張嘉慧，邢佳佳，彭麗媛，鄔奇峰，陳俊輝，徐秋芳，秦 華*

（1 浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 311300；2 杭州市臨安區(qū)農(nóng)林技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 311300）

近年來(lái)，高強(qiáng)度集約化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)削弱土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性與平衡性，病原菌入侵是土壤生態(tài)系統(tǒng)退化的重要標(biāo)志[1]。病原菌與土著菌通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)資源與生態(tài)位等，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生顯著影響。茄科雷爾氏菌 (Ralstonia solanacearum) 亦稱青枯菌，是世界上分布區(qū)域最廣、病害程度最高的十大病原菌之一，可通過(guò)植物根系傷口進(jìn)入維管束組織，導(dǎo)致植物感病。青枯菌對(duì)包括馬鈴薯、番茄、辣椒和煙草等在內(nèi)的茄科作物危害尤為嚴(yán)重，每年造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失難以量化[2–3]。番茄 (Solanum lycopersicum)是我國(guó)種植最廣泛的經(jīng)濟(jì)作物之一，番茄青枯病是番茄栽培中發(fā)生普遍和危害嚴(yán)重的病害之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，輕病田塊減產(chǎn)10%～30%，重病田塊減產(chǎn)超過(guò)50%甚至絕收，嚴(yán)重制約了番茄種植業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益的提高[4–5]。

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在植物健康生長(zhǎng)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)中起關(guān)鍵作用[6]，植物、病原菌和土著微生物之間的相互作用決定植物病害的發(fā)生與發(fā)展。當(dāng)病原菌入侵植物根際，植物感知脅迫后改變其根系分泌物的成分和濃度，并在根際產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)[7]，招募有益微生物來(lái)降低病原菌對(duì)宿主的侵害。如擬南芥在丁香假單胞菌 (Pseudomonas syringae) 的脅迫下通過(guò)增加根系分泌物中蘋果酸的滲出而招募土壤中的枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 在其根際定殖，枯草芽孢桿菌通過(guò)分泌脂肽抗生素以抑制丁香假單胞菌的侵染能力[8]。尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum) 侵染黃瓜根系增加了根系分泌物中色氨酸的含量，并降低了棉子糖的濃度，促進(jìn)土壤的解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens) 在根際定殖，解淀粉芽孢桿菌通過(guò)生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)降低尖孢鐮刀菌的豐度[9]。研究病原菌入侵后的根際微生物變化有助于了解植物對(duì)病原菌入侵的響應(yīng)，以及病原菌與土著微生物之間復(fù)雜的相互作用[10]。

叢枝菌根 (arbuscular mycorrhiza，AM) 真菌是土壤中分布最廣的根際微生物之一，可定殖于植物根系皮層與宿主形成互惠共生體[11]。AM真菌在土壤中產(chǎn)生大量的根外菌絲網(wǎng)絡(luò)，可顯著增加宿主植物根系的吸收面積，并為植物制造的光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至土壤微環(huán)境中提供了直接途徑[12]。已有許多研究表明，AM真菌定殖于植物根系會(huì)使宿主根際細(xì)菌數(shù)量和組成發(fā)生變化[12–13]，如Andrade等[14]的研究發(fā)現(xiàn)摩西管柄囊霉 (Funneliformis mosseae) 等3種AM真菌侵染的高梁使其根際土壤細(xì)菌數(shù)量多于土體土壤。Artursson等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，定殖在棉花根系的摩西管柄囊霉 (Funneliformis mosseae) 和球狀巨孢囊霉(Gigaspora margarita) 在菌絲際富集了芽孢桿菌屬(Bacillus) 、芽單胞菌屬 (Gemmatimonadetes) 和黃桿菌屬 (Flavobacterium) 等菌群。土壤細(xì)菌群落數(shù)量、組成和活性的變化可歸因于定殖于植物根系的AM真菌改變宿主植物的根系分泌物的組成，或AM真菌通過(guò)根外菌絲為微生物的生長(zhǎng)提供生態(tài)位，分泌的含碳化合物維持AM真菌與其它微生物之間的互惠關(guān)系[15–16]。

盡管已有大量研究表明青枯菌入侵推動(dòng)了根際微生物群落的改變，但相關(guān)研究多集中于拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定[5,17]，關(guān)于AM真菌與土壤細(xì)菌群落互作對(duì)青枯菌入侵的響應(yīng)機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (real-time quantitative PCR，qPCR) 和NovaSeq高通量測(cè)序技術(shù)，探索AM真菌和青枯菌接種對(duì)接入病原菌及根際細(xì)菌群落的影響，闡明土著細(xì)菌群落的多樣性和組成及細(xì)菌物種之間的相互作用對(duì)青枯菌和AM真菌接種的響應(yīng)，為利用AM真菌調(diào)控土壤微生物區(qū)系從而抑制土壤青枯菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄為青枯病易感品種‘合作903’；供試AM真菌為摩西管柄囊霉 (Funneliformis mosseae)M47V；供試病原菌為茄科雷爾氏菌QL-RS 1115(GenBank：GU390462)；供試土壤于2021年8月采自浙江省嘉興市嘉善縣番茄種植農(nóng)業(yè)基地 (E120°59′，N30°48′)，選取具有長(zhǎng)期青枯病發(fā)病史的種植大棚，采集0—20 cm土層土壤，過(guò)6 mm 篩，備用。供試土壤理化性質(zhì)為pH 7.04，有機(jī)碳13.7 g/kg，有效磷19.6 mg/kg，速效鉀 116 mg/kg，硝態(tài)氮 5.44 mg/kg，銨態(tài)氮 1.01 mg/kg。

番茄種子用無(wú)菌水浸泡5 min后用5%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，無(wú)菌水沖洗5次，將番茄種子轉(zhuǎn)移至30℃培養(yǎng)箱中催芽48 h。將萌發(fā)的番茄種子移入50孔育苗盤中，向每孔中加入20 g生升農(nóng)業(yè)育苗基質(zhì)土(主要成分：進(jìn)口泥炭、進(jìn)口椰糠、珍珠巖、腐殖質(zhì))和20 g摩西管柄囊霉菌劑，進(jìn)行菌根化育苗，非菌根化育苗則加入20 g生升農(nóng)業(yè)育苗基質(zhì)土和20 g滅活菌劑。番茄苗置于氣候箱中培養(yǎng)，相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：溫度26℃，濕度50%，日照時(shí)長(zhǎng)12 h，育苗 30 天。

青枯菌菌液制備：將青枯菌在SMSA培養(yǎng)基中活化，轉(zhuǎn)接到NB液體培養(yǎng)基中，28℃、170 r/min搖床培養(yǎng)12 h，作為種子液，再轉(zhuǎn)接于NB液體培養(yǎng)基，28℃、170 r/min 搖床培養(yǎng) 36 h，高速離心棄去上清液，用無(wú)菌水重懸菌體，通過(guò)稀釋使菌懸液濃度達(dá)到 109cfu/mL。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 盆栽試驗(yàn) 盆栽試驗(yàn)在浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)基地 (E119o43’，N30o15’) 的溫室大棚中進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：1) 非菌根苗未接種青枯菌 (對(duì)照，CK)；2) 菌根苗未接種青枯菌 (TN+AMF)；3) 非菌根苗接種青枯菌 (TR–AMF)；4) 菌根苗接種青枯菌 (TR+AMF)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)置20盆番茄。除去番茄苗根系附著的育苗基質(zhì)，將培育30 天后的番茄苗移入裝有500 g 供試土壤的盆缽中，每盆移栽1株，調(diào)節(jié)土壤含水量至30%左右。移栽后緩苗一周，采用灌根法對(duì)TR–AMF和TR+AMF處理根系周圍土壤接種5 mL R. solanacearum懸液(CK和TN+AMF處理則用等量的無(wú)菌水替代)。

1.2.2 樣品采集 在接入青枯菌后的第1、7和14天，采集番茄根系和根際土壤樣品。樣品的采集：每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選定3株番茄，對(duì)選定番茄進(jìn)行破壞性采樣。采用抖根法收集粘附在番茄根系的根際土壤為1組混合根際土壤樣品，收集番茄根系為1組混合根系樣品，每個(gè)處理各得3組重復(fù)的根際土壤樣品和根系樣品。收集的根際土壤樣品和根系樣品保存于–70℃的冰箱中備用。將收集到的根系樣品用于AM真菌侵染率的測(cè)定，番茄根際土壤用于土壤總DNA提取。

1.3 分析方法

1.3.1 青枯病發(fā)病率和病情指數(shù) 在番茄根部接入青枯菌后，每天觀察番茄發(fā)病癥狀，并統(tǒng)計(jì)發(fā)生萎蔫的葉片數(shù)，記錄各處理番茄的發(fā)病率、病情指數(shù)。將植物的發(fā)病癥狀分為5個(gè)等級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)，無(wú)葉片萎蔫；I級(jí)，1%～25%的葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；II級(jí)，26%～50%的葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；III級(jí)，51%～75%的葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；Ⅳ級(jí)，76%～100%的葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。發(fā)病率和病情指數(shù)的計(jì)算：發(fā)病率=(感病株數(shù)/總株數(shù))×100%；病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù))/(總株數(shù)×最高發(fā)病級(jí)數(shù))×100%。

1.3.2 AM真菌侵染率的測(cè)定 將接入病原菌后的第1、7和14 天收集的番茄根系樣品進(jìn)行AM真菌侵染率的測(cè)定。AM真菌侵染率的測(cè)定：用20% KOH溶液脫色，用5%的醋酸墨水染色液進(jìn)行染色，后用Sudan IV染色液進(jìn)行復(fù)染，于體視顯微鏡下觀察 AM 真菌在根系的侵染情況，侵染率采用根段頻率標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 土壤總DNA提取 在接入病原菌后的第1、7和14 天，收集根際土壤樣品用于土壤總DNA提取。采用 PowerSoilTMTotal DNA Isolation Kit 試劑盒提取土壤樣品的總DNA。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，稱取0.25 g鮮土提取樣品的總DNA，提取出的DNA樣本通過(guò)核酸定量?jī)xNanoDrop在A260/A280和A260/A230的吸光度比值檢測(cè)其濃度及純度，純化的DNA樣本保存于–40℃的冰箱中備用。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 測(cè)定接入病原菌后的第1、7和14 天的番茄根際土壤中的青枯菌。青枯菌flic基因擴(kuò)增使用引物對(duì) flicF/flicR (5'–GAA CGC CAA CGG TGC GAA CT–3' / 5'–GGC GGC CTT CAG GGA GGT C–3')[18]，將含青枯菌flic基因的質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋制成103～109copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增體系為 10 μL TB Green，0.2 μL flicF 和 0.2 μL flicR，0.1 μL 土樣DNA和9.5 μL無(wú)菌水，每組處理設(shè)置3個(gè)樣品重復(fù)，3個(gè)測(cè)定重復(fù)，根據(jù)所測(cè)定的Ct值計(jì)算1 g干土樣中flic基因的拷貝數(shù)，結(jié)果以對(duì)數(shù)形式l g(copies/g, 干土)呈現(xiàn)。

1.3.5 高通量測(cè)序 將接入病原菌后第1和14天收集的根際土壤樣品送于深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。使用引物338F (5'–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG–3') 和 806R (5'– GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3') 通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 擴(kuò)增 16S rRNA 基因的可變 V3～V4 區(qū)，基于Illumina NovaSeq平臺(tái)對(duì)測(cè)序樣本進(jìn)行雙端測(cè)序，使用Qiime2軟件中的DADA2插件對(duì)所有樣品的全部原始序列 (input) 進(jìn)行質(zhì)量控制 (filtered)，去噪(denoised)，拼接 (merged)，并且去嵌合體 (nonchimeric)，四組處理的土壤樣品在試驗(yàn)前期和后期分別得到1012154和1021142條序列，根據(jù)97%的相似性，分為7870和9343個(gè)細(xì)菌OTU，通過(guò)Silva數(shù)據(jù)庫(kù) (16S) 進(jìn)行物種注釋。設(shè)置置信度閾值為0.7，且四組處理的Alpha多樣性稀釋曲線 (rarefaction curve) 趨于平緩，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量已足夠反映當(dāng)前樣品包含的絕大部分的微生物多樣性信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)處理分析基于IBM SPSS 20.0和R 3.5.3。采用雙因素方差分析 (two-way ANOVA) 和Duncan’s函數(shù)對(duì)青枯菌flic基因豐度、土壤理化性質(zhì)和Alpha多樣性等指標(biāo)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)對(duì)細(xì)菌門和細(xì)菌屬進(jìn)行顯著性差異分析。基于細(xì)菌OTU表，通過(guò)Qiime中alpha_diversity.py腳本計(jì)算群落Alpha多樣性指數(shù)；利用R語(yǔ)言中vegan軟件包進(jìn)行非度量多維尺度分析(NMDS)，并進(jìn)行ANOSIM相似性檢驗(yàn)；采用spearman相關(guān)性分析法，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的r和p閾值分別設(shè)定為0.7和0.01，構(gòu)建共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，利用軟件 Cytoscape (v3.8.0) 和 Gephi (v.0.92) 構(gòu)建細(xì)菌可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌侵染率、土壤青枯菌豐度和番茄發(fā)病情況

菌根化育苗處理 (TN+AMF和TR+AMF) AM真菌侵染率在32%～40%，而非菌根化育苗處理 (CK和TR–AMF) AM真菌侵染率在4.0%～4.7%，前者顯著高于后者 (P<0.05) (圖 1a)。

接入病原菌后第1天，接種青枯菌處理 (TR–AMF和TR+AMF) 根際青枯菌flic基因豐度在5.19×108～6.22×108copies/g, 干土，未接種青枯菌處理 (CK 和TN+AMF) 根際青枯菌 flic基因豐度在 4.11×106～5.57×106copies/g, 干土，前者顯著高于后者 (P<0.05)(圖1b)。接入病原菌第7 天，接種青枯菌的TR–AMF和TR+AMF處理根際flic基因豐度分別為1.08×108和 7.38×107copies/g, 干土，而未接種青枯菌的 CK和TN+AMF處理根際flic基因豐度分別為5.24×106和 2.39×106copies/g, 干土，TN+AMF 處理根際 flic 基因豐度顯著低于CK處理 (P<0.05)，與第1天相比，CK處理根際flic基因豐度提高，而TR–AMF、TR+AMF和TN+AMF處理根際flic基因豐度降低，接種青枯菌處理根際flic基因豐度仍顯著高于未接種青枯菌處理。接入病原菌第14 天，接種青枯菌的TR–AMF和TR+AMF處理根際flic基因豐度分別為1.99×107和 9.64×106copies/g, 干土，TR+AMF 處理根際flic基因豐度顯著低于TR–AMF處理 (P<0.05)，而未接種青枯菌的CK和TN+AMF處理根際flic基因豐度分別為 1.06×106和 3.70×105copies/g, 干土，TN+AMF處理根際flic基因豐度顯著低于CK處理(P<0.05)，與第7天相比，4個(gè)處理根際青枯菌flic基因豐度均降低，且接種AM真菌的處理根際flic基因豐度均顯著低于未接種AM真菌的處理(P<0.05)，接種青枯菌的處理根際flic基因豐度仍顯著高于未接種青枯菌的處理 (P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種青枯菌顯著提高番茄根際病原菌的數(shù)量，而接種AM真菌在試驗(yàn)后期顯著降低番茄根際青枯菌的數(shù)量。

圖1 AM真菌侵染率、青枯菌flic基因豐度、青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)Fig. 1 AM fungal colonization rate, abundance of R. solanacearum flic gene, bacterial wilt incidence rate and disease index

試驗(yàn)過(guò)程中，未接種青枯菌的CK和TN+AMF處理未出現(xiàn)發(fā)病現(xiàn)象，接種青枯菌的TR–AMF和TR+AMF處理在接入青枯菌第7 天先后開(kāi)始發(fā)病。通過(guò)比較TR–AMF和TR+AMF兩組處理的發(fā)病率(圖1)，發(fā)現(xiàn)相比于TR+AMF處理，TR–AMF處理的發(fā)病速度更快，在接入病原菌第13 天已全部發(fā)病，由此推測(cè)AM真菌在一定程度上延緩了青枯病的發(fā)生，且TR+AMF處理在接入病原菌第9、12、13和14 天，其病情指數(shù)顯著低于TR–AMF處理 (P<0.05) (圖 1)。

2.2 接種青枯菌和AM真菌對(duì)番茄根際土壤細(xì)菌群落的影響

2.2.1 番茄根際土壤細(xì)菌群落組成 番茄根際土壤細(xì)菌群落因接種青枯菌和AM真菌而產(chǎn)生一系列變化。在接入病原菌第1 天，接種青枯菌顯著提高番茄根際細(xì)菌中的變形菌門 (Proteobacteria) 的相對(duì)豐度 (P<0.05) (圖2a)，以及變形菌門下勞爾氏菌屬 (Ralstonia)、不動(dòng)桿菌屬 (Acinetobacter)、砂單胞菌屬 (Arenimonas)、多囊菌屬 (Polyangium) 的相對(duì)豐度 (P<0.05) (圖3a)；而顯著降低了酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes)、綠彎菌門 (Chloroflexi)、己科河菌門 (Rokubacteria)和放線菌門 (Actinobacteria) 的相對(duì)豐度 (P<0.05)。接種AM真菌未對(duì)番茄根際細(xì)菌門水平豐度產(chǎn)生顯著影響，但對(duì)青枯菌入侵下番茄根際的部分細(xì)菌屬的相對(duì)豐度產(chǎn)生顯著影響。接種AM真菌顯著提高變形菌門下的氫噬胞菌屬 (Hydrogenophaga)、伯克氏菌屬(Limnobacter)、伯克氏菌屬 (Ramlibacter)、叢毛單胞菌屬 (Curvibacter)、甲基桿菌屬 (Microvirga) 和Inhella、Silvanigrella屬以及擬桿菌門下的黃桿菌屬(Flavobacterium) 的相對(duì)豐度 (P<0.05) (圖 3a)。在接入病原菌第14 天，接種青枯菌顯著提高番茄根際細(xì)菌中的變形菌門 (Proteobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes) 和己科河菌門 (Rokubacteria) 的相對(duì)豐度 (P<0.05) (圖2b)，以及變形菌門下的勞爾氏菌屬 (Ralstonia)、鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)、溶桿菌屬 (Lysobacter)、蛭弧菌屬 (Bdellovibrio)、砂單胞菌屬 (Arenimonas)、熱單胞菌屬 (Thermomonas)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、多囊菌屬 (Polyangium)、不動(dòng)桿菌屬 (Acinetobacter)、食酸菌屬 (Acidovorax)、Pseudoduganella屬和擬桿菌門下黃桿菌屬 (Flavobacterium) 的相對(duì)豐度 (P<0.05) (圖 3b)；而顯著降低了酸桿菌門 (Acidobacteria)、綠彎菌門 (Chloroflexi)和放線菌門 (Actinobacteria) 的相對(duì)豐度 (P<0.05)(圖2b)。接種AM真菌顯著提高擬桿菌門下噬胞菌屬 (Cytophaga)、黃桿菌屬 (Flavobacterium) 和黃色土源菌屬 (Flavisolibacter) 及酸桿菌門下苔蘚桿菌屬(Bryobacter)、Subgroup 屬的相對(duì)豐度 (P<0.05) (圖 3b)。

圖2 接入病原菌第1天(a)和第14天(b)番茄根際的細(xì)菌門水平組成Fig. 2 Bacterial phylum level of tomato rhizosphere on 1 days (a) and 14 days (b) after inoculation of pathogen

圖3 接入病原菌第1天(a) 和第14天(b) 番茄根際細(xì)菌屬水平的顯著性比較Fig. 3 Significant comparison of bacterial genus levels of tomato rhizosphere at 1 days (a) and 14 days (b) after inoculation of pathogen

2.2.2 番茄根際土壤細(xì)菌多樣性 接種青枯菌和AM真菌對(duì)根際土壤細(xì)菌的Alpha多樣性產(chǎn)生顯著影響 (表1)。在接入病原菌第1 天，接種青枯菌處理(TR–AMF和TR+AMF) 根際土壤細(xì)菌的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著降低 (P<0.05)，表明接種青枯菌降低了番茄根際細(xì)菌的多樣性與豐富度，而接種AM真菌未對(duì)細(xì)菌Alpha多樣性產(chǎn)生顯著影響。在接入病原菌第14 天，接種青枯菌處理 (TR–AMF 或 TR+AMF) 細(xì)菌的 Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)增加，與未接種青枯菌處理 (CK和TN+AMF) 處理之間無(wú)顯著差異， 而接種青枯菌處理 (TR–AMF 和 TR+AMF) 的 Faith_pd指數(shù)顯著低于未接種青枯菌處理 (CK和TN+AMF) ，表明青枯菌接種降低土壤細(xì)菌的物種豐富度。同時(shí)，方差分析表明接種AM真菌顯著提高了番茄根際細(xì)菌的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù) (P<0.05)，由此推測(cè)AM真菌有利于提高根際土壤細(xì)菌的多樣性與豐富度。

表1 接種病原菌后1和14天土壤細(xì)菌 OTU 水平上 Alpha 多樣性 (均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)Table 1 Alpha diversity of soil bacteria at OTU level at the 1 and 14 days of inoculation of pathogens (mean ± STDEVP)

基于Bray-Curtis距離矩陣的NMDS分析結(jié)果表明，接入病原菌第1 天，接種青枯菌處理 (TR–AMF和TR+AMF) 與未接種青枯菌處理 (CK和TN+AMF)的根際土壤細(xì)菌群落在NMDs 1軸上分離且出現(xiàn)顯著性 (r = 0.669，P<0.01) (圖 4a)，表明接種青枯菌顯著影響了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；在接入病原菌后第14 天，接種青枯菌處理 (TR–AMF和TR+AMF) 與未接種青枯菌處理 (CK和TN+AMF) 的根際土壤細(xì)菌群落在NMDs 1軸上分離但無(wú)顯著性 (圖4b)，接種AM真菌對(duì)番茄根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響不顯著。

圖4 接入病原菌第1天(a)和第14天(b)番茄根際細(xì)菌群落基于OTU水平的NMDS分析Fig. 4 NMDS analysis of soil bacterial community based on OTU level at 1 days (a) and 14 days (b)after inoculation of pathogen

2.2.3 番茄根際細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析 基于番茄根際細(xì)菌群落的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)變化，進(jìn)一步探究接種青枯菌和AM真菌對(duì)番茄根際土壤細(xì)菌群落的影響 (圖5)。在接入病原菌第1 天 ，TR處理的細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)相比于TN處理其節(jié)點(diǎn)數(shù)和連接數(shù)明顯減少，模塊化程度降低 (表2)，表明接種青枯菌減少了細(xì)菌物種之間的相互作用，削弱了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。而TR+AMF處理的細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)相比于TR–AMF處理顯現(xiàn)出更多的節(jié)點(diǎn)數(shù)和連接數(shù)，更高的模塊化程度和更低的聚類系數(shù) (表3)，表明在青枯菌入侵下AM真菌在一定程度上緩解由青枯菌接種引起的細(xì)菌群落穩(wěn)定性的降低。在接入病原菌第14 天，與TN處理相比，TR處理的細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的模塊化程度提高，節(jié)點(diǎn)數(shù)和連接數(shù)增加 (表2)，表明接種青枯菌的處理在試驗(yàn)后期其根際土壤中的細(xì)菌物種之間存在更頻繁的相互作用，土壤細(xì)菌群落的穩(wěn)定性提高。與第1天的結(jié)果一致，接入病原菌第14天共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)表明TR+AMF處理比TR–AMF處理的細(xì)菌群落更加穩(wěn)定，前者的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中顯現(xiàn)出更多的正相關(guān)連接，表明青枯菌入侵下AM真菌促進(jìn)細(xì)菌物種間產(chǎn)生更多的良性互作。

表2 接種和未接種青枯菌的番茄細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)Table 2 Topological properties of bacterial co-occurrence network of tomato inoculated and not inoculated with R. solanacearum

表3 只接種青枯菌和同時(shí)接種青枯菌和AM真菌的番茄的細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)Table 3 Topological properties of bacterial co-occurrence network of tomato inoculated only with R. solanacearum(TR–AMF) and tomato inoculated with both R. solanacearum and AM fungus (TR+AMF)

圖5 接入病原菌第1天(a)和第14天(b)基于番茄根際細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)Fig. 5 Co-occurrence network of tomato rhizosphere bacteria at 1 days (a) and 14 days (b) after inoculation of pathogen

3 討論

3.1 土壤細(xì)菌群落對(duì)接種青枯菌的響應(yīng)

接種青枯菌顯著提高了番茄根際土壤中的病原菌豐度 (P<0.05)，進(jìn)而誘導(dǎo)番茄青枯病的發(fā)生，表明病原菌豐度是引發(fā)青枯病的重要因素之一。除誘發(fā)青枯病外，接種青枯菌導(dǎo)致番茄根際土壤細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列改變。

土壤被認(rèn)為是一個(gè)高度復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，接種青枯菌通過(guò)改變土壤中病原菌的豐度進(jìn)一步影響土壤微生物群落的動(dòng)態(tài)平衡。接種青枯菌導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落組成發(fā)生改變，可能是由病原菌入侵和免疫系統(tǒng)引起的植物根系分泌物的變化推動(dòng)了對(duì)根際微生物的差異性招募[19–20]。番茄接種青枯菌后，在根際富集不動(dòng)桿菌屬 (Acinetobacter)、鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)、溶桿菌屬 (Lysobacter)、假單胞菌屬 (Pseudomonas) 等，其中，某些不動(dòng)桿菌屬可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)從而提高植物對(duì)病原菌的抵抗能力[21–22]；多數(shù)鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬和假單胞菌屬可以分泌胞外酶和多種抗菌化合物拮抗病原微生物，減弱其毒性[22–25]，由此推測(cè)宿主在青枯菌脅迫下招募上述菌屬以提高其抗病性。大量研究同樣表明，植物在病原菌脅迫下可以通過(guò)改變根系分泌物或釋放揮發(fā)性有機(jī)物，在根際招募有益微生物以維持后代或鄰近植物的生存[26–28]。

土著細(xì)菌作為土壤生命的重要組成部分，在青枯菌進(jìn)入土壤時(shí)迅速對(duì)其作出響應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄根際細(xì)菌多樣性指數(shù)在青枯菌接入土壤后顯著下降，但隨著青枯菌接入時(shí)間的增加，番茄根際土壤中的細(xì)菌群落多樣性提高。試驗(yàn)前期細(xì)菌多樣性的降低可能是由病原菌和土著細(xì)菌之間對(duì)生態(tài)位和資源存在競(jìng)爭(zhēng)所導(dǎo)致[17,29]，病原菌入侵導(dǎo)致宿主的根系分泌物的變化同樣會(huì)導(dǎo)致番茄根際細(xì)菌群落多樣性的降低[30–31]；試驗(yàn)后期細(xì)菌群落多樣性的提高可能因?yàn)樗拗髦参飳?duì)病原菌的入侵產(chǎn)生免疫反應(yīng)而在根際招募有益微生物[32–33]。

本研究通過(guò)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)將青枯菌和土壤細(xì)菌之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行量化和可視化[34]。接種青枯菌在試驗(yàn)前期極大的降低了細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的模塊化和復(fù)雜程度，土壤細(xì)菌物種之間的相互作用減弱，進(jìn)一步增加了青枯菌入侵的可能性，共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的簡(jiǎn)化與微生物多樣性的降低和微生物組功能的削弱相關(guān)，這可能導(dǎo)致微生物抑病功能的喪失[17]。與細(xì)菌多樣性的變化相似，番茄根際土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜程度隨著青枯菌接入時(shí)間的增加而提高，推測(cè)是宿主植物在青枯菌脅迫下選擇性招募有益微生物，并促成更加緊密和頻繁的相互作用，從而增強(qiáng)細(xì)菌群落的穩(wěn)定性[35]。

3.2 AM真菌通過(guò)調(diào)控土壤細(xì)菌群落抑制青枯菌的生長(zhǎng)

青枯菌豐度是導(dǎo)致番茄發(fā)病的重要因素，而接種AM真菌可以顯著降低番茄根際土壤中青枯菌豐度 (P<0.05)，在一定程度上抑制青枯菌的生長(zhǎng)進(jìn)而延緩了番茄青枯病的發(fā)展速度，降低其病情指數(shù)。接種AM真菌導(dǎo)致土壤中青枯菌數(shù)量的減少，推測(cè)AM真菌、青枯菌和土壤細(xì)菌群落之間存在復(fù)雜的互作關(guān)系，AM真菌可以通過(guò)調(diào)控土壤細(xì)菌群落抑制青枯菌的生長(zhǎng)。

已有研究表明AM真菌通過(guò)改變宿主根系分泌物的組成，或通過(guò)菌絲為上述菌屬提供了適宜的生態(tài)位以調(diào)控土壤微生物群落組成[15,36]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌提高了青枯菌脅迫下的番茄根際黃桿菌屬 (Flavobacterium)、黃色土源菌屬 (Flavisolibacter)、噬胞菌屬 (Cytophaga) 和苔蘚桿菌屬 (Bryobacter)的相對(duì)豐度。馬超等[37]的研究表明，存在一些特定的黃桿菌屬通過(guò)減少青枯菌凝集素結(jié)合的糖供應(yīng)抑制青枯菌數(shù)量，而某些黃桿菌屬和黃色土源菌屬可以調(diào)節(jié)植物的防御信號(hào)通路和抑制病原菌的生長(zhǎng)和毒性[19,36]；多數(shù)噬胞菌屬和苔蘚桿菌屬通過(guò)分解有機(jī)質(zhì)、利用碳源影響土壤碳循環(huán)，達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)的目的[19,38]。由此推測(cè)在青枯菌脅迫下因接種AM真菌而富集的上述菌屬可能對(duì)降低土壤中青枯菌豐度起重要作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)接種AM真菌在試驗(yàn)后期顯著提高番茄根際細(xì)菌的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，表明AM真菌有利于提高細(xì)菌的多樣性和豐富度。而Artursson等[15]的研究結(jié)果表明AM真菌會(huì)對(duì)土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生影響，在提高宿主植物根際微生物的豐富度及其活性的同時(shí)，增加根際微生物的多樣性[39]，這與我們的研究結(jié)果一致，而細(xì)菌多樣性的提高是抑制病原菌入侵的重要因素之一。

通過(guò)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)量化接種AM真菌對(duì)青枯菌和土壤細(xì)菌之間的關(guān)聯(lián)性的影響。青枯菌入侵下AM真菌可以促進(jìn)番茄根際細(xì)菌物種之間的良性互作，提高細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜程度，在一定程度上緩解由青枯菌導(dǎo)致的土壤細(xì)菌多樣性的降低和穩(wěn)定性的削弱。此外，接種AM真菌的番茄其細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)顯現(xiàn)出更高的連通度和模塊化程度，同樣表明細(xì)菌物種之間存在穩(wěn)定的共生關(guān)系，而高連接度和高模塊化的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，其微生物組可以更迅速的激活植物免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)病原菌的抵抗能力[19]，由此推測(cè)AM真菌通過(guò)調(diào)控土壤細(xì)菌之間的相互作用以提高對(duì)青枯菌的抗性。上述由接種AM真菌所產(chǎn)生的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)差異，可能是由菌根共生過(guò)程中所產(chǎn)生的植物信號(hào)分子、激素和分泌物組成的變化造成的[40]。

4 結(jié)論

感染青枯菌的番茄根際會(huì)富集不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)、溶桿菌屬 (Lysobacter)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)等有益菌屬以提高其抗病性，恢復(fù)細(xì)菌多樣性和群落穩(wěn)定性。接種AM真菌可顯著降低番茄根際土壤中青枯菌的豐度，特別是提高侵染青枯菌后番茄根際的黃桿菌屬 (Flavobacterium)、黃色土源菌屬(Flavisolibacter) 、噬胞菌屬 (Cytophaga) 和苔蘚桿菌屬 (Bryobacter)的相對(duì)豐度，因而抑制土壤中青枯菌的生長(zhǎng)，并通過(guò)提高細(xì)菌的多樣性和豐富度，促進(jìn)番茄根際細(xì)菌物種之間的穩(wěn)定共生和良性互作，從而提高細(xì)菌群落對(duì)青枯菌的抵抗能力。