δ7.8 kb菌則出現(xiàn)單位菌體甘油產(chǎn)量增加、糖耗加速，且磷酸戊糖途徑活躍，表明該基因組大片段的缺失可能造成了戊糖磷酸途徑和糖酵解途徑碳流的重新分配，從而促進了菌體甘油合成效率。本研究表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于C.glycerinogenes大片段缺失、進行基因組簡化研究，為后續(xù)非模式二倍體酵母的底盤化研究提供借鑒。后續(xù)對上述大片段基因組功能的研究能夠進一步幫助理解該菌的甘油代謝合成調(diào)控機制。