■袁 磊 宋美玲 周 怡,3 程元秋 黎 葉 邱少卿 趙彥翠

(1.山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院糧油食品學(xué)院，山東煙臺(tái) 264670；2.膠州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266300；3.青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司，山東青島 266319；4.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264025)

刺參（Apostichopus japonicus）是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，其養(yǎng)殖產(chǎn)量由2004 年的53 315 噸增加到2020 年的196 564 噸[1-2]。刺參養(yǎng)殖產(chǎn)量的快速增長(zhǎng)的同時(shí)，養(yǎng)殖過(guò)程中其疾病也頻發(fā)，例如：腐皮綜合癥、腫嘴病、排臟綜合癥等疾病[3-6]，嚴(yán)重威脅刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展。在刺參疾病防治中，雖然抗生素的效果不錯(cuò)，但抗生素會(huì)使刺參免疫系統(tǒng)更加脆弱，增加了攻毒后刺參的死亡率[7]，同時(shí)濫用抗生素引起抗生素殘留、耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)等相關(guān)問(wèn)題[8-11]，因此許多研究者將研究重點(diǎn)放在尋找綠色高效的方法來(lái)防治刺參的疾病，其中益生菌的研發(fā)與應(yīng)用越來(lái)越受到重視[12-21]。

益生菌是活的、滅活的細(xì)菌細(xì)胞或者是細(xì)菌細(xì)胞的一部分，當(dāng)益生菌通過(guò)飼料或者是養(yǎng)殖水體使用時(shí)，可改善養(yǎng)殖動(dòng)物本身腸道菌群或養(yǎng)殖水體菌群，從而達(dá)到增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物抗病力、提高養(yǎng)殖動(dòng)物健康、促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料利用率、提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)外界刺激的耐受力等目的[22]。乳酸菌是常用的益生菌之一，其代謝產(chǎn)生的酸會(huì)形成一個(gè)不利于食源性致病菌與腐敗菌的生存環(huán)境，代謝產(chǎn)生的過(guò)氧化氫、抗菌蛋白肽等物質(zhì)對(duì)致病菌和腐敗菌發(fā)揮抑制作用[23]，在人和動(dòng)物腸道中可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，形成抗菌生物屏障，提高人與動(dòng)物免疫力。目前，乳酸菌在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究與應(yīng)用較多，但在刺參中應(yīng)用研究較少，已報(bào)道外源性乳酸菌對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫、抗病力的影響[19，24-27]。本研究從刺參腸道中篩選內(nèi)源性乳酸菌菌株入手，在鑒定菌株、探索菌株發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，研究飼料中添加篩選的菌株對(duì)刺參生長(zhǎng)和非特異性免疫的影響，為開(kāi)發(fā)潛在的內(nèi)源性乳酸菌菌株，促進(jìn)刺參養(yǎng)殖綠色可持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離鑒定

自然條件下放養(yǎng)的健康刺參（5頭，平均體重150 g）取自山東東方海洋公司萊州分公司，加冰運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。無(wú)菌條件下，獲得5 頭刺參的腸道，將腸道與0.85%的無(wú)菌生理鹽水按照重量∶體積比=1∶9的比例混合后，用玻璃勻漿器在冰上充分研磨，然后用無(wú)菌生理鹽水按10 倍梯度逐級(jí)稀釋，在MRS 瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）上涂布，MRS培養(yǎng)基用海水配制，25 ℃、厭氧培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落形態(tài)，挑取單菌落劃線分離至長(zhǎng)出單一的單菌落，再挑取單菌落培養(yǎng)，用甘油生理鹽水保種，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)菌提取DNA后，進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增，具體操作步驟參考Govindaraj 等[28]，序列的測(cè)定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

得到的基因序列在Genebank中利用Blast進(jìn)行同源性檢索，獲得同源性較高的細(xì)菌的16S rRNA 基因序列。用ClustalX（1.8）軟件對(duì)從Genbank中獲取細(xì)菌的16S rRNA 基因序列和本實(shí)驗(yàn)中菌株16S rRNA 基因的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，使用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包MEGA4.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和聚類分析，用Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算各序列間的分化距離，其中缺少和不確定的位點(diǎn)在計(jì)算中都被省略。通過(guò)鄰接法（neighbor joining methods）獲得分支的系統(tǒng)樹(shù)，并通過(guò)自檢分析（boostrap），將自檢數(shù)據(jù)集設(shè)為1 000 次，進(jìn)行置信度的檢測(cè)。

1.2 菌株的發(fā)酵條件

1.2.1 初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

調(diào)節(jié)MRS 培養(yǎng)基的初始pH 分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0，按1.0%的接種量，將菌株接種于MRS培養(yǎng)液中（10.0 mL），每個(gè)初始pH設(shè)3個(gè)重復(fù)，搖床培養(yǎng)24 h。以MRS培養(yǎng)基為空白，測(cè)定發(fā)酵菌液在600 nm處的吸光值（OD值）。

1.2.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將菌株按1.0%的接種量，接種于裝有10.0 mL MRS 培養(yǎng)基的試管中，分別放置于15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 ℃下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每個(gè)溫度設(shè)3 個(gè)重復(fù)。36 h后，以MRS培養(yǎng)基為空白，測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm值。

1.2.3 不同的碳源、氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在優(yōu)化培養(yǎng)液（酵母浸粉10.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸鈉2.0 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳2.0 g/L、海水1 000.0 mL）中，分別添加麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖4 種不同的碳源各20.0 g/L，每種碳源設(shè)3 次重復(fù)。在優(yōu)化培養(yǎng)液（蔗糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸鈉2.0 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳2.0 g/L，海水1 000.0 mL）中，分別添加蛋白胨、酵母浸出粉、硝酸銨、硝酸鉀、尿素5種不同的氮源各10.0 g/L，每種氮源設(shè)3次重復(fù)。以1.0%的接種量，將菌株接種于10.0 mL培養(yǎng)基中，25.0 ℃，搖床培養(yǎng)36 h。以液體培養(yǎng)基為空白，測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm值。

1.2.4 碳源、氮源的正交優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平編碼及設(shè)置見(jiàn)表1。將碳源、氮源按正交表L9（34）配比，添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液（磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸鈉2.0 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳2.0 g/L，海水1000 mL）中，以1.0%的接種量，將菌株接種于10.0 mL培養(yǎng)基中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組合重復(fù)3次，25 ℃，搖床培養(yǎng)36 h。以液體培養(yǎng)基為空白，測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm值。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平（g/L）

1.2.5 不同的接種密度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

初始接種菌液的濃度為4.70×105CFU/mL，得出最佳碳源和氮源后，用優(yōu)化培養(yǎng)液（蔗糖20.0 g/L、酵母浸粉10.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸鈉2.0 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳2.0 g/L，海水1 000.0 mL），以0.25%、0.5%、1.0%、2.0%的接種量（對(duì)應(yīng)接種密度分別為1.18×105、2.35×105、4.70×105、9.40×105CFU/mL）分別接種于10.0 mL培養(yǎng)基中，每個(gè)接種密度重復(fù)3次，25 ℃，搖床培養(yǎng)36 h。

1.3 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)與樣本采集

健康刺參購(gòu)買(mǎi)于山東省乳山市一水產(chǎn)公司，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)投喂鼠尾藻粉暫養(yǎng)2 周，每日更換40.0%的海水。根據(jù)乳酸菌的添加量，設(shè)4個(gè)處理：M0（對(duì)照組）、M5、M7、M9，乳酸菌M2-4 的添加量分別為量0、1.0×105、1.0×107、1.0×109CFU/g。每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)放置25個(gè)大小相似的海參[（2.641±0.047）g]。M0組投喂鼠尾藻粉，其余各組在鼠尾藻粉中添加乳酸菌，將各組飼料與一定量的無(wú)菌海水混合后，制成直徑為2～5 mm 的小球，投喂量為刺參體重的1.0%，每天下午18：00 投喂一次，投喂飼料前吸出殘余餌料，更換40%的海水。海水的溫度、鹽度和pH 分別保持在15～18 ℃、30‰～32‰、7.8～8.0。

經(jīng)過(guò)30 d的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將刺參饑餓24 h。從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取6 頭刺參，在無(wú)菌條件下進(jìn)行解剖，收集腸道，去除呼吸樹(shù)，用鑷子排盡殘余的糞便，迅速用0.85%無(wú)菌生理鹽水漂洗腸道，漂洗完畢后，將6頭刺參的腸道合并在一起放在無(wú)菌離心管中為一個(gè)樣品。在無(wú)菌條件下將樣品剪碎，進(jìn)行標(biāo)記并稱重。按照腸道重量∶生理鹽水體積為1∶9 的比例，將腸道和生理鹽水混合，在冰上，用玻璃勻漿器研磨，研磨后用離心管收集勻漿液，勻漿液離心后得到上清液，上清液用于酸性磷酸酶、總一氧化氮合酶、溶菌酶的檢測(cè)。

1.4 指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)每個(gè)處理各重復(fù)中所有刺參進(jìn)行稱重，計(jì)算平均終末體重、刺參增重率和特定生長(zhǎng)率。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間，各組刺參成活率均為100%。

增重率（%）=[（Wt-W0）/W0]×100

特定生長(zhǎng)率（%/d）=[（LnWt-LnW0）/t]×100

式中：Wt和W0——分別為刺參的平均終末體重和平均初始體重（g）；

t——養(yǎng)殖天數(shù)30 d。

1.4.2 非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定

刺參腸道上清液蛋白質(zhì)含量、酸性磷酸酶（ACP）、總一氧化氮合酶（T-NOS）、溶菌酶（LSZ）活力的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所有限公司生產(chǎn)的試劑盒，測(cè)定步驟執(zhí)行試劑盒的操作說(shuō)明。刺參腸道研磨上清液中蛋白質(zhì)的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法；ACP的測(cè)定采用磷酸苯二鈉方法；T-NOS的測(cè)定以精氨酸為底物進(jìn)行測(cè)定；LSZ的測(cè)定采用溶壁微球菌自身對(duì)照法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析方法

所有數(shù)據(jù)使用Excel整理，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)顯著性水平P＜0.05，采用Tukey's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

M2-4 菌落在MRS 平板上呈不透明、圓形、乳白色菌落，菌落濕潤(rùn)，表面光滑、邊緣整齊。經(jīng)過(guò)16S rRNA基因測(cè)序，通過(guò)NCBI-balst進(jìn)行同源性檢索，從中選取6 株與M2-4 相似性較高的菌株（相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列來(lái)源和數(shù)據(jù)庫(kù)存取號(hào)見(jiàn)表2）進(jìn)行聚類分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖1），菌株M2-4 與Lactobacillus rhamnosusstrain LE40b（KP090127.1）聚在一起，因此將菌株M2-4 鑒定為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。

圖1 菌株M2-4的16S rRNA序列聚類分析結(jié)果

表2 16S rRNA基因序列來(lái)源和數(shù)據(jù)庫(kù)存取號(hào)

2.2 菌株的發(fā)酵條件

2.2.1 初始pH對(duì)菌株M2-4生長(zhǎng)的影響

由圖2 可知，在培養(yǎng)液初始pH＜5.5 之前，菌株的生長(zhǎng)量隨著pH的上升而逐漸升高。而當(dāng)培養(yǎng)液初始pH＞5.5 之后，菌株的生長(zhǎng)量則隨著pH 的上升而逐漸降低。當(dāng)培養(yǎng)液的初始pH為5.5，該菌株的生長(zhǎng)量顯著高于pH為1.5、2.5、3.5、4.5、6.5、7.0時(shí)的生長(zhǎng)量（P＜0.05），但與pH 為6.0 時(shí)的生長(zhǎng)量差異不顯著（P＞0.05），所以菌株M2-4的最適pH為5.5～6.0。

圖2 初始pH對(duì)菌株M2-4生長(zhǎng)的影響

2.2.2 溫度對(duì)菌株M2-4生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，20、25 ℃時(shí)菌株M2-4的生長(zhǎng)量顯著高于其他溫度（P＜0.05），而20、25 ℃時(shí)菌株M2-4 的生長(zhǎng)量差異不顯著（P＞0.05），表明菌株M2-4 的最適溫度范圍為20～25 ℃。

圖3 溫度對(duì)菌株M2-4生長(zhǎng)的影響

2.2.3 碳源、氮源對(duì)菌株M2-4生長(zhǎng)的影響

如圖4所示，菌株對(duì)乳糖及麥芽糖的利用能力較弱；對(duì)葡萄糖和蔗糖的利用能力較強(qiáng)。蔗糖為菌株M2-4 的最佳碳源，生長(zhǎng)量顯著高于葡萄糖、乳糖、麥芽糖（P＜0.05）。如圖5 所示，菌株對(duì)尿素、硝酸鉀、硝酸銨3 種無(wú)機(jī)氮源的利用無(wú)顯著差異（P＞0.05）；對(duì)酵母提取物和蛋白胨的利用較高，且顯著高于3種無(wú)機(jī)氮源（P＜0.05）。

圖4 不同碳源對(duì)菌株M2-4生長(zhǎng)的影響

圖5 不同氮源對(duì)菌株M2-4生長(zhǎng)的影響

2.2.4 碳源、氮源的正交優(yōu)化結(jié)果

由表3 可知，最佳組合為A3B2C1，OD 值達(dá)到了0.285，即蔗糖20.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨2.5 g/L。通過(guò)極差分析可知RA＞RB＞RC，各因素影響菌體生長(zhǎng)程度從大到小依次為蔗糖、酵母提取物、蛋白胨。從方差分析P值（見(jiàn)表4）可以看出：蔗糖和酵母提取物對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響顯著（P＜0.05），而蛋白胨對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響不顯著（P＞0.05）。

表3 正交實(shí)驗(yàn)指示結(jié)果

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.2.5 不同的接種密度對(duì)菌株M2-4生長(zhǎng)的影響

如圖6所示，當(dāng)接種密度為4.70×105CFU/mL 時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量顯著高于1.18×105、2.35×105CFU/mL（P＜0.05），而高接種密度9.40×105CFU/mL 與4.70×105CFU/mL相比并未提高菌株的生長(zhǎng)量（P＞0.05），因此菌株M2-4的最適接種密度為4.70×105CFU/mL。

圖6 不同的接種密度對(duì)菌株M2-4生長(zhǎng)的影響

2.3 乳酸菌M2-4對(duì)刺參生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

由表5 可知，投喂刺參含有乳酸菌M2-4 的飼料30 d 后，實(shí)驗(yàn)組（M5、M7、M9）刺參的增重率、特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組（M0）相比差異不顯著。

表5 飼料中添加乳酸菌M2-4對(duì)刺參生長(zhǎng)的影響

2.4 非特異性免疫指標(biāo)

由表6 可知，投喂刺參含有乳酸菌M2-4 的飼料30 d 后，與對(duì)照組相比，當(dāng)乳酸菌添加量為105、107、109CFU/g 時(shí)，刺參腸道ACP、T-NOS 活力顯著提升（P＜0.05），當(dāng)乳酸菌添加量為105、107CFU/g 時(shí)LSZ活力顯著提高（P＜0.05）。當(dāng)添加量為109CFU/g 時(shí)ACP活力最高，LSZ活力以添加量為107CFU/g時(shí)最高。

表6 飼料中添加乳酸菌M2-4對(duì)刺參腸道免疫酶活性的影響(U/g prot.)

3 討論

隨著飼料全面禁抗，養(yǎng)殖中減抗、限抗，抗生素的替代成為水產(chǎn)養(yǎng)殖研究力求突破的瓶頸。益生菌作為安全、綠色、有效防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病的生物產(chǎn)品，是非常有前景的替抗產(chǎn)品。乳酸菌是在水產(chǎn)養(yǎng)殖上尤其是魚(yú)類[29]和蝦類[30-31]上被廣泛研究和應(yīng)用的一類益生菌。近幾年，乳酸菌在刺參上的應(yīng)用研究也越來(lái)越受到重視。研究表明，刺參健康的養(yǎng)殖池發(fā)現(xiàn)了乳酸菌[32]，刺參發(fā)病池未檢測(cè)到乳酸菌，說(shuō)明乳酸菌對(duì)維持刺參的健康有重要作用。乳酸菌可以促進(jìn)刺參的生長(zhǎng)[19，24-25]、提高其腸道消化酶活力[19，26]、改善刺參腸道菌群[24，26-27]、提高刺參免疫酶活性[24-26]、促進(jìn)相關(guān)免疫基因的表達(dá)[25]、增強(qiáng)其抗病能力[26]。但相對(duì)于魚(yú)類和蝦類上的研究，仍然缺乏刺參內(nèi)源性乳酸菌的開(kāi)發(fā)。本實(shí)驗(yàn)從健康刺參腸道分離出一株內(nèi)源性乳酸菌，通過(guò)16S rRNA 基因測(cè)序及同源性分析將其鑒定為鼠李糖乳桿菌，并初步探明了其發(fā)酵條件包括最適初始pH、適宜溫度、適宜碳源和氮源、氮源和氮源正交、接種密度等，為此菌的后續(xù)研究及其在刺參養(yǎng)殖上應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

該研究發(fā)現(xiàn)在鼠尾藻粉中添加該菌對(duì)刺參的生長(zhǎng)并沒(méi)有顯著提高的作用。這與在飼料中添加嗜酸乳桿菌并未提高刺參生長(zhǎng)[27]的研究結(jié)果一致。也有研究發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖池潑灑商業(yè)乳酸菌制品（屎腸球菌和植物乳桿菌的混合制品）可以明顯促進(jìn)刺參的生長(zhǎng)[24]；植物乳桿菌LL11、糞腸球菌LC3 可以促進(jìn)刺參的生長(zhǎng)[25]；一定量的滅活植物乳桿菌L-137 也可以促進(jìn)刺參的生長(zhǎng)[19]。因此乳酸菌對(duì)刺參的生長(zhǎng)是否有顯著的促進(jìn)作用，可能與乳酸菌的種屬有關(guān)，對(duì)生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可能具有菌株特異性。本養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了30 d，更長(zhǎng)周期的添加實(shí)驗(yàn)有待開(kāi)展，以更全面地驗(yàn)證該株鼠李糖乳桿菌M2-4對(duì)刺參生長(zhǎng)的影響。

刺參的免疫主要依靠非特異性免疫來(lái)抵抗病原的入侵。ACP、NOS、LSZ等酶活力都是反映刺參非特異性免疫能力的重要指標(biāo)。在刺參的免疫體系中起著重要的作用[24]。ACP 作為一種重要的溶酶體酶的組成部分，是溶酶體的標(biāo)志酶，在無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，可以消化入侵生物體的異物[33]。NOS調(diào)控一氧化氮（NO）的生成，NO是動(dòng)物體內(nèi)重要的信使分子、效應(yīng)分子、免疫調(diào)節(jié)分子，參與多種生理活動(dòng)。免疫細(xì)胞受到外源刺激時(shí)，可以誘導(dǎo)NOS的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)生物體合成NO，NO 可以與機(jī)體內(nèi)的超氧陰離子結(jié)合生成過(guò)氧化氮，過(guò)氧化氮是帶有高度毒性的產(chǎn)物，可以通過(guò)非特異性的方式來(lái)殺死入侵機(jī)體的病原，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫能力[34]。LSZ 是一種堿性蛋白，可以通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的肽聚糖從而水解細(xì)菌的細(xì)胞壁，在刺參的非特異性免疫中有著重要作用[35]。和對(duì)照組相比，當(dāng)乳酸菌添加量為105、107、109CFU/g時(shí)，刺參腸道ACP、T-NOS活力顯著提升，當(dāng)乳酸菌添加量為105、107CFU/g時(shí)LSZ活力顯著性提高，這表明該乳酸菌在一定的添加水平上可以通過(guò)提高刺參腸道的ACP、T-NOS、LSZ 活力，從而促進(jìn)刺參對(duì)體內(nèi)異物的分解、促進(jìn)刺參NO 的生成、提高刺參的殺菌能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。

4 結(jié)論

①該研究通過(guò)MRS海水培養(yǎng)基從自然放養(yǎng)的健康刺參腸道中篩選出一株乳酸菌菌株M2-4，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，確定其為鼠李糖乳桿菌。

②該菌株的發(fā)酵條件研究表明：其發(fā)酵最適初始pH 為5.5～6.0；最適發(fā)酵溫度為20～25℃；最適碳源為蔗糖；最適氮源為酵母提取物；最優(yōu)的碳源、氮源組合為蔗糖20.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨2.5 g/L；發(fā)酵最適接種密度為4.70×105CFU/mL。

③在鼠尾藻粉中添加1.0×105、1.0×107、1.0×109CFU/g 乳酸菌M2-4投喂刺參30 d，雖然刺參的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著變化，但刺參腸道ACP、T-NOS、LSZ 活力提高，根據(jù)以上酶活力指標(biāo)判斷該菌在鼠尾藻粉中的適宜添加量為105～107CFU/g。