鄧永蓉，韓麗娟,2*，岳慶明，漆瑩，馬娜娜，趙玉欣

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016)2(省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(青海大學(xué))，青海 西寧，810016)

黃刺，學(xué)名直穗小檗(BerberidasystachyaM.)，是青藏高原特色的藥食同源漿果[1]。青海省是小檗屬植物的重要分布區(qū)，該植物資源量十分豐富[2]。黃刺果實(shí)具有多種活性成分，如植物甾醇、有機(jī)酸、多糖和多酚等[3]。迄今為止，市面上已有黃刺加工成的果汁、果粉及保健食品等[4]。多年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于小檗屬的研究大多集中在小檗堿上[5]，而目前研究發(fā)現(xiàn)黃刺多糖也是一種重要的活性物質(zhì)，具有良好的體外抗氧化活性[6]、降血糖活性[7]及調(diào)節(jié)腸道微生物等作用[3]。然而目前對(duì)于黃刺僅局限于粗多糖的提取和生物活性的初步研究，因此后續(xù)可從分子水平進(jìn)一步闡述多糖抗氧化、降血糖活性及其機(jī)制。

糖尿病是一種復(fù)雜的代謝紊亂疾病，嚴(yán)重危害人們身體健康[8]。多種天然植物多糖被證實(shí)具有降血糖的功效[9]，對(duì)于多糖降血糖分子機(jī)制的研究主要是從抑制胰島細(xì)胞凋亡、降低胰島素抵抗[10]、提高抗氧化應(yīng)激能力、調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路、調(diào)節(jié)腸道菌群[11-12]等方面發(fā)揮作用。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)過(guò)多的活性氧與抗氧化物質(zhì)同時(shí)存在的一種不平衡的狀態(tài)[13]。機(jī)體在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，體內(nèi)抗氧化酶類(lèi)活性逐漸降低，體內(nèi)生成過(guò)多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的凋亡[14]。H2O2作為一種化學(xué)誘導(dǎo)劑，是研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具[15]。楊艷等[16]利用250 μmol/L H2O2誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞18 h建立氧化應(yīng)激模型，MAHESHWARI等[17]通過(guò)H2O2體外誘導(dǎo)睪丸精細(xì)胞凋亡模型研究其作用途徑。

目前植物多糖提取方法較為成熟，其中超聲波輔助酶解法由于提取效率較高而常被采用，本實(shí)驗(yàn)采用纖維素酶輔助超聲波法對(duì)黃刺果實(shí)多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確立提取多糖的最佳工藝條件，以H2O2誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞建立氧化損傷模型，并使用不同濃度的黃刺粗多糖(Berberidasystachyapolysaccharides，BDPs)干預(yù)模型細(xì)胞，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率、ROS水平測(cè)定、抗氧化酶活及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量探究BDPs對(duì)H2O2誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，對(duì)研究黃刺多糖活性具有重要意義，也為黃刺多糖的抗氧化功能作用提供更加充分的依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

黃刺漿果，2021年8月采集于青海省大通縣；RIN-m5F細(xì)胞(大鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞)，賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；胰蛋白酶細(xì)胞消化液、D-PBS、細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)(CCK-8)，上海生工生物工程股份有限公司；RPMI—1640培養(yǎng)基，上海逍鵬生物科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，浙江天杭生物科技股份有限公司；活性氧檢測(cè)試劑盒、丙二醛檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，南京建成生物工程研究所；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶(酶活力>400 U/mg)，南京都萊生物技術(shù)有限公司；α-硫辛酸(α-lipoic acid，α-LA)，上海麥克林生化科技股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；KB-300E臺(tái)式機(jī)械超聲波清洗器，東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司；GS55-9冷凍干燥機(jī)，基因有限公司；Optilab T-rEX示差檢測(cè)器，美國(guó)懷雅特技術(shù)公司；Thermo ICS5000離子色譜系統(tǒng)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；UV-1780紫外分光光度計(jì)，島津有限公司；SU8220冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Cytation 5 MV熒光酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；BSC-1304IIA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；AE31E倒置生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；MLS-3751L-PC高壓蒸汽滅菌器，日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；H1850醫(yī)用離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；M200PRO酶標(biāo)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 黃刺果實(shí)多糖提取工藝流程

原料—烘干粉碎—石油醚除脂—脫色脫單糖—纖維素酶浸提—超聲波浸提—濃縮—醇沉—冷凍干燥

取黃刺鮮果于50 ℃的烘箱中徹底干燥后，粉碎過(guò)40目篩。將粉碎后的原料加入石油醚(料液比1∶5,g∶mL)，水浴加熱40 ℃脫脂2 h，經(jīng)抽濾后烘干，在85%乙醇中50 ℃條件下水浴2 h，過(guò)濾后干燥備用。經(jīng)過(guò)脫脂脫色的黃刺粉末按料液比15∶1(mL/g)加入蒸餾水，加入一定量纖維素酶，在45 ℃，pH=4.0條件下水浴酶解60 min，酶解結(jié)束于90 ℃滅酶10 min，140 W超聲波浸提60 min。收集浸提液，待冷卻后離心(4 500 r/min，10 min)，上清液用Sevage試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]除蛋白，離心后減壓濃縮至原體積的1/4。濃縮的多糖溶液裝入截留量為5 000 Da透析袋進(jìn)行透析48 h，加入濃縮液4倍體積無(wú)水乙醇靜置48 h，醇沉后冷凍干燥，得到BDPs，得率按公式(1)計(jì)算：

(1)

2.1.2 黃刺果實(shí)多糖提取單因素試驗(yàn)

2.1.2.1 加酶量

參考陳程等[18]的方法，固定酶解時(shí)間為60 min、酶解溫度45 ℃、超聲波功率140 W，考察不同加酶量0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%(以黃刺原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))對(duì)黃刺多糖提取率的影響。

2.1.2.2 酶解時(shí)間

固定加酶量1%、提取溫度45 ℃、超聲波功率140 W，考察不同酶解時(shí)間(20、40、60、80、100 min)對(duì)黃刺多糖提取率的影響。

2.1.2.3 酶解溫度

固定加酶量1%、酶解時(shí)間60 min、超聲波功率140 W，考察不同酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)對(duì)黃刺多糖提取率的影響。

2.1.2.4 超聲波功率

固定加酶量1%、酶解時(shí)間60 min、提取溫度45 ℃，考察不同超聲波功率(100、120、140、160、180 W)對(duì)黃刺多糖提取率的影響。

2.1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮得率、誤差等因素，選擇加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和超聲波功率為影響因素，以黃刺多糖得率為衡量指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素及水平編碼見(jiàn)表1。

表1 黃刺果實(shí)多糖提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素及水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface method for BDP extraction optimization

2.2 黃刺多糖理化性質(zhì)分析

2.2.1 多糖含量

多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[19]，根據(jù)回歸方程y=9.703 3x+0.136 6計(jì)算。

2.2.2 分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效體積排阻色譜(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)測(cè)定BDPs的分子質(zhì)量[20]。

樣品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：精密稱(chēng)取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，樣品用0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)LiBr-DMSO溶液配制終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，并通過(guò)0.45 μm的過(guò)濾器過(guò)濾，樣品轉(zhuǎn)置于進(jìn)樣小瓶中。

色譜條件：凝膠色譜-示差-多角度激光光散射系統(tǒng)；色譜柱為凝膠排阻色譜柱Ohpak SB-805 HQ(300 mm×8 mm)，Ohpak SB-804 HQ(300 mm×8 mm)，Ohpak SB-803 HQ(300 mm×8 mm)；流動(dòng)相為0.5% LiBr-DMSO溶液；流速0.3 mL/min，柱溫45 ℃；進(jìn)樣量100 μL；示差檢測(cè)器Optilab T-rEX。

2.2.3 單糖組成

根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法，精確稱(chēng)量多糖樣品5 mg于色譜瓶中，加入1 mL三氟乙酸(2 mol/L)溶液，121 ℃加熱2 h使其充分水解。冷卻后通N2吹干，加入甲醇清洗再吹干，重復(fù)2～3次。加入無(wú)菌水溶解，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測(cè)。采用Thermo ICS5000離子色譜系統(tǒng)分析樣品的單糖組成。測(cè)定條件如下：DionexTMCarboPacTMPA20液相色譜柱(150 mm×3.0 mm，10 μm)；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A為0.1 mol/L NaOH，流動(dòng)相B為0.1 mol/L NaOH，0.2 mol/L NaAc；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；洗脫方式為等梯度洗脫。

2.2.4 剛果紅實(shí)驗(yàn)

取0.5 mL BDPs溶液(2.5 mg/mL)，與1.5 mL剛果紅溶液(2.0 mmol/L)混合，加入1 mol/L NaOH溶液混合至NaOH濃度為0～0.5 mol/L，室溫放置30 min，采用紫外分光光度計(jì)在400～600 nm范圍內(nèi)掃描[22]。

2.2.5 微觀結(jié)構(gòu)觀察

取大小厚度合適的BDPs樣品于樣品臺(tái)，鍍金處理后，通過(guò)掃描電鏡觀察分析[22]。

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.3.1 RIN-m5F細(xì)胞培養(yǎng)

RIN-m5F細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于PRMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素混合液)，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，用0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)、凍存及后續(xù)實(shí)驗(yàn)[23]。

2.3.2 RIN-m5F細(xì)胞活力測(cè)定

采用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)，以1×105cells/mL的密度將細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后至細(xì)胞貼壁。棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL CCK-8溶液[V(CCK-8試劑)∶V(無(wú)血清培養(yǎng))=1∶10]，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于恒溫培養(yǎng)箱孵育0.5 h后在450 nm處測(cè)定吸光值[24]。細(xì)胞存活率按照公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A1，實(shí)驗(yàn)組的吸光值；A2，空白組的吸光值；A3，正常對(duì)照組的吸光值。

2.3.3 ROS水平測(cè)定

2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行ROS水平檢測(cè)[25]，以1×105cells/ mL的密度接種至96孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，取各處理組細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次后，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入100 μL含有DCFH-DA(10 μmol/L)的無(wú)血清培養(yǎng)液，避光37 ℃孵育1 h，使用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀上機(jī)檢測(cè)，其中激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

2.3.4 BDPs對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RIN-m5F細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

2.3.4.1 BDPs濃度選擇

以1×105cells/mL的密度將細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后至細(xì)胞貼壁。加入不同質(zhì)量濃度BDPs(0.0625、0.125、0.25、0.50、1、2 mg/mL)分別培養(yǎng)24、48、72 h，CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)確定BDPs的最佳濃度范圍。

2.3.4.2 細(xì)胞分組及處理

正常對(duì)照組(NC)：含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照組(PC)：300 μmol/L α-LA；模型組(MC)：250 μmol/L H2O2；BDPs組：BDPs低劑量組(0.062 5 mg/mL)，BDPs中劑量組(0.125 mg/mL)，BDPs高劑量組(0.25 mg/mL)。

按照細(xì)胞分組，經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)選擇250 μmol/L H2O2誘導(dǎo)3 h后，加入不同濃度BDPs(0.062 5、0.125、0.25 mg/mL)進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)空白組和模型組加入新的完全培養(yǎng)基同條件培養(yǎng)，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量及生長(zhǎng)狀態(tài)。將生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞按照密度為1×105cells/孔接種于六孔板，待細(xì)胞貼壁后用于實(shí)驗(yàn)。按照2.3.4.2實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，鏡下觀察并留取圖像。

2.3.6 SOD、CAT的活性及MDA含量的檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[26]的方法，細(xì)胞分組及處理方式同2.3.4.2，處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌后離心，加入提取液勻漿后電動(dòng)研磨破碎細(xì)胞，每次10 s，間隔10 s，共8次。參照SOD、CAT、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析，利用Origin Pro 2019軟件作圖。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1-a可知，黃刺果實(shí)多糖得率隨著加酶量增加先升高后降低，加酶量1.25%時(shí)黃刺多糖提取得率最高。當(dāng)加酶量超過(guò)1.25%后，多糖得率開(kāi)始降低。這可能是由于隨著酶量的增加，促使了黃刺果實(shí)細(xì)胞壁的破裂，使多糖易于溶出；當(dāng)加酶量過(guò)多時(shí)，造成黃刺果實(shí)被過(guò)量纖維素酶包裹，阻止多糖的溶出，從而降低多糖提取率[27]。因此，最佳用酶量確定為1.25%。

由圖1-b可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)提取率迅速上升，當(dāng)酶解時(shí)間60 min時(shí)，黃刺多糖的提取率達(dá)到最高，提取時(shí)間超過(guò)60 min后，可能是時(shí)間過(guò)度延長(zhǎng)使多糖結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞，使得多糖提取率下降[28]。因此，最佳酶解時(shí)間確定為60 min。

由圖1-c可知，在酶解溫度為35～45 ℃時(shí)，多糖提取率逐漸升高，但45 ℃之后提取率開(kāi)始下降，酶解溫度為45 ℃時(shí)，多糖提取率最高。這可能是隨著酶解溫度的提高反應(yīng)物能量增加，纖維素酶的活性增強(qiáng)加速多糖的溶出；但是當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃后纖維素酶活性降低，酶促反應(yīng)受到明顯抑制而影響多糖的溶出[29]。因此，最佳酶解溫度確定為45 ℃。

a-加酶量：b-酶解時(shí)間；c-酶解溫度；d-超聲波功率圖1 提取條件對(duì)黃刺多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction conditions on the yield of Berberis dasystachya polysaccharides

由圖1-d可知，黃刺多糖提取率隨著超聲波功率的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲波功率為160 W時(shí)，多糖提取率最高。這可能是當(dāng)超聲波功率較低時(shí)產(chǎn)生的機(jī)械作用較弱，對(duì)多糖提取效果不明顯；而隨著超聲波功率的增大，超聲波的空化作用增強(qiáng)，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了多糖的溶出；當(dāng)超聲波功率過(guò)大時(shí)，溶出的多糖糖苷鍵被打破，致使多糖結(jié)構(gòu)破壞，從而影響多糖提取率[30]。因此，最佳超聲波功率確定為160 W。

3.2 響應(yīng)面分析及黃刺果實(shí)多糖提取工藝的優(yōu)化

以加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、超聲波功率4個(gè)因素為自變量，多糖的提取得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)黃刺果實(shí)多糖得率結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，并用二階多項(xiàng)式方程如公式(3)表示：

(3)

由回歸方程的方差分析及顯著性分析(表3)可知，回歸模型P<0.000 1，說(shuō)明黃刺多糖得率得回歸模型極顯著，能夠比較好地反映考察的因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系；同時(shí)該模型R2為0.999 0，調(diào)整R2為0.997 9，表明該模型誤差較小，與實(shí)際結(jié)果有較高的擬合度。由F值可知各因素對(duì)黃刺多糖得率的影響大小為：酶解時(shí)間(X2)>超聲波功率(X4)>加酶量(X1)>酶解溫度(X3)，且模型中X1X2、X1X3、X1X4和X2X4的交互作用均為極顯著(P<0.01)，X3X4交互作用不顯著。

經(jīng)預(yù)測(cè)分析得到黃刺果實(shí)多糖提取的最佳提取條件：加酶量1.25%、酶解時(shí)間56.95 min、酶解溫度44.96 ℃、超聲波功率163.82 W，在此條件下，黃刺果實(shí)多糖的最大得率預(yù)測(cè)值為3.451%。結(jié)合實(shí)際操作將最佳工藝調(diào)整為：加酶量1.25%、酶解時(shí)間57 min、酶解溫度45 ℃、超聲波功率164 W。根據(jù)上述試驗(yàn)條件進(jìn)行3次水平實(shí)驗(yàn)，所得平均提取得率為(3.478±0.075)%，與理論值的相對(duì)誤差為0.782%，說(shuō)明回歸模型可以真實(shí)地反映各因素對(duì)黃刺多糖提取得率的影響。前期研究超聲波輔助水提的多糖得率為1.3%[3]，而本研究中多糖得率為(3.478±0.075)%，多糖提取效率顯著提高，經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)得多糖含量為(75.26±0.70)%。因此超聲波輔助酶解法可作為黃刺多糖提取的有效方法。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for respond surface analysis

表3 回歸模型中回歸系數(shù)方差分析Table 3 ANOVA of response surface model

續(xù)表3

3.3 BDPs理化性質(zhì)分析

3.3.1 分子質(zhì)量測(cè)定

凝膠色譜可以將溶劑中的分子按照重量或尺寸大小依次洗脫從而達(dá)到分離的目的，進(jìn)而利用示差檢測(cè)器根據(jù)其折光強(qiáng)度可檢測(cè)樣品的濃度信息，通過(guò)多角度激光散射儀檢測(cè)大分子的光散射信息，再根據(jù)馬克·霍溫克方程計(jì)算出每個(gè)組分對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量[31]。利用軟件ASTRA 6.1處理色譜數(shù)據(jù)，以檢測(cè)的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，以摩爾質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制樣品的絕對(duì)分子質(zhì)量HPSEC圖譜，如圖2所示。

圖2 BDPs的HPGPC圖譜Fig.2 HPSEC chromatogram of BDPs

示差信號(hào)圖譜分布對(duì)稱(chēng)，說(shuō)明分子質(zhì)量分布相對(duì)均一，在80.8 min時(shí)出現(xiàn)信號(hào)尖峰，光散射信號(hào)在75.9 min處出現(xiàn)信號(hào)尖峰?；诠馍⑸湫盘?hào)和示差信號(hào)計(jì)算所得分子質(zhì)量在72～79 min之間呈直線關(guān)系，說(shuō)明該段的多糖分子構(gòu)型特征一致，80～85 min內(nèi)呈不規(guī)則波動(dòng)現(xiàn)象，可能是信號(hào)變?nèi)跻鸬姆肿淤|(zhì)量波動(dòng)。BDPs的重均分子質(zhì)量為10.2 kDa，均方根半徑為15.3 nm，多分散系數(shù)為1.279，接近于1，說(shuō)明分子質(zhì)量分布均一且均在可接受范圍。

3.3.2 單糖組成

BDPs及單糖標(biāo)準(zhǔn)品的離子色譜圖如圖3所示，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，BDPs中含有巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸，摩爾比為1∶42.2∶32.6∶ 11.8∶4.4∶56.1∶5.1∶1.8，表明BDPs是一種雜多糖，甘露糖是其主要單糖組分。

a-巖藻糖；b-阿拉伯糖；c-鼠李糖；d-半乳糖；e-葡萄糖；f-木糖；g-甘露糖；h-果糖；i-核糖；j-半乳糖醛酸；k-古羅糖醛酸；l-葡萄糖醛酸：m-甘露糖醛酸圖3 標(biāo)準(zhǔn)品及BDPs的離子色譜圖Fig.3 Chromatogram profiles of monosaccharide composition of BDPs and standards

3.3.3 剛果紅實(shí)驗(yàn)

具有三螺旋構(gòu)象的多糖在NaOH溶液中與剛果紅形成絡(luò)合物，最大波長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，隨著NaOH溶液濃度逐漸增高，多糖螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解體，變成無(wú)規(guī)則的線團(tuán)形式，最大吸收波長(zhǎng)又會(huì)發(fā)生藍(lán)移[32]。由圖4可以看出，與單一剛果紅溶液相比，BDPs的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，說(shuō)明BDPs存在三螺旋結(jié)構(gòu)。隨著NaOH濃度的增大，黃刺多糖與剛果紅試劑作用產(chǎn)生絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)均呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢(shì)，造成這種結(jié)果的原因可能是黃刺多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子質(zhì)量大，在水溶液中呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象，堿性溶液使多糖的氫鍵不斷斷裂[22]。

圖4 BDPs與剛果紅混合堿溶液的最大吸收波長(zhǎng)變化Fig.4 Changes in absorption wavelength maximum of mixture of Congo red and BDPs

3.3.4 微觀結(jié)構(gòu)觀察

如圖5所示，BDPs呈顆粒狀，表面呈不規(guī)則褶皺，比較粗糙且孔洞多。而這與纖維素酶協(xié)同超聲波提取北沙參多糖的形態(tài)結(jié)果一致，可能是由于酶解和超聲波的協(xié)同作用下使多糖降解成小分子碎片堆疊[27]。

a-500×；b-2 500×；c-5 000×圖5 BDPs掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrographs of BDPs

3.4 不同濃度BDPs對(duì)細(xì)胞存活率的影響

如圖6所示，BDPs質(zhì)量濃度在0.062 5～0.25 mg/mL作用24～72 h對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響。BDPs作用細(xì)胞24 h后，質(zhì)量濃度在0.062 5～0.25 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率是逐漸升高的，0.5 mg/mL之后開(kāi)始下降；BDPs作用48 h后，在BDPs質(zhì)量濃度0.062 5～0.25 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率是逐漸升高的，高于0.25 mg/mL時(shí)開(kāi)始逐漸下降；BDPs作用72 h后，在BDPs濃度0.062 5～0.125 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸升高，高于0.125 mg/mL時(shí)開(kāi)始下降，并且和對(duì)照組相比，在濃度為2 mg/mL時(shí)顯著降低(P<0.05)。因此，0.062 5～0.5 mg/mL為細(xì)胞的安全質(zhì)量濃度范圍，所以最終選擇24 h作為后續(xù)BDPs的作用時(shí)間，質(zhì)量濃度范圍選取在0.062 5～0.5 mg/mL。

a-24 h；b-48 h；c-72 h圖6 不同質(zhì)量濃度BDPs對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.6 Effects of different concentrations of BDPs on the survival rate of RIN-m5F cells注：*P<0.05表示與正常對(duì)照組比較差異顯著

3.5 BDPs對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RIN-m5F細(xì)胞的保護(hù)作用

胰島β細(xì)胞易受ROS損傷而凋亡，引發(fā)糖尿病[33]。大量研究采用H2O2建立細(xì)胞氧化損傷模型，誘導(dǎo)β細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷。如圖7所示，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇250 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞，誘導(dǎo)3 h后細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)；使用質(zhì)量濃度為0.062 5～0.5 mg/mL的BDPs干預(yù)細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但與模型組相比細(xì)胞存活率呈現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，故0.062 5～0.5 mg/mL的BDPs能夠提高H2O2氧化損傷的細(xì)胞存活率，對(duì)氧化損傷的細(xì)胞有一定保護(hù)作用。

圖7 BDPs對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RIN-m5F細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.7 Protective effect of BDPs on H2O2-induced of RIN-m5F cells注：*表示與模型組作相比差異顯著(P<0.05)；#表示與正常對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，圖9同

3.6 BDPs對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖8所示，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的RIN-m5F細(xì)胞，呈聚集圓球狀或梭狀，經(jīng)250 μmol/L H2O2刺激后細(xì)胞發(fā)生皺縮、細(xì)胞密度降低，且邊緣模糊；再經(jīng)過(guò)BDPs干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)慢慢恢復(fù)，并且密度增加，BDPs低劑量組(0.0625 mg/mL)干預(yù)H2O2刺激的細(xì)胞后細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞邊界逐漸變圓滑。

a-正常對(duì)照組；b-陽(yáng)性對(duì)照組；c-模型組；d-BDPS-低劑量組；e-BDPS-中劑量組；f-BDPS-高劑量組圖8 不同濃度BDPs對(duì)RIN-m5F細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.8 Effect of different concentrations of BDPs on RIN-m5F cells morphology

3.7 ROS水平測(cè)定

如圖9所示，250 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞后，增加了細(xì)胞內(nèi)ROS積累，ROS水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；經(jīng)過(guò)0.062 5～0.25 mg/mL的BDPs干預(yù)24 h后，細(xì)胞ROS水平與模型組相比有顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05)，說(shuō)明H2O2誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞ROS水平升高，不同劑量的BDPs可以降低H2O2損傷后RIN-m5F細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激。

圖9 不同濃度BDPs對(duì)RIN-m5F細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.9 Effect of different concentrations of BDPs on ROS level of RIN-m5F cells

3.8 SOD、CAT的活性及 MDA 含量的檢測(cè)

BDPs對(duì)RIN-m5F細(xì)胞中SOD、CAT的活性及MDA含量測(cè)定結(jié)果如圖10所示。由圖10-a和圖10-b可知，H2O2處理后細(xì)胞SOD、CAT的活性與對(duì)照組相比有顯著降低(P<0.05)，經(jīng)過(guò)BDPs干預(yù)后，抗氧化酶活性逐漸升高且呈一定的劑量依賴(lài)性，在0.25 mg/mL時(shí)BDPs的SOD活性達(dá)到(69.67±3.26)U/mg，CAT活性達(dá)到(11.12±0.57)U/mg。

a-SOD；b-CAT；c-MDA圖10 BDPs對(duì)RIN-m5F細(xì)胞SOD、CAT和MDA含量的影響Fig.10 Effect of BDPs on SOD,CAT and MDA in H2O2-induced RIN-m5F cells

由圖10-c所示，H2O2誘導(dǎo)可以提升細(xì)胞中MDA含量(P<0.05)，BDPs干預(yù)后細(xì)胞中MDA含量均有所降低，BDPs高劑量組(0.25 mg/mL)MDA含量為(9.22±0.17)mmol/mg，可見(jiàn)BDPs能夠抑制MDA的釋放，保護(hù)氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞。

4 結(jié)論與討論

前期研究發(fā)現(xiàn)黃刺果實(shí)中有大量活性多糖成分，但對(duì)于黃刺多糖的提取及生物活性研究較少。與傳統(tǒng)的水提法相比，超聲波輔助酶法提取多糖損失更小且得率更高[22]，因此本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲波功率各因素對(duì)黃刺多糖提取率的影響，利用響應(yīng)面優(yōu)化黃刺果實(shí)多糖提取工藝，得到最佳提取工藝條件為：加酶量1.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，酶解時(shí)間57 min，酶解溫度45 ℃，超聲波功率164 W，黃刺果實(shí)多糖平均提取得率為(3.478±0.075)%，與預(yù)測(cè)值3.451%相近。結(jié)構(gòu)解析是多糖研究中的難點(diǎn)，本文通過(guò)測(cè)定分子質(zhì)量、單糖組成、掃描電鏡及剛果紅實(shí)驗(yàn)初步表征BDPs結(jié)構(gòu)，表明BDPs重均分子質(zhì)量平均為10.2 kDa，主要由巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸組成，摩爾比為1∶42.2∶32.6∶11.8∶4.4∶56.1∶5.1∶1.8，說(shuō)明BDPs是一種雜多糖，具有三螺旋結(jié)構(gòu)，后續(xù)可進(jìn)一步分離純化，結(jié)合特定降解方法獲得結(jié)構(gòu)片段，采用甲基化、核磁共振等手段表征其精細(xì)多糖結(jié)構(gòu)，可能存在的構(gòu)效關(guān)系也值得進(jìn)一步探討。

氧化損傷是引起糖尿病的危險(xiǎn)因素之一，因此抗氧化治療是一個(gè)可以防治糖尿病的很重要的途徑[34]。長(zhǎng)期暴露于高水平H2O2中的胰島β細(xì)胞會(huì)發(fā)生氧化損傷，H2O2誘導(dǎo)后氧化損傷的RIN-m5F細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，抗氧化酶活性降低[35]，這與本文研究結(jié)果一致。研究表明，天然產(chǎn)物多糖能有效對(duì)抗機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，具有良好的抗氧化作用[36]。樹(shù)莓多糖能夠降低Ⅰ型糖尿病大鼠胰腺和血清中SOD、GSH-Px的活性，降低MDA的含量，一定程度改善鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)對(duì)胰島β細(xì)胞造成的損傷[37]。靈芝多糖能夠有效提高STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清中胰島素水平，降低血糖和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量[38]。枸杞多糖能夠控制Ⅱ型糖尿病大鼠血糖水平，同時(shí)能顯著提高SOD活性，減少M(fèi)DA含量[39]。這與本文得出的BDPs能夠提高H2O2損傷的胰島細(xì)胞抗氧化酶活性，降低ROS水平及MDA含量從而緩解氧化應(yīng)激的結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在胰島β細(xì)胞的凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[40]，ROS過(guò)多積累可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)(如Bcl-2蛋白家族)或者通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)β細(xì)胞損傷[41]，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明BDPs對(duì)H2O2誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，但其具體抗凋亡機(jī)制還未明確，未來(lái)研究中可進(jìn)一步討論BDPs是否通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)及調(diào)控NF-κB通路等途徑保護(hù)胰島β細(xì)胞凋亡，以期為黃刺多糖在醫(yī)藥或功能性食品中的應(yīng)用提供支持。綜上所述，BDPs可以提高氧化損傷細(xì)胞的抗氧化酶活性，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷，這為青藏高原特色資源活性成分治療糖尿病提供了新的思路。