胡培佳，程紅亮，4，楊超，張聞東，李青海，張宜廷

1 安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 安徽合肥 230000

2 浙江省上虞中醫(yī)醫(yī)院 浙江紹興 312300

3 安徽中醫(yī)藥大學 安徽合肥 230000

4 安徽中醫(yī)藥大學針灸臨床研究所 安徽合肥 230000

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）是繼發(fā)于多種腦血管損傷的一大類以記憶減退和嚴重認知功能障礙為臨床表現(xiàn)的綜合征，病情嚴重的VD患者甚至生活不能自理，該病最主要原因包括腦動脈閉塞、腦出血[1]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，過去5年，我國VD發(fā)病率逐年攀升，在50歲以上中老年人口中，VD發(fā)病率是0.8%，其中75歲以上人口占比高達80%[2]，且令人擔憂的是該病呈現(xiàn)出年輕化趨勢。隨著我國社會老齡化程度的不斷推進，預計到2040年，VD的患病率將翻一番[3]，這將給患者家庭和社會造成極大的負擔。目前西醫(yī)在治療VD方面暫沒有令人滿意的策略[4]，而中醫(yī)針刺對于VD的防治有較好的療效[5]，但其作用機制尚不清楚。筆者認為針刺可能通過調(diào)節(jié)腦組織的血氧代謝，近而起到保護腦部神經(jīng)元的作用。本研究通過建立VD大鼠模型，觀察針刺督脈組穴對VD大鼠海馬CA1區(qū)Ngb和HIF-1α表達的影響，并探究針刺防治VD的神經(jīng)保護機制。

材料與方法

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 雄鼠60只，SD級，體重230～270g，3月齡，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物許可證號：SCXK（魯）2014-0007。喂養(yǎng)地點：安徽中醫(yī)藥大學實驗動物飼養(yǎng)中心，溫度21～25℃，濕度50%，飼料選用實驗鼠專用豆粕飼料，每日燈光明/暗交替時間為18/6h。

1.2 篩選與分組 為減少大鼠先天差別對研究的干擾，將喂養(yǎng)一周后的全部大鼠依次放入Morris水迷宮中連續(xù)訓練3d，5min/d，第4d時挑選出反應(yīng)較恒定的36只大鼠作為最終研究對象。采用Excel隨機排序法將大鼠分為電針組、模型組和假手術(shù)組，每組12只，接下來電針組、模型組將作造模處理，假手術(shù)組作假手術(shù)處理。

2 方法

2.1 VD大鼠模型復制方法 通過反復三次阻斷雙側(cè)頸總動脈血流后永久性結(jié)扎頸總動脈制作VD大鼠模型[6]。具體步驟為：所有待造模大鼠禁食不禁水12h后，稱重，采用巴比妥鈉腹腔注射麻醉（藥物濃度2%，劑量200mg/kg）。麻醉約5min后用血管鉗夾持大鼠尾部，確保大鼠無疼痛反應(yīng)后將其仰臥放置，用橡皮筋固定四肢和頭部，拉直其頸部剃毛，常規(guī)手術(shù)區(qū)域消毒，備皮，用手術(shù)刀劃開頸部皮膚，逐層分離肌肉層直到頸總動脈，用玻璃分針將與頸總動脈并行的交感神經(jīng)鈍性分離，隨后夾閉頸總動脈20min，然后釋放10min，此阻斷和恢復腦血流步驟共重復三次，期間密切關(guān)注大鼠生命體征，呼吸心跳不規(guī)則的大鼠可適當縮減夾閉時間。首次夾閉頸總動脈5min后，剪斷大鼠尾部最后1cm，放血約0.2mL，第三次釋放動脈夾30min后，用4號無菌細線對生命體征穩(wěn)定的大鼠兩測頸總動脈近心端、遠心端作永久性結(jié)扎，并剪斷結(jié)扎中點，隨后縫合切口，并在接下來兩周內(nèi)每日對切口進行常規(guī)消毒。三組大鼠手術(shù)步驟相同，但假手術(shù)組大鼠頸總動脈血流不作阻斷。

2.2 治療方法

2.2.1 電針組 造模成功后，對大鼠進行針刺干預，穴位參考《實驗針灸學》[7]大鼠標準穴位圖譜，選取“百會”（平刺2.5mm）、“神庭”（平刺2.5mm）、“大椎”（直刺5mm）、“風府”（斜刺5mm）。百會和神庭連接一對電極，大椎和風府連接一對電極，刺激電流選擇疏波，頻率2Hz，強度1.1mA（峰-峰值），波寬300μs。1次/d，30 min/次，每治療6d，休息1d，連續(xù)治療2周。

2.2.2 假手術(shù)組、模型組 與電針組同步開始，但僅作相同的固定。

2.3 Morris水迷宮實驗 為減少測試環(huán)境對大鼠造成的影響，測試開始前1d，將大鼠放于水迷宮內(nèi)隨意活動2min。第2d起，每日對大鼠進行測試，每只大鼠每次的測試時間最長2min，將大鼠放入固定起始點后用計時器記錄大鼠找到登陸平臺的總用時，該時長又稱逃避潛伏期，在此期間未能到達登陸臺的大鼠，則該次用時計為2min，并引導其順利到達登陸點。第6d撤去登陸臺，按相同方法將大鼠放入水中，讓其尋找記憶中的登陸點，時間2min，記錄每只大鼠經(jīng)過登陸點的次數(shù)。

2.4 石蠟切片Tunel法觀察細胞凋亡 采用石蠟切片Tunel法制作觀察樣本。具體步驟為：取腦組織前將水迷宮實驗完成后的大鼠作禁食不禁水12h處理，麻醉藥物及方法同手術(shù)處理，麻醉完成后，從大鼠頸椎上部點切斷其頭部，將頭放置于冰盤上，剝離頭骨和其它腦組織，迅速取出腦內(nèi)CA1區(qū)海馬組織。將海馬依次放入三杯10mL二甲苯溶液中，每杯時間15min，再將海馬依次放入三杯濃度分別為100%、95%、80%乙醇中，每杯時間5min。將染色架連同切片放于潔凈玻璃盤中，于緩慢流動的自來水下漂洗，以切片干凈透明為度。在36℃下用ProteinaseK溶液處理切片20min，PBS清洗3遍，過氧化物酶封閉20～30min，于標本上滴入50uL的Tunel反應(yīng)液（50uL TdT+450uL dUTP）后放入36℃反應(yīng)盒中靜置1h，再次PBS清洗3次，滴入50uLPOD后將標本放入36℃反應(yīng)盒中靜置30min，繼用PBS清洗3遍，最后采用DAB顯色，蒸餾水沖洗，終止顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化數(shù)秒，碳酸鋰藍化1min，水洗，脫水透明，中性樹膠封片。

2.5 檢測海馬中ATP濃度 取出的大鼠腦內(nèi)CA1區(qū)海馬組織，采用ATP檢測試劑盒檢測海馬中ATP濃度。計算公式：組織中ATP濃度（μmol/mgprot）=（測定OD值-對照OD值）/（標準OD值-空白OD值）*推薦值（1000μmol/L）/待測樣品蛋白濃度。

2.6 Ngb、HIF-1α蛋白表達水平檢測 取出的大鼠腦內(nèi)CA1區(qū)海馬組織，用NS漂洗與實驗無關(guān)的組織和污物，隨后按以下程序用Western blot法進行檢測。

2.6.1 將海馬組織切割成重量約為100mg的樣本。

2.6.2 組織勻漿及蛋白的提取。

2.6.3 電泳 ①SDS-PAGE凝膠配制；②樣品處理；③上樣與電泳；④轉(zhuǎn)膜；⑤封閉；⑥一抗孵育。

參照相關(guān)使用說明，用專用液稀釋被過氧化物酶（HRP）標記的二抗（稀釋比例為1：2萬）。25℃下孵育2h。再于TBST液中漂洗3道，每道10min。最后根據(jù)檢測說明書，采用ECL發(fā)光試劑盒進行檢測。

2.7 p53RFPmRNA、NgbmRNA、HIF-1αmRNA檢測

2.7.1 RNA提取 剝離好的海馬組織稱取50～100 mg剪切后放入EP管中，然后放入液氮中研磨，隨后加入1mL TRIzol進行勻漿。為使上述組織完全裂解，將海馬組織放置于離心機中，溫度4℃，離心時間10min，轉(zhuǎn)速12000rpm，離心完成再將0.2mL氯仿加入組織液中，充分震蕩混合后在25℃環(huán)境內(nèi)靜置30min。在4 ℃的溫度下將組織混合液用離心機以12000 rpm進行離心15 min，隨后取大約500 μL的上清液放置于EP管中。滴入異丙醇0.5mL于EP管中，緩慢搖勻后在25℃環(huán)境內(nèi)靜置10 min，接著滴入1ml濃度為75%乙醇溶液（DEPC配置），4℃下離心5 min，結(jié)束后取出底層沉淀物，在25℃環(huán)境內(nèi)靜置干燥20min，待其干燥后即得到RNA沉淀。于干燥后的RNA沉淀物中加入DEPC水20～50μL，使用PCR儀，加熱10 min，溫度55℃，以促進RNA沉淀物充分溶解，完成將其放置于-80℃冷凍庫內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7.2 RT反應(yīng) 先后于0.2mL的EP管中放入重量為1μg的總RNA和約12μ L10μMOligo（dT）1μL DEPC水，充分混合后離心10min。然后使用PCR儀，將混合液加熱5min，溫度65℃，結(jié)束后立即于0℃的冰水中靜置3min。隨后滴入10 mM dNTP Mix2 μL、Revert Aid TM M-MuLV Reverse Transcniptase、5×Reaction Buffer 4.0μL、RibolockTM Rnase inhibitor 1μL。接著依次在溫度為42 ℃和70 ℃的保溫箱內(nèi)靜置60 min和5 min。最后形成的mRNA即為實驗所需，將其放置于-80℃冷凍庫內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

3 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計分析使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，其中組間比較使用單因素方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 水迷宮實驗結(jié)果

如圖1所示，模型組大鼠的逃避潛伏期最長，其次為電針組，假手術(shù)組最短；假手術(shù)組跨越平臺次數(shù)最多，其次為電針組，模型組最少。由此可見，針刺具有改善認知功能障礙的作用。

圖1 治療結(jié)束后三組水迷宮數(shù)據(jù)比較（±s，n=12）

2 Tunel切片結(jié)果

如圖2所示，取海馬大致相同部位為觀察區(qū)域，鏡下呈棕褐色顯色的為凋亡細胞陽性反應(yīng)物，模型組凋亡細胞數(shù)明顯較電針組多，假手術(shù)組凋亡細胞數(shù)明顯較模型組和電針組少。此結(jié)果說明針刺具有減緩神經(jīng)細胞凋亡的作用。

圖2 Tune切片結(jié)果

3 海馬中ATP濃度

如表1所示，假手術(shù)組海馬組織中的ATP濃度明顯高于模型組與電針組，而電針組又高于模型組?？梢娽槾讨委熌茱@著增加ATP濃度，從而為細胞的再生提供良好的環(huán)境。

表1 三組海馬中ATP濃度

4 Ngb、 HIF-1α 蛋白表達水平

采用Western blot法檢測Ngb、HIF-1α蛋白，如圖3所見，電針組大鼠海馬組織中Ngb、HIF-1α蛋白表達水平高于其余兩組，三組蛋白表達水平按照假手術(shù)組、模型組、電針組呈升高趨勢；相較于假手術(shù)組，電針組的Ngb、HIF-1α蛋白表達水平升高幅度明顯高于模型組。這表明針刺能促進Ngb、 HIF-1α表達，改善腦部病變部位缺血缺氧狀態(tài)，進而緩解認知功能障礙。

圖3 三組大鼠海馬組織中Ngb、HIF-1α蛋白表達比較（±s，n=12）

5 p53RFPmRNA、NgbmRNA、HIF-1αmRNA表達水平

采用RT-PCR法檢測三種mRNA 的表達水平，結(jié)果如圖4所示，電針組大鼠海馬組織NgbmRNA、HIF-1αmRNA表達水平高于模型組和假手術(shù)組；相較于假手術(shù)組，電針組的NgbmRNA、HIF-1αmRNA表達水平升高幅度明顯高于模型組；p53RFPmRNA的表達水平按模型組、電針組和假手術(shù)組呈下降趨勢。實驗數(shù)據(jù)說明，針刺通過促進NgbmRNA、HIF-1αmRNA 表達和抑制p53RFPmRNA表達來改善VD大鼠認知功能。以上數(shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖4 三組大鼠p53 RFPmRNA、NgbmRNA、HIF-1αmRNA表達比較（±s，n=12）

討 論

在我國，血管性癡呆（VD）的發(fā)病率呈逐年上述趨勢，VD患者可出現(xiàn)嚴重的思維、認知、記憶、情緒和行為障礙，該病給中老年人日常生活造成了極大的困擾，同時也給患者家庭和整個社會帶來極大的負擔[9]?，F(xiàn)有的大量影像學資料和尸檢報告發(fā)現(xiàn)，腦灰質(zhì)和白質(zhì)深部小血管病變是引發(fā)VD的重要原因[10]，且大腦的微小血管病變程度越高，患者認知障礙的程度越深。截止目前的大量臨床研究、影像學資料和實驗動物研究已能夠確定VD患者腦內(nèi)血流量較正常人存在不同幅度減少，由此得出的結(jié)論是增加腦血流量能減緩神經(jīng)元凋亡和保護腦組織，從而起到防治VD的作用[11-14]。

中醫(yī)學認為，VD的病位在腦，與督脈密切相關(guān)，核心病機是年老腎虛、陽氣虛衰、腦髓空虛，治療原則為調(diào)氣血、通腦洛、溫陽氣。本課題組認為治療VD需從通調(diào)督脈入手，《難經(jīng)·二十八難》謂：“督脈者，起于下極之輸，并于脊里，上至風府，入屬于腦?！庇纱丝梢?，若督脈得通，則陽氣得暢，腦髓得養(yǎng)，精神得振。穴位選取百會、風府、大椎、神庭，百會又稱“三陽五會”，能通達周身陰陽；風府又稱“上椎”，靠近腦髓部，具有通督調(diào)神，安神定志之效，擅調(diào)節(jié)神機治療腦疾；大椎為“三陽督脈之會”，既是通陽要穴，又能增神益智；神庭為調(diào)神之要穴，又居額葉前，而額葉部主管情志。以上四穴，我們在臨床防治VD已經(jīng)取得了確切療效。

此次研究我們發(fā)現(xiàn)，發(fā)生腦栓塞時，VD大鼠體內(nèi)HIF-1α表達水平迅速上升，腦組織缺血缺氧狀態(tài)得到一定程度改善，并且接受針灸治療的大鼠腦組織損傷程度較模型組輕。通過免疫組化和蛋白印跡分析檢測內(nèi)源性NSCs，結(jié)果顯示，內(nèi)源性NSCs受HIF-1α早期表達的影響，為腦神經(jīng)元修復提供良好的環(huán)境[15-16]。Ngb是腦組織中特有的第三類載氧蛋白，多種信號轉(zhuǎn)導通路的正常運行需Ngb的參與，該蛋白與腦的氧供關(guān)系十分密切，能清除帶有神經(jīng)毒性的氧化產(chǎn)物、減緩神經(jīng)細胞受損、保護神經(jīng)信號傳遞[17]。HIF-1α是一種異源二聚體，能增加機體對缺氧的耐受度，并促進病灶血管新生，當機體處于缺氧狀況時，HIF-1α會被刺激表達，與Ngb共同增加腦組織的攝氧量。國外學者研究發(fā)現(xiàn)Ngb的表達與不僅與P53有關(guān)聯(lián)，HIF-1α還能與P53相結(jié)合[18]。無獨有偶，國內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)Ngb的高表達能抑制Bax分泌[19]，從而起到保護神經(jīng)元的功能，并且認為可以通過檢測Ngb含量來評估腦損傷的預后[20]。對于腦組織受保護的完整過程，我們推斷是因為腦梗塞發(fā)生后某種通路被激活，從而使Ngb表達水平上升，該通路可能為“腦組織缺血缺氧刺激HIF-1α表達→P53與HIF-1α結(jié)合→Ngb表達水平上升→腦組織用氧率提升”。綜上中外學者的研究，可以得出的結(jié)論是刺激體內(nèi)Ngb和HIF-1α表達能改善認知功能障礙。該結(jié)論于本次研究結(jié)果相一致，即電針組腦組織恢復程度優(yōu)于模型組，電針組大鼠認知障礙改善程度和Ngb與HIF-1α的表達呈現(xiàn)正相關(guān)。

本研究以反復三次阻斷雙側(cè)頸總動脈血流后永久性結(jié)扎頸總動脈復制VD大鼠模型，以針刺督脈百會、大椎、風府、神庭為治療方法，通過觀察大鼠Morris水迷宮行為和檢測海馬CA1區(qū)NGB與HIF-1α表達水平，發(fā)現(xiàn)針刺能促進NGB和HIF-1α表達，發(fā)揮改善腦組織缺血缺氧狀態(tài)和保護神經(jīng)元作用，進而改善大鼠認知功能障礙。但是本研究的不足之處在于未能闡明NGB與HIF-1α發(fā)揮神經(jīng)保護的水平時序變化關(guān)系，這將成為我們下一步研究的重點。