王 東,易海波,李宏博,秦 蕾,徐琦琦,吳慧敏,夏利寧

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.新疆昭蘇縣喀夏加爾鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,新疆昭蘇 835618)

0 引 言

【研究意義】腸球菌屬于人和動(dòng)物的正常腸道共棲菌,但是在特定的情況下也會(huì)引起諸如尿道感染、菌血癥、腦膜炎等重要感染,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡[1]。目前臨床腸球菌感染大部是由糞腸球菌和屎腸球菌引起的,占比達(dá)到85%～95%[2]。腸球菌屬于醫(yī)院感染的重要病原菌之一[3],腸球菌作為生豬體內(nèi)的常在菌,對(duì)當(dāng)?shù)刎i源糞腸球菌的進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè),可以預(yù)測(cè)當(dāng)?shù)啬退幥闆r,防止病原菌通過(guò)食物鏈傳播?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】腸球菌不僅對(duì)頭孢菌素類、磺胺類、低濃度的氨基糖苷類與林可胺類藥物存在固有耐藥[4],還能夠捕獲外源耐藥基因使自身獲得性耐藥[5],增加了臨床治療腸球菌感染的難度?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】腸球菌在耐藥性傳播的問(wèn)題上往往擔(dān)任著耐藥基因“儲(chǔ)存庫(kù)”的角色,不僅具有將自身攜帶的耐藥基因通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的方式傳遞其他細(xì)菌的能力[6],還能通過(guò)食物鏈在人和動(dòng)物之間傳播[7]。目前新疆關(guān)于糞腸球菌耐藥性及相關(guān)耐藥基因研究的報(bào)道較少。需進(jìn)行新疆阿克蘇地區(qū)豬源糞腸球菌耐藥性分析及相關(guān)耐藥基因的檢測(cè)?！緮M解決關(guān)鍵問(wèn)題】以阿克蘇地區(qū)三個(gè)豬場(chǎng)的豬源糞腸球菌為研究對(duì)象,分析阿克蘇地區(qū)豬源糞腸球菌的耐藥數(shù)據(jù),為養(yǎng)殖場(chǎng)制定合理用藥方案提供數(shù)據(jù)支撐,為該地區(qū)的耐藥性監(jiān)測(cè)提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來(lái)源

2018年11月在阿克蘇地區(qū)A、B、C三個(gè)豬場(chǎng)的豬只肛拭子采集樣本。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基

糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株(ATCC29212)、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株(ATCC29213)購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;腸球菌選擇培養(yǎng)基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂)、腦心浸肉湯(BHI)、MH肉湯(MHB)培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星有限公司。

1.1.3 藥 品

大環(huán)內(nèi)酯類:紅霉素、泰樂(lè)菌素;噁唑烷酮類:利奈唑胺;四環(huán)素類:四環(huán)素、多西環(huán)素;糖肽類:萬(wàn)古霉素;酰氨醇類:氟苯尼考;喹諾酮類:左氧氟沙星、恩諾沙星;氨基糖苷類:慶大霉素;截短側(cè)耳素類:沃尼妙林;以上藥物均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 腸球菌的分離鑒定

通過(guò)滅菌棉簽采集豬直腸糞樣后置于經(jīng)過(guò)滅菌的裝有1 mL MH肉湯的2 mL規(guī)格的EP管中,采集后的樣品置于4 ℃冰箱中保存,完全采集完畢后,通過(guò)將樣品置于含有低溫冰袋的泡沫箱后運(yùn)回。

將帶有滅菌肉湯的肛拭子置于恒溫?fù)u床中37 ℃,180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)增菌;接取5 μL菌液于含6.5% NaCl的BHI肉湯中置于恒溫?fù)u床中42 ℃,180 r/min,培養(yǎng)16～18 h,使用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液劃線涂布與腸球菌選擇培養(yǎng)基上,倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取平板上大小適中、白色圓滑凸起且菌落周圍顯示黑色的單菌落,初步鑒定為腸球菌,挑取單菌落至滅菌BHI培養(yǎng)基中,恒溫?fù)u床42 ℃,180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)保藏至-20 ℃冰箱備用。

使用水煮法[8]提取疑似菌株DNA模板,根據(jù)文獻(xiàn)[9]序列合成糞腸球菌持家基因引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用PCR的方法鑒定糞腸球菌,并將疑似菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S測(cè)序進(jìn)行鑒定。 表1

表1 腸球菌鑒定引物序列

1.2.2 藥物敏感性

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)發(fā)布的抗微生物抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)[10, 11],對(duì)分離的糞腸球菌進(jìn)行8大類12種藥物的最小抑菌濃度測(cè)定(MIC),采用糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212、測(cè)試菌株結(jié)果以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)表示。

1.2.3 相關(guān)耐藥基因測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[12, 13],合成相關(guān)耐藥基因引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,使用PCR方法檢測(cè)糞腸球菌的耐藥基因。表2

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,對(duì)藥敏結(jié)果以及多重耐藥結(jié)果使用卡方或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三個(gè)豬場(chǎng)豬源糞腸球菌分離情況

研究表明,從阿克蘇地區(qū)三個(gè)豬場(chǎng)共采集樣品624份,A、B、C三個(gè)豬場(chǎng)采集的樣品數(shù)依次為269份、234份、121份,共分離糞腸球菌160株,總體分離率為25.6%,A、B、C豬場(chǎng)分離糞腸球菌數(shù)依次為44株、81株、35株,其分離率依次為16.4%、34.6%、28.9%。表3

表2 相關(guān)耐藥基因引物序列

表3 阿克蘇地區(qū)三個(gè)豬場(chǎng)豬源糞腸球菌分離

2.2 阿克蘇地區(qū)三個(gè)豬場(chǎng)豬源腸球菌的耐藥變化

研究表明,B豬場(chǎng)對(duì)所檢12種藥物的耐藥菌株分離率顯著高于A和C豬場(chǎng)(P<0.05),A、C兩個(gè)豬場(chǎng)之間差異不顯著(P>0.05),三個(gè)豬場(chǎng)對(duì)紅霉素、泰樂(lè)菌素、四環(huán)素、多西環(huán)素、慶大霉素和沃尼妙林的耐藥率均達(dá)到90%以上,其中對(duì)利奈唑胺、氟苯尼考、左氧氟沙星及恩諾沙星的耐藥率分別為21.3%、30.6%、53.8%和57.5%。B豬場(chǎng)糞腸球菌分離株對(duì)這幾種藥物的耐藥率顯著高于A、C兩個(gè)豬場(chǎng)(P<0.05);A豬場(chǎng)糞腸球菌分離株對(duì)恩諾沙星及氟苯尼考的耐藥率顯著高于C豬場(chǎng)(P<0.05);其余藥物A、B、C豬場(chǎng)糞腸球菌分離株的耐藥率之間差異不顯著(P>0.05)。表4

2.3 阿克蘇地區(qū)3個(gè)豬場(chǎng)豬源糞腸球菌的多藥耐藥變化

研究表明,A豬場(chǎng)的耐藥譜型在4～9耐之間,以6耐和7耐為主,占比70.4%;B豬場(chǎng)的耐藥譜型在7～10耐,以8耐和10耐為主,占比為81.4%;C豬場(chǎng)的耐藥譜型在3～8耐,以6耐為主,占比為80.0%。B豬場(chǎng)在8、9以及10耐的菌株占比顯著高于其余兩個(gè)豬場(chǎng)(P<0.05);C豬場(chǎng)6耐菌株占比顯著高于A和B豬場(chǎng)(P<0.05)。三個(gè)豬場(chǎng)豬源糞腸球菌的耐藥嚴(yán)重程度依次為B豬場(chǎng)、A豬場(chǎng)、C豬場(chǎng)。表5

表4 阿克蘇地區(qū)三個(gè)豬場(chǎng)豬源腸球菌的耐藥變化

表5 阿克蘇地區(qū)3個(gè)豬場(chǎng)豬源糞腸球菌的多藥耐藥變化

2.4 豬源糞腸球菌耐藥基因檢出情況

研究表明,阿克蘇地區(qū)三個(gè)豬場(chǎng)的豬源糞腸球菌均檢出ermB、ermC、tet(K)、tet(L)、tet(M)、aac(6')/aph(2")、lsa(E)基因,其中ermB基因在A、B、C三個(gè)豬場(chǎng)的檢出率依次為90.9%(40/44)、100(81/81)、94.29%(33/35),ermC基因在A、B、C三個(gè)豬場(chǎng)的檢出率依次為70.5%(31/44)、51.9%(42/81)、80.0%(28/35),tet(K)基因在A、B、C三個(gè)豬場(chǎng)的檢出率依次為95.5%(42/44)、74.1%(60/81)、68.6%(24/35),tet(L)基因在A、B、C三個(gè)豬場(chǎng)的檢出率依次為97.7%(43/44)、86.4%(70/81)、77.1%(27/35),tet(M)基因在A、B、C三個(gè)豬場(chǎng)的檢出率均為100.0%,aac(6')/aph(2")基因在A、B、C三個(gè)豬場(chǎng)的檢出率依次為29.6%(13/44)、79.0%(64/81)、25.7%(9/35),lsa(E)基因在A、B、C三個(gè)豬場(chǎng)的檢出率依次為15.9%(7/44)、60.5%(49/81)、22.7%(8/35);ermA、fexA、optrA基因僅在A和B兩個(gè)豬場(chǎng)檢出,其中ermA在A、B兩個(gè)豬場(chǎng)的檢出率分別為15.9%(7/44)和37.0%(30/81),fexA在A、B兩個(gè)豬場(chǎng)的檢出率分別為15.9%(7/44)和51.9%(42/81),optrA基因檢A、B兩個(gè)豬場(chǎng)的檢出率分別為15.9%(7/44)和45.68%(37/81);fexB基因僅在B豬場(chǎng)檢出,檢出率為1.23%(1/81);三個(gè)豬場(chǎng)均未檢出多藥耐藥基因cfr。圖1

圖1 豬源糞腸球菌耐藥基因檢出情況Fig. 1 Situation of detection of drug resistance genes of Enterococcus faecalis from pigs

3 討 論

3.1隨著抗菌藥物在養(yǎng)殖業(yè)的不斷使用,細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題開始逐漸顯現(xiàn)出來(lái)[14,15]。目前多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的抗生素監(jiān)測(cè)系統(tǒng)已將腸球菌作為耐藥性監(jiān)測(cè)的指示菌[16]。

分離結(jié)果顯示:研究在阿克蘇地區(qū)部分豬場(chǎng)分離的糞腸球菌總體分離率為25.6%,低于董鵬[17]在河南地區(qū)所分的豬源糞腸球菌的分離率(51.3%),可能地域不同、采樣時(shí)間不同等因素導(dǎo)致的。

3.2藥敏結(jié)果顯示:阿克蘇地區(qū)不同豬場(chǎng)對(duì)紅霉素、泰樂(lè)菌素、四環(huán)素、多西環(huán)素、慶大霉素和沃尼妙林的耐藥率高達(dá)90%以上,耐藥結(jié)果與顧欣[18]和姚曉慧[19]報(bào)道的結(jié)果相近,以上藥物的高耐藥率表明以上6種藥物對(duì)豬源糞腸球菌感染的治療效果可能不理想,三個(gè)豬場(chǎng)對(duì)氟苯尼考、左氧氟沙星以及恩諾沙星的耐藥率的差異也說(shuō)明阿克蘇地區(qū)各養(yǎng)豬場(chǎng)之間用藥管理水平參差不齊。

3.3多藥耐藥結(jié)果顯示:研究中阿克蘇地區(qū)豬源糞腸球菌的多藥耐藥主要集中在6耐及以上,B豬場(chǎng)主要耐藥譜型集中在8～10耐,表明阿克蘇地區(qū)部分豬場(chǎng)的豬源糞腸球菌的耐藥性問(wèn)題應(yīng)當(dāng)?shù)玫街匾?而A和C兩個(gè)豬場(chǎng)的耐藥形勢(shì)也應(yīng)引起足夠的重視,lsa(E)基因可以介導(dǎo)包括鏈陽(yáng)霉素A類、林可霉素類、截短側(cè)耳素類藥物在內(nèi)的多種抗菌藥物耐藥[20],optrA基因可以介導(dǎo)噁唑烷酮類及酰氨醇類藥物耐藥[22],兩種基因均可通過(guò)水平傳播被其他細(xì)菌捕獲,從而獲得性耐藥。研究lsa(E)基因檢出率達(dá)40.0%,optrA基因檢出率達(dá)25.6%,并且研究中攜帶optrA基因的糞腸球菌已經(jīng)表現(xiàn)出噁唑烷酮類藥物利奈唑胺低水平耐藥的現(xiàn)象,鏈陽(yáng)菌素A類和噁唑烷酮類藥物在治療耐萬(wàn)古霉素腸球菌(Vancomycin-ResistantEnterococcus, VRE)及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)感染時(shí)存在藥物有效性下降的可能[21-23]。

4 結(jié) 論

共分離糞腸球菌160株,總體分離率為25.6%,其分離率依次為16.4%、34.6%、28.9%。B豬場(chǎng)對(duì)所檢12種藥物的耐藥菌株分離率顯著高于A和C豬場(chǎng)(P<0.05),A、C兩個(gè)豬場(chǎng)之間差異不顯著(P>0.05),A豬場(chǎng)的耐藥譜型在4～9耐,以6耐和7耐為主,占比70.4%;B豬場(chǎng)的耐藥譜型在7～10耐,以8耐和10耐為主,占比為81.4%;C豬場(chǎng)的耐藥譜型在3～8耐,以6耐為主,占比為80.0%。阿克蘇地區(qū)三個(gè)豬場(chǎng)的豬源糞腸球菌均檢出ermB、ermC、tet(K)、tet(L)、tet(M)、aac(6')/aph(2")、lsa(E)基因。