馬佳鎂,鐘植文,范悅軒,黃春媛,鄭佳馨,曹芳芳,王金泉,劉光亮,4,曹宗喜

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2．海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室/國家動物疫病數(shù)據(jù)中心?？谟^測實驗點,?？?571100; 3．廣東永順生物制藥股份有限公司,廣州 511536;4．海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所海南省院士團隊創(chuàng)新中心,?？?571100)

0 引 言

【研究意義】 豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是引起各年齡段豬的不同程度的呼吸道病癥及妊娠母豬的繁殖障礙等臨床特征的高死亡率疾病。而隨著重組毒株的流行,使得PRRS更難以防控,市場上的疫苗仍不能完全控制PRRSV 的入侵。采集海南省PRRSV臨床樣本選取典型的毒株通過分析ORF5判斷市場流行毒株,分析海南流行毒株的特性,對PRRSV的防控和疫苗的選擇有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】PRRS自20世紀80年代末在歐洲和美國出現(xiàn)[1],1995年中國報道出現(xiàn)了豬繁殖與呼吸綜合征[2],由于PRRSV在宿主體內(nèi)作用時不斷的進化,因此PRRSV變異株與以前的分離株相比有著更強的毒力,2006年高致病性毒株的暴發(fā)以及2012年NADC30樣毒株流行[3]。盡管PRRSV基因型不同,但臨床表現(xiàn)一致[4]。PRRSV屬套式病毒目,動脈炎病毒科,與馬動脈炎病毒(Equine arteritis virus, EVA)、鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV)和猴出血熱病毒(Simian hemmorrhagic fever vieus,SHFV)同屬動脈炎病毒屬[5]。 PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒[6]?；蚪M大小約為15.4 kb,5’和3’端分別有非編碼區(qū),包含至少10個開放閱讀框(ORF)[7]。ORF5編碼的GP5作為PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,不僅參與細胞免疫和體液免疫,也是病毒復(fù)制必不可少的因素之一[8],是分析PRRSV遺傳變異和分子流行病學(xué)的重要指標(biāo)。SHI MANG等[9]對8 624個PRRSVORF5的樣品進行序列對比,利用MrBayes v3.2中的BMCMC的方法將北美型PRRSV劃分9個譜系,構(gòu)建了PRRSV較為完整的分類系統(tǒng)。根據(jù)分類系統(tǒng), 將PRRSV-Ⅰ分為4個亞型(1-4亞型),將PRRSV-Ⅱ分為9個亞型。由于遺傳多樣性的不同,毒力和抗原性也出現(xiàn)較大的差異。目前我國PRRSV流行毒株仍以北美型為主,我國流行的PRRSV主要可分為4個譜系:1、3、5(5.1 亞系)和 8(8.7 亞系)。Liu等[10]將分離的病毒命名為FJLIUY-2017,與 GenBank中24株P(guān)RRSV的序列比對,使用SimPlot v3.5.1和RDP 4.80軟件進行重組分析,發(fā)現(xiàn)毒株為譜系1、3、5、8重組毒。我國PRRSV的流行情況較為復(fù)雜,出現(xiàn)不同譜系病毒重組現(xiàn)象?！颈狙芯壳腥朦c】目前,豬繁殖與呼吸綜合征仍被認為是豬最重要的病毒性疾病。我國海南在2007年有PRRSV相關(guān)報道,而近年尚未有數(shù)據(jù)。需研究海南新分離2株P(guān)RRSV毒株流行情況?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用PCR方法對ORF5基因進行擴增和序列測定,利用MegAlign軟件進行多重序列比對,利用MEGA X軟件鄰接法構(gòu)建進化樹,通過PRRS分子流行病學(xué)分析,為我國海南PRSSV的有效防控打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

PRRSV HNHK1-2021 株和PRRSV HNLG1-2021株從我國海南不同豬場分離而來,由海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室保存;RNAiso Plus(9 108Q)、dNTP Mixture(4 030Q)、Recombinant RNase Inhibitor(2 313Q)、Reverse Transcriptase M-MLV(2 641Q)、DL 2 000 DNA Marker(3 427A)、E.coliDH5α Competent Cells(9 057)、pMD18-T Vector(6 011)均購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA純化試劑盒(DC301-01)、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?DC201-01)均購自南京諾唯贊公司。

1.2 方 法

1.2.1 病毒RNA提取及ORF5基因RT-PCR擴增

采用RNAiso法對PRRSV HNHK1-2021株和HNLG1-2021株提取RNA。反轉(zhuǎn)錄體系:5×M-MLV緩沖液4 μL,dNTP 4 μL,RRI 0.5 μL,反轉(zhuǎn)錄引物1 μL,RNA提取液10 μL。42°水浴,1 h。PCR反應(yīng)體系:滅菌蒸餾水7 μL,2×ExTaq10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃ 3 min;94℃ 30 s,50℃ 1 min,72℃ 50 s,共 35 個循環(huán);72℃ 7 min。表1

表1 引物序列信息

1.2.2 目的基因的克隆與序列測定

PCR擴增的目的片段進行瓊脂糖凝膠電泳,用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段,膠回收產(chǎn)物連接pMD18-T Vector,16℃,30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞,用Amp抗性固體培養(yǎng)基溫箱37℃,16 h培養(yǎng)。挑取單個菌落進行菌液PCR驗證,陽性菌液送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.3ORF5基因的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育

利用GenBank中代表性的毒株,主要為北美型PRRSV,針對我國流行毒株選擇NADC30類PRRSV、QYYZ類 PRRSV、VR-2332 類 PRRSV、JXA1類PRRSV的ORF5片段,對 HNHK1-2021株和HNLG1-2021株的ORF5基因進行分析。采用MegAlign軟件進行多重序列比對,利用 MEGA X軟件1000 bootstrap值鄰接法構(gòu)建進化樹。表2

表2 PRRSV代表毒株信息

注:M:DL-2 000 DNA Marker;1:HNHK1-2021毒株ORF5;2.HNLG1-2021 毒株ORF5;3.陰性對照

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴增

研究表明,利用ORF5-R和ORF5-F引物擴增目的片段,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定得到兩株P(guān)RRSVORF5條帶大小約為603 bp,包含5’端ORF4基因和3’端ORF6基因的部分片段(128 bp),總擴增大小731 bp,與預(yù)期大小相符。圖1

2.2ORF5基因的遺傳多樣性

研究表明,采用MegAlign軟件對PRRSV HNHK1-2021和HNLG1-2021的ORF5序列比對,兩株毒之間核苷酸相似性為82.9%,氨基酸相似性分別為82.6%。2毒株同源性差異較大,不屬于同一譜系。PRRSV HNHK1-2021株與海南PRRSV株ORF5核苷酸相似性為81.5%～82.3%,氨基酸相似性為83.5%～84.1%。PRRSV HNLG1-2021株與海南PRRSV株ORF5核苷酸相似性為86.8%～86.9%,氨基酸相似性為88.0%～88.1%,新發(fā)現(xiàn)的2株毒和海南之前的毒株差異較大。表3

PRRSV HNHK1-2021和其他27株毒的ORF5序列比對,核苷酸相似性為80.8% ～ 92.0%,氨基酸相似性為80.1% ～ 94.5%。HNHK1-2021毒株和NADC30類PRRSV序列比對,核苷酸相似性分別為80.8% ～ 82.8%,氨基酸相似性分別為82.1% ～ 84.6%;和QYYZ類PRRSV序列比對,核苷酸相似性分別為90.2% ～ 92.0%,氨基酸相似性分別為91.5% ～ 94.5%;和VR-2332 類 PRRSV序列比對,核苷酸相似性分別為82.1% ～ 83.4%,氨基酸相似性分別為80.1% ～ 83.1%;和JXA1類 PRRSV序列比對,核苷酸相似性分別為81.9% ～ 84.4%,氨基酸相似性分別為82.6% ～ 84.6%。其中,與YJ1-10毒株核苷酸相似性最高92.0%,與譜系3代表毒株QYYZ的同源性為90.2%。和QYYZ毒株氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)有信號區(qū)Q13R突變,中和表位(PNE)與QYYZ株完全一致,跨膜區(qū)TM2和TM3中H102Y、F117L、I124V突變。

核苷酸相似性為81.8% ～ 99.5%,氨基酸相似性為81.1% ～ 98.5%。HNLG1-2021毒株和NADC30類PRRSV序列比對,核苷酸相似性分別為83.7% ～ 84.6%,氨基酸相似性分別為83.6% ～ 85.1%;和QYYZ類PRRSV序列比對,

核苷酸相似性分別為81.8% ～ 83.6%,氨基酸相似性分別為81.1% ～ 82.6%;和VR-2332 類 PRRSV序列比對,核苷酸相似性分別為97.7% ～ 99.5%,氨基酸相似性分別為96.0% ～ 98.5%;和JXA1類 PRRSV序列比對,核苷酸相似性分別為85.6%～90.4%,氨基酸相似性分別為86.1% ～ 90.5%。其中,與譜系5代表毒株VR-2332的核苷酸同源性高達99.5%。和VR-2332毒株序列相比盡管N30、N101位點突變,但不引起氨基酸改變。圖2

圖2 PRRSV ORF5氨基酸序列比對Fig.2 PRRSV ORF5 amino acid sequence alignment

2.3 進化關(guān)系

研究表明,GenBank上傳的中國海南PRRSV株均屬于譜系8(JXA1類PRRSV)。PRRSV HNHK1-2021株和HNLG1-2021株均屬于北美型。HNHK1-2021毒株和GZgy17毒株最為接近且同屬一個分支,屬于譜系3(QYYZ類 PRRSV); HNLG1-2021毒株和VR-2332毒株、HN1毒株最為接近,屬于譜系5(VR-2332類PRRSV)。圖3

注: 為本次分離得到的毒株, 為海南不同時期分離得到的毒株

3 討 論

3.1GP5 蛋白作為PRRSV主要囊膜蛋白和主要的免疫原性蛋白,對PRRSV感染有著重要作用,可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的中和抗體[11]。在體外可以誘導(dǎo)易感的Marc-145細胞和PAM細胞產(chǎn)生凋亡,在體內(nèi)也可誘導(dǎo)肺和淋巴組織的細胞產(chǎn)生凋亡[12]。由于GP5高變異性,因此利用GP5的差異性來研究遺傳變異性[13]。根據(jù)ORF5基因分型,PRRSV主要被分為歐洲型和北美型。北美型PRRSV分為9個不同的遺傳譜系(譜系1-9)。譜系1進一步劃分為9個亞系[14]。中國PRRSV最常見三大類病毒NADC30樣毒株、高致病性毒株、經(jīng)典株主要分布在譜系1、譜系3、譜系5、譜系8[15]。

PRRS病原體由分離得到,分離的菌株分別命名為CH-1a和BJ-4[16],但與經(jīng)典株相比,HP-PRRSV樣株和NADC30樣株顯示出較高的遺傳變異和重組發(fā)生率。文獻[17]發(fā)現(xiàn)抗HUN4-F112的高免疫血清不能中和譜系3的毒株,可能是由于GP5的高度變異引起的。

3.2基因組序列分析表明,PRRSV HNHK1-2021株與QYYZ、YJ1-10、GZgy17等譜系3的毒株的ORF5序列同源性均高于90.0%,與其他譜系毒株的ORF5序列同源性均在85%左右,與CH-1a經(jīng)典株的ORF5同源性為86.1%高于NADC30樣毒株和高致病性毒株。HNLG1-2021株與VR-2332株、PA8株、BJ-4株、HNⅠ株、LU534株、GS2003PA8株的ORF5序列同源性均高于97.5%,同譜系1、譜系3、譜系8的毒株ORF5相比較,HNLG1-2021株與譜系8毒株的ORF5核苷酸同源性更高,與CH-1a核苷酸同源性為91.5%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,HNHK1-2021與QYYZ株、GDZJ1株、GXBB130624株、YJ1-株、GZgy17株屬同一分支,位于譜系3。HNLG1-2021株與VR-2332株屬同一分支,位于譜系5。GP5 的殘基R13和R151與PRRSV毒力有關(guān)[18]。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)PRRSV HNHK1-2021株R151K突變,PRRSV HNLG1-2021株R13Q突變,這與NADC30樣毒株部分吻合。AA37-44 的初級中和表位 (PNE) 在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[19],2株毒的中和表位相對保守。GP5的四個潛在N-糖基化位點的N30、N34、N44和N51與病毒感染和抗原特征有關(guān)[20],PRRSV HNHK1-2021株N34S突變。N-糖基化位點的改變可能有利于突變病毒逃脫中和[21]。

4 結(jié) 論

從我國海南分離到的2株P(guān)RRSV毒株HNHK1-2021株和HNLG1-2021株,和GenBank上傳的海南株差異較大,PRRSV HNHK1-2021株屬于譜系3,和QYYZ重組毒株同源性相近;PRRSV HNLG1-2021株屬于譜系5,和VR-2332毒株同源性相近,PRRSV HNHK1-2021株的ORF5序列中堿基突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變,而PRRSV HKLG1-2021株的ORF5序列中堿基突變不影響氨基酸改變。