趙天智，黃建新

大理農林職業(yè)技術學院，云南大理 671003

孔雀作為國家一級保護動物，數量稀少且繁殖率不高，在動物保護和觀賞方面極具價值，然而孔雀寄生蟲病的流行為其帶來了馴養(yǎng)難題，寄生蟲對宿主的影響一般貫穿于移行和寄生的全部過程中[1]。目前，動物腸道寄生蟲病在我國分布范圍廣、發(fā)病率較高，嚴重影響動物的馴養(yǎng)，許多學者也對動物腸道寄生蟲感染情況做過調查[2]?？兹父腥灸c道寄生蟲在我國各地動物園屢見不鮮，其臨床表現緩慢，不易發(fā)現，常導致感染腸道寄生蟲的群體不斷擴大。本試驗通過顯微鏡對孔雀腸道寄生蟲卵進行形態(tài)學觀察，主要從感染寄生蟲的種類和感染強度入手，梳理有關學者對寄生蟲感染的調查研究，為孔雀腸道寄生蟲感染的預防和治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

乙醇；蒸餾水；滅菌玻片；100 mL 量筒；10 mL量筒；冰袋；食鹽；載玻片；蓋玻片；0.420、0.147 mm的金屬篩；燒杯；玻璃棒；自封袋；采集箱；離心管；培養(yǎng)皿，卡紅粉，鹽酸，濾紙，三角瓶，棕色玻璃瓶、移液管、膠頭滴管、10%甲醛溶液、收集管。

1.2 試驗器材

低速離心機（上海安亭科學儀器生產廠制造）；光學顯微鏡（上海通灝光電科技有限公司）；烘箱（蘇州銘智電熱設備有限公司）；電熱爐（錦州遠藤電爐科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1）采集糞樣。分不同時段到昆明圓通山動物園采集孔雀的新鮮糞樣放入干凈的自封袋中（單次糞樣）并在自封袋表面做好編號，放入采集箱帶回實驗室，置于4 ℃的冰箱保存待檢。

2）飽和食鹽水的配制。將盛有2/3 蒸餾水的500 mL 大燒杯至于電熱爐上加熱，待燒杯中的水煮沸后，往燒杯中不斷加入準備好的食鹽，用玻棒勻速攪拌，直至加入大燒杯中的食鹽不再溶解為止，關閉電熱爐，放置冷卻后，保存?zhèn)溆谩?/p>

3）鹽酸卡紅染液配制。用小量筒準確量取蒸餾水15 mL，鹽酸2 mL，將鹽酸加入置于燒杯中的蒸餾水后用電熱爐煮沸，趁熱加入稱取的4 g卡紅粉，邊加邊用玻璃棒攪拌，再加入85%乙醇95 mL，滴加氨水中和待出現沉淀，放置冷卻，用濾紙過濾，保存于棕色瓶中備用。

4）孔雀糞便的清洗及離心沉淀純化。①孔雀糞樣的清洗。將圓通山動物園采集的新鮮糞樣溶于事先配制的飽和食鹽水中，用玻璃棒勻速攪拌，使糞樣在飽和食鹽水中充分散開，靜置一段時間后，將漂浮在飽和食鹽水表面的較大雜質去除，肉眼下無明顯可見的雜質為止。然后分別用0.420、0.147 mm的金屬篩過濾，將過濾液靜置20 min，使寄生蟲卵漂浮在液體表層。②孔雀糞樣的離心沉淀。經過飽和食鹽水的漂浮清洗除去了較大的雜質；為進一步純化孔雀糞樣，使寄生蟲（卵）富集。將飽和食鹽水清洗過的糞液裝入離心管中，3 000 r/min 離心30 min，取出離心管，此時離心管中出現分層，寄生蟲（卵）富集于離心管底部，雜質漂浮于液面，將離心管中的上層飽和食鹽水倒去，重新加入蒸餾水并用玻璃棒將沉積于底部的樣本充分散開在水中，制成均一的懸浮液，后扭緊離心管瓶蓋再次放入離心機中離心。重復多次離心步驟，直至糞液表面無明顯漂浮的雜質，糞液的顏色從渾濁趨向于澄清為止。

5）寄生蟲的染色。利用鹽酸卡紅染色液為寄生蟲染色的過程一般包括固定、洗脫、染色、分色4個步驟[3-4]。染色完成后，糞樣放置冰箱中4 ℃保存鏡檢。

6）寄生蟲涂片鏡檢。①稀釋：用玻璃棒挑取離心管中少量的糞樣，放置于收集管中，加入少許蒸餾水稀釋，讓糞樣在收集管中充分散開，搖動收集管，制成均一的分散體系。②涂片：收集管中的糞樣稀釋好后，用玻璃棒蘸取液體數滴，放置在干凈的載玻片上順勢將其抹勻，涂片時糞樣不能太多，涂片完成后載玻片上的糞樣保證平整，厚度均勻。③鏡檢：該過程對操作顯微鏡技術要求較高，關系能否解決試驗的基本任務，嚴格遵守操作過程。

2 結果與分析

2.1 寄生蟲的鏡檢

在采集的孔雀糞樣中，通過飽和食鹽水漂浮法、離心沉淀法及鹽酸卡紅染液的染色，在光學顯微鏡下看到糞樣中存在很多的寄生蟲（卵），表明動物園中孔雀感染寄生蟲的情況普遍存在。為方便進行形態(tài)學觀察，將看到的寄生蟲（卵）進行數碼攝片保存。

2.2 寄生蟲的形態(tài)學觀察

1）毛首線蟲卵：蟲體呈乳白色。前為食道部，細長，內含有1 串單細胞圍繞的食道，后為體部，短粗，內有腸和生殖器官。雄蟲后部彎曲，泄殖腔在尾端，有1 根交合刺。雌蟲后端鈍圓，陰門位于粗細部交界處。

2）蛔蟲卵：線蟲蛔科屬蛔目，蟲卵卵殼較厚，處單細胞期，在外界經過3～5 周的成熟過程，為感染性蟲卵，屬直接發(fā)育型。

3）吸蟲卵：多成卵圓形或橢圓形，除分體吸蟲外都有卵蓋，顏色為灰白、淡黃色至棕色，卵在子宮成熟后排出體外，有的排出時僅含卵細胞和卵黃細胞，有的已有毛蚴，有的在子宮內孵化，但大多數需在體外孵化。

4）纖毛蟲：滋養(yǎng)體為圓形或橢圓形無色透明或呈淡綠灰色，外被表膜覆蓋斜縱行的纖毛。滋養(yǎng)體借助纖毛的行規(guī)則的擺動或旋轉運動，易變形。在滋養(yǎng)體前端有一凹陷的胞口，下接胞咽，借助胞口纖毛的擺動，將顆粒狀食物送入胞咽。

5）單睪丸屬絳蟲：節(jié)片全部寬度大于長度，刃部大而彎曲。生殖孔于單側，位于節(jié)片邊緣或亞邊緣。睪丸1 個，位于節(jié)片中部后緣，卵黃腺塊狀，吸盤無鉤。

6）四棱線蟲：無飾帶，雌雄異性，雌蟲近似球形，長3.5～4.5 mm，寬3 mm，在縱深部位形成深溝，其前端和后端自球體部突出。

7）吸蟲尾蚴：由蟲體和尾部構成，能在水中活躍運動，體表具棘，有1～2 個吸盤。消化道包括口、咽、食道、腸管；還有排泄器、神經元；為未分化的原始生殖器官。某些尾蚴形成囊蚴或直接經皮膚進入宿主體內，脫去尾部，發(fā)育為成蟲。

8）異刺線蟲：雌雄差異較大，蟲體細小，呈毛發(fā)狀，身體前段有1 個球狀角質膨大，口緣有3 個不明顯的唇片，有交合刺2 根，不等長。尾細長，生殖孔位于蟲體中部稍后方。蟲卵壁較厚，內容物一般占據一半的空間。

9）毛圓線蟲：該蟲體較小，一般不超過7 mm。缺口囊和頸乳突；排泄孔位于靠近體前段的一個明顯的腹側凹跡內；交合刺短而粗，常有扭曲和隆起的脊。

10）膜殼絳蟲：成蟲長3～8 cm，細似棉線，節(jié)片多達500 個，頭節(jié)纖細易斷裂，頂突無鉤，睪丸3個，寄生多時達數千條，但致病性不大。

11）絳蟲：背腹扁平、帶狀，白色和淡黃色。蟲體大小因種類而異，小的數毫米，大的可達10 m 以上。絳蟲由頭節(jié)、頸節(jié)、體節(jié)組成，按發(fā)育程度分為未成熟節(jié)片、成熟節(jié)片、孕節(jié)片。孕節(jié)片子宮極度發(fā)達，充滿蟲卵，其他器官退化。有些絳蟲的子宮為盲囊，不向外開口，蟲卵不能排出，故必須等待孕節(jié)片脫落破裂時才散出蟲卵。

12）球蟲卵：蟲卵囊呈寬卵圓形，壁光滑；有1極粒，孢子囊卵圓形。卵囊含0、1、2、4 或更多的孢子囊，往往根據卵囊數目和每個孢子囊內子孢子數目分屬。艾美爾屬球蟲，每個卵囊有4 個孢子囊。泰澤屬球蟲，無孢子囊。

3 討 論

1）在最初試驗的過程中，采用的是直接涂片觀察的方法。可能因為孔雀采食性和消化系統(tǒng)消化不完全的特征，在顯微鏡的視野范圍內有許多雜質，再加上大部分蟲卵透明的特性，嚴重影響蟲卵的辨別。故在試驗方法上做了如下改動：①糞便溶液依次通過0.420、0.147 mm 的金屬篩，以減少雜質；②不直接涂片觀察，增加染色環(huán)節(jié)。

2）由于寄生蟲體型微小，將其直接涂片觀察時寄生蟲自身顏色與載玻片背景顏色相差不大，不易區(qū)分，通過光學顯微鏡也難辨清其組織結構。為更好地篩選出寄生蟲，觀察到內部結構形態(tài)以便更好地辨別寄生蟲的種類，對其進行染色。在經過蘇木素染液、抗酸染液、石炭酸復紅染液、鹽酸卡染液等染色效果對比后，采用鹽酸卡紅染色，不僅提高了染色效果，而且也得到了比較滿意的結果。

3）在最初染色的過程中，沒有經過10%甲醛溶液的固定。在其后的染色過程中，不利于卡紅的染色，蟲體內部結構模糊，在顯微鏡視野下呈現局部通紅；故在加入10%甲醛固定這一環(huán)節(jié)將寄生蟲的內部結構固定，鹽酸卡紅染色時內部結構著色效果得到改善。

4）為了將寄生蟲體內的水分去除，方便染液的顏色能給體內組織更好著色。甲醛固定之后，用乙醇濃度梯度進行寄生蟲的脫水，按照低濃度到高濃度進行脫水工作，脫水過程應嚴格控制時間。脫水時間過長，使寄生蟲缺乏彈性與韌性，造成蟲體易碎；為改善脫水效果，經過反復試驗把每次脫水的時間控制為20 min，逐濃度梯度進行。

5）因每個蟲體的脫水效果、與染液的接觸等各方面的原因造成蟲體內部組織與外表顏色差異較大，一般蟲體外表面著色時間長顏色深，內部組織相反；此時用鹽酸乙醇進行分色，洗去外表面著色過深的部分，減少內外色差。但分色時間不宜太長，避免洗去過多的顏色，分色時間一般為30 s，之后立即離心，除去上清液。

6）用顯微鏡鏡檢時，寄生蟲涂片常由于暴露在空氣中時間過長造成涂片的干燥，寄生蟲縮為一團，猶如細小的微粒看不清內部機構；此時可在涂片上抹上水印，使寄生蟲重新舒展開來，方便觀察形態(tài)，鑒別寄生蟲種類。

4 小 結

本次試驗主要根據不同寄生蟲的形態(tài)特征和內部染色結構觀察對其種類進行篩選，并對寄生蟲的生物學特性進行分析和研究。通過對圓通山孔雀的糞便檢察發(fā)現孔雀感染了毛首線蟲、蛔蟲、異刺線蟲、毛圓線蟲、四棱線蟲；球蟲、纖毛蟲；吸蟲；單睪屬絳蟲、膜殼絳蟲等，其中線蟲的感染率最高，絳蟲感染率次之。在預防寄生蟲病時，應遵循無病預防的綜合性防治措施，實施科學的、定期的預防性驅蟲，驅蟲排出的糞便應做嚴格地處理，孔雀發(fā)生病變后應采取隔離治療，防止病原擴散。