許 鳳 ，張麗芳 ，蘇 艷 ，蔣亞蓮 ，王麗花 ，瞿素萍 ，張藝萍 ，2

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心/云南省花卉育種重點實驗室/昆明市花卉遺傳改良重點實驗室，云南 昆明650205；2.云南云科花卉有限公司，云南 昆明 650205）

植物組織培養(yǎng)技術(shù)從20 世紀(jì)60年代開始迅速發(fā)展并逐步成熟，大量應(yīng)用于苗木快繁生產(chǎn)。傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)體系，主要包括外植體誘導(dǎo)、繼代、生根培養(yǎng)基的制備，外植體的采集、消毒、接種，外植體成功誘導(dǎo)出不定芽或愈傷組織以后的分化繼代培養(yǎng)，繼代增殖形成的無根芽苗生根培養(yǎng)，煉苗和移栽等技術(shù)環(huán)節(jié)，每個步驟都需要大量的勞動力，成本高、效率低。相對于固體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)是另一種組織培養(yǎng)改進(jìn)的方式，雖然該培養(yǎng)方式便于成本控制，但長時間的液體培養(yǎng)會引起組培苗玻璃化、畸形等問題。

植物間歇浸沒式生物反應(yīng)器的基本原理是在無菌條件下，將無性繁殖材料在培養(yǎng)液中進(jìn)行周期性的浸泡培養(yǎng)，其改進(jìn)了液體培養(yǎng)的方式。在這種培養(yǎng)方式下，植物組織與液體培養(yǎng)基緊密接觸，刺激和促進(jìn)了植物組織對營養(yǎng)元素和激素的吸收；間歇及連續(xù)振動給液體培養(yǎng)基提供了足夠氧氣，提高了組培苗的繁殖系數(shù)。植物間歇浸沒式生物反應(yīng)器主要應(yīng)用于快繁后期繁殖苗和生根苗的培育，其人工耗費是固體培養(yǎng)系統(tǒng)的1/2，成本可降低1/5，促進(jìn)了自動化、機(jī)械化和商業(yè)化的植物快繁技術(shù)發(fā)展。

迄今，國外應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行組織培養(yǎng)成功的植物有香楓[1]、蘋果[2]、菠蘿[3]、挪威云杉[4]、白紋櫟[5]、甘蔗[6]、甜葉菊[7]、香石竹[8]、白楊[9]等，而國內(nèi)的研究開始較晚，主要集中于次生代謝物的生產(chǎn)。與傳統(tǒng)植物組織培養(yǎng)相比，間歇浸沒式生物反應(yīng)器優(yōu)勢明顯，其自動化程度高、生產(chǎn)成本低、組培苗質(zhì)量好、繁殖系數(shù)高、移栽成活率高及適應(yīng)性強(qiáng)。為更好地將該技術(shù)裝備應(yīng)用到植物組織培養(yǎng)中，筆者概述了間歇浸沒式生物反應(yīng)器發(fā)展的階段、參數(shù)設(shè)置及優(yōu)缺點等方面的進(jìn)展。

1 間歇浸沒式培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展

間歇浸沒式培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展大概經(jīng)歷了5 個階段，其中第3、4、5 階段發(fā)展的培養(yǎng)系統(tǒng)目前都還有應(yīng)用，如氣泵驅(qū)動RITA（Recipient for Automated Temporary Immersion）間歇浸沒式培養(yǎng)系統(tǒng)也還在應(yīng)用中，只是在不斷地改進(jìn)中。

1.1 第1 階段

1985年，TISSERAT 等[10]設(shè)計了APCS（Automated Plant Culture System）自動化植物培養(yǎng)系統(tǒng)。整個系統(tǒng)由4 個部分構(gòu)成：植物培養(yǎng)箱、玻璃營養(yǎng)液蓄池、葉輪泵及硅膠運輸管道。該系統(tǒng)由微型計算機(jī)控制，在葉輪驅(qū)動下實現(xiàn)了培養(yǎng)液的定期補充和排干，獲得了與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相同的效果，但避免了繁瑣繼代工作，降低了勞動成本。

1.2 第2 階段

1987年，AITKEN-CRISTIE 等[11]不斷改進(jìn)APCS 培養(yǎng)系統(tǒng)，設(shè)計出一套半自動培養(yǎng)系統(tǒng)，將葉輪泵改為蠕動泵，將玻璃的營養(yǎng)液蓄池改為聚碳酸酯的營養(yǎng)液蓄池。每次液體更新40～60 mL，每周6～7 h；在供應(yīng)營養(yǎng)液時通氣保證了培養(yǎng)物的氧氣需求，比無通氣培養(yǎng)效果更好?；诖?，SIMONTON 等[12]于1991年設(shè)計出一套用于間歇供應(yīng)液體的計算機(jī)控制泵，有4 臺培養(yǎng)容器，用帶孔聚丙烯代替瓊脂培養(yǎng)基，使?fàn)I養(yǎng)循環(huán)實現(xiàn)預(yù)定的設(shè)計。第1、2 發(fā)展階段的培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)周期較長，通氣和補液控制不好會導(dǎo)致污染。

1.3 第3 階段

1993年，ALVARD 等[13]設(shè)計了氣泵驅(qū)動RITA（Recipient for Automated Temporary Immersion）間歇浸沒式培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)由2 個容器構(gòu)成，下面是營養(yǎng)液存儲容器，上面是培育容器，中間連接有管道。當(dāng)氣體進(jìn)入營養(yǎng)液存儲容器時，都要通過0.22 μm 孔徑的濾膜以防止污染。應(yīng)用這一系統(tǒng)對香蕉進(jìn)行培養(yǎng)，與傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)比較，該培養(yǎng)系統(tǒng)的繁殖系數(shù)可提高1 倍，干質(zhì)量可提高1～4 倍[13]。該系統(tǒng)容器體積小，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價格昂貴，限制了其在發(fā)展中國家的推廣。

1.4 第4 階段

1999年，ESCLONA等[14]設(shè)計，后來由TEISSON改進(jìn)命名的間歇浸沒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)（Temporary Immersion Bioreactors System，TIBS）出現(xiàn)，其主要包括空氣壓縮機(jī)、營養(yǎng)液存儲瓶、組培苗培養(yǎng)瓶、硅管、時控開關(guān)、濾膜孔徑0.22 μm 的針頭過濾器、電磁閥、培養(yǎng)架等部分。該系統(tǒng)的基本原理是以空氣壓縮機(jī)所形成的空氣壓力作動力，經(jīng)過濾器除菌將液體培養(yǎng)基由儲存瓶壓入組培苗培養(yǎng)瓶，從而對植物組培苗進(jìn)行間歇浸沒式培養(yǎng)。該系統(tǒng)培養(yǎng)菠蘿苗，以2 min/3 h 的浸沒頻率提供營養(yǎng)，在含多效唑激素的培養(yǎng)基中生長42 d 后，繁殖系數(shù)明顯提高，干、濕質(zhì)量均顯著增加[14]。該系統(tǒng)目前比較常用，但培養(yǎng)周期長且易污染，仍需進(jìn)一步改進(jìn)。

1.5 第5 階段

2010年至今，研究者不斷優(yōu)化之前的設(shè)計。SOLóRZANO 等[15]設(shè)計了一套低成本的氣動臨時浸沒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)有24 個2 L 的水箱。該自動化系統(tǒng)通過設(shè)計的定時器電路執(zhí)行，其設(shè)計參數(shù)設(shè)置為：一是繁殖培養(yǎng)周期，該參數(shù)取決于所培養(yǎng)植物的繁殖周期，由操作員決定何時關(guān)閉系統(tǒng)；二是浸沒頻率，分別設(shè)定了1、2、3、4、5、6、7、8 h 的間隔浸泡時間（對應(yīng)間隔通氣時間）和30、40、50、60、70、80 s 浸泡時間（對應(yīng)壓縮空氣輸送時間）；鳳梨在這種浸沒生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)30 d后繁殖系數(shù)為6.5[15]。

FLOREZ 等[16]設(shè)計了一種新的TIB（Temporary Immersion Bioreactors），一種靜壓驅(qū)動的TIB（Hydrostatic-driven TIB），該設(shè)計的原理是：培養(yǎng)基流入反應(yīng)器是通過相對于培養(yǎng)容器升高培養(yǎng)基貯槽來實現(xiàn)的。其特點是定期升降培養(yǎng)基貯槽的高度可以保持植物組織臨時浸入，而不需要大量的氣體來壓入培養(yǎng)基。利用含氧量較高（40%）的氣體混合物可使植物發(fā)狀根培養(yǎng)物的生長速度加倍，并且補充二氧化碳可提高無籽西瓜分生組織培養(yǎng)物的光合能力。該系統(tǒng)的總體設(shè)計力求實現(xiàn)功能多樣性、可擴(kuò)展性和最低成本等。面對日益增長的糧食需求、資源減少和環(huán)境退化等問題，生物反應(yīng)器技術(shù)在提高植物生產(chǎn)力方面發(fā)揮著越來越大的作用。

2 間歇浸沒式生物反應(yīng)器相關(guān)參數(shù)設(shè)置的研究進(jìn)展

與傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)類似，由于培養(yǎng)基的成分、激素組成和水平、蔗糖濃度、pH 值等各種培養(yǎng)條件不同，利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的效果存在差異。此外，間歇頻率、浸沒時間、培養(yǎng)器容積、接種密度等參數(shù)對應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的效果也有很大影響。

2.1 浸沒頻率和培養(yǎng)時間

不同植物種類對浸沒頻率和浸沒時間的要求是不一樣的。如果浸沒頻率大，組培苗就容易發(fā)生玻璃化；但如果浸沒頻率小，就會影響植株的營養(yǎng)吸收，對其生長有影響。同樣，間歇浸沒時間太短也會影響植株的正常生長；浸沒時間太長，組培苗會因氧氣缺乏而產(chǎn)生玻璃化、畸型等現(xiàn)象。因此，在應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器繼代1 個物種之前，必須先測試其適宜的間歇頻率。

ZHU 等[17]在培養(yǎng)蘋果生根苗時發(fā)現(xiàn)，每天浸沒16 次比浸沒8 次的效果更好。ALVARD 等[13]在利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器對香蕉組培苗培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，浸沒頻率為每周2 次比每周1 次的效果更好。浸沒時間是間歇式浸沒培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一，對培養(yǎng)效率起決定性作用。ALBARRáN 等[18]在研究咖啡間歇浸沒培養(yǎng)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，15 min/4 h 的浸沒頻率會產(chǎn)生90%的玻璃化苗；而1 min/4 h 的浸沒頻率可以形成大量魚雷胚，無玻璃化苗，75%的苗可以再生為完整植株。廉美蘭等[19]在利用間歇浸沒系統(tǒng)研究辰星草快繁時發(fā)現(xiàn)，其生長分化最理想的間歇頻率是每隔2 h 供給1 h 的培養(yǎng)基。JOVA 等[20]用間歇浸沒式生物反應(yīng)器在多個山藥品種組培快繁的生長過程中發(fā)現(xiàn)，山藥在間歇頻率為10 min/6 h 時，其繁殖率和生長狀況是最理想的。DAMIANO 等[21]在間歇浸沒式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)野生梨和梨時發(fā)現(xiàn)，野生梨最適宜的浸沒時間為30 min/d，梨最適宜的浸沒時間為60 min/d。但也有一些植物種類對浸沒頻率的變化并不敏感。KONGBANGKERD 等[22]對海蔥（Charybdis numidica）進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在5 min/12 h 和5 min/24 h 這2 種頻率下，其芽的再生率并無明顯變化。除浸沒頻率、浸沒時間以外，培養(yǎng)時間對培養(yǎng)效果也有影響。研究發(fā)現(xiàn)，車前草繼代培育6 代之后，繁殖系數(shù)下降十分明顯[12]；菠蘿組培苗在繼代培育7 周內(nèi)的繁殖系數(shù)是最高的，但組培苗的活力明顯下降[23]。

浸泡次數(shù)對幼苗生長發(fā)育也有影響。ZHANG等[5]分析了浸泡次數(shù)對白紋櫟幼苗發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸泡頻率為3 min/2 h 時，可以顯著促進(jìn)假球莖的發(fā)育。GAO 等[24]采用間歇浸沒式生物反應(yīng)器（TIBS）對慈姑的繁殖和生長進(jìn)行研究，結(jié)果表明，較高的浸沒頻率（每6 h 浸沒1 次）和較短的浸泡時間（3、10 min），其繁殖系數(shù)最高為23，顯著高于傳統(tǒng)的半固體培養(yǎng)（3.6）和液體培養(yǎng)（4.5）；而較低的浸泡頻率和較長的浸泡時間（30 min/12 h 和60 min/24 h）其莖尖的玻璃化率和污染率分別為16.6% 和19.0%、42.0% 和37.0%；與傳統(tǒng)的半固體和液體培養(yǎng)相比，TIBS（10 min/6 h）的污染率（8.3%）明顯降低；在含BA 4 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基中，每6 h 浸泡10 min，具有較高的芽繁殖系數(shù)，達(dá)21.6，生根率為100%，成活率為94%。FRóMETA 等[25]對在非洲菊上應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器的浸泡頻率（1 次/6、8、12 h）、額外通風(fēng)和培養(yǎng)時間（14、21、28、35 d）等因素進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每8 h 浸沒加通風(fēng)可增加不定芽數(shù)量且形態(tài)好，每個外植體平均繁殖系數(shù)為9；而每6 h 浸沒處理的嫩枝鮮質(zhì)量和干質(zhì)量較高，但同時水分含量較高；浸沒頻率為每8 h 浸沒1 次和每12 h 浸沒1 次時，枝條的水分含量無顯著差異；額外通風(fēng)（12 min/d）使枝條的水分含量降低到5.24%，而無通風(fēng)處理的為31.37%；每8 h 通風(fēng)一次的枝條鮮、干質(zhì)量降低，相對含水量下降89.8%；每個外植體分化的芽數(shù)量在14 d 時為3.5 個，21 d 時為5.5 個，28 d時為6.7 個，35 d 時為6.1 個。ZHANG 等[26]以半夏為材料，在間歇浸沒式生物反應(yīng)器中對半夏幼苗進(jìn)行了快繁研究，調(diào)查9 種不同的浸液循環(huán)對幼苗增殖、生長和多糖含量的影響，確定最佳浸液循環(huán)為wasIC-6（每12 h 浸5 min）。GAO 等[27]以荸薺球莖和匍匐根莖為材料，采用間歇浸沒式生物反應(yīng)器（TIBS）對其莖尖進(jìn)行繁殖，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)優(yōu)化條件下（15 min/8 h）的繁殖系數(shù)最高，并能降低玻璃化率。

2.2 培養(yǎng)器體積空間

培養(yǎng)容器空間的大小對間歇浸沒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)的繁殖效率影響是很大的。在現(xiàn)實的生產(chǎn)和科學(xué)試驗中，為了減少繼代次數(shù)、提高效率，間歇浸沒式生物反應(yīng)器采用的培養(yǎng)器體積一般為1～20 L，其體積大小遠(yuǎn)大于固體培養(yǎng)基組織培養(yǎng)過程中所用的果醬培養(yǎng)瓶，可以幾個月或10 個月以上才轉(zhuǎn)接1 次。一般而言，在組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)器的體積越大，培養(yǎng)器頂部空間就越大，這樣就能提供足夠的空間給組培苗生長，避免植物組培苗在培養(yǎng)器中過度擁擠，有利于植物組培苗的生長。采用更大的空間，有利于通氣處理，從而改善瓶內(nèi)氣體組成，提高育苗質(zhì)量和繁殖系數(shù)。ESCALONA等[14]在應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)菠蘿苗時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液的體積大小對繁殖速度、濕質(zhì)量及干質(zhì)量也有很大的影響，在生長過程中培養(yǎng)物長大后就會發(fā)生擁擠，培養(yǎng)物的質(zhì)量下降。因此，在間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)中應(yīng)適當(dāng)?shù)財U(kuò)大培養(yǎng)的面積、加大通氣力度及減少對培養(yǎng)植株的空間限制，這樣才能提高繁殖系數(shù)和組培苗質(zhì)量。

2.3 激素

靈活地應(yīng)用激素可以大大提高組培苗繁殖的效率。限制大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵因素在于單位產(chǎn)品成本高，合理使用激素提高繁殖系數(shù)和馴化成活率可大大降低成本。在菠蘿的大規(guī)模組織培養(yǎng)過程中，采用多效唑可提高腋芽的繁殖系數(shù)[14]。在金絲猴屬的植物組織培養(yǎng)過程中，可用噻苯?。═DZ）來提高繁殖系數(shù)，再用其他激素來提高生根率和煉苗成活率[28]。在碟蘭球莖組織培養(yǎng)的不同階段，采用不同激素的培養(yǎng)基可獲得較高的繁殖系數(shù)，降低間歇浸沒式生物反應(yīng)器的培養(yǎng)成本[29]。GAO 等[27]在含有4 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基中應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)荸薺苗時發(fā)現(xiàn)，荸薺芽繁殖系數(shù)最高。

2.4 接種密度

接種密度是影響間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)效果的關(guān)鍵因素之一，不同的植物種類對接種密度的要求是不一樣的。接種密度太低不僅影響到組培苗的繁殖系數(shù)，還會影響到組培苗生長，且浪費培養(yǎng)基，增加生產(chǎn)成本；如果接種密度太大，則會由于苗量過多而導(dǎo)致植株過度擁擠，從而影響組培苗的正常生長，引起組培苗變異，對生產(chǎn)者造成巨大損失。ESCALONA 等[14]使用間歇浸沒式生物反應(yīng)器對菠蘿進(jìn)行組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種密度為5 株/L 時，菠蘿組培苗的繁殖和發(fā)育狀況是最好的。ZHANG 等[26]以半夏為材料，發(fā)現(xiàn)初始接種密度對繁殖系數(shù)和幼苗質(zhì)量也有重要的影響。結(jié)果表明，繁殖系數(shù)、單株鮮質(zhì)量及葉面積隨接種密度的增加而降低。在60 個/L 外植體的接種密度下，每個生物反應(yīng)器的鮮質(zhì)量最高，為762.18 g。較高的接種密度（每升80、100 個外植體）導(dǎo)致植株發(fā)育不良。ZHANG 等[5]分析了接種量對白紋櫟幼苗發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)在TIBS 槽中接種300 株外植體，幼苗在莖粗、株高及葉寬方面的發(fā)育最好，其假鱗莖的發(fā)育也得到了明顯促進(jìn)。

2.5 接種材料的質(zhì)量

與采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行植物組織培養(yǎng)技術(shù)相比，在生物反應(yīng)器體系中，接種材料質(zhì)量好壞也會對植物組培苗的繁殖系數(shù)產(chǎn)生影響。楊柳等[30]在利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)甘蔗時，以第4 代通過半固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)的組培苗為接種材料，甘蔗組培苗的增殖及生根情況較好。ROELS 等使用間歇浸沒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)快速繁殖香蕉時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種材料是第6、7 代香蕉繼代組培苗時，香蕉繁殖系數(shù)較高，生長情況較好[19]。IKRAM-UL-HAQ等[31]使用間歇浸沒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行香蕉組織培養(yǎng)得出的結(jié)論與ROELS 等的結(jié)論類似。

在應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行植株快繁時，要充分考慮應(yīng)用的接種材料，一定要選用繼代次數(shù)少的繁殖苗作為接種材料；其次在培養(yǎng)基配方上也要進(jìn)行充分的篩選，以選擇最適宜的繁殖和生根階段的培養(yǎng)基配方；再次應(yīng)針對不同體積的培養(yǎng)容器篩選適宜的接種密度；最后對浸沒頻率和培養(yǎng)時間也應(yīng)進(jìn)行充分研究。

3 間歇浸沒式生物反應(yīng)器擴(kuò)繁植物的優(yōu)勢

應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)植株的優(yōu)勢是很明顯的，主要體現(xiàn)在3 個方面。

3.1 繁殖的組培植株質(zhì)量好且繁殖系數(shù)高

在間歇浸沒式生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)物間歇浸沒于液體培養(yǎng)基和間歇性處于通氣環(huán)境。氣液交替和干濕交替，避免和減少了液體培養(yǎng)產(chǎn)生畸形苗和玻璃化苗等不良生長狀態(tài)，改善培養(yǎng)植株的葉綠素含量、凈光合率及蒸騰速度等生理指標(biāo)，組培植株生長得更好[32]。間歇浸沒培養(yǎng)能提供足夠的營養(yǎng)和氧氣，減少培養(yǎng)環(huán)境中不利氣體的積累。例如，ROELS 等[33]在研究芭蕉的浸沒培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，間歇浸沒式生物反應(yīng)器可以大大減少培養(yǎng)空間中二氧化碳（5.7%）和乙烯（0.06 μL/L）的濃度，從而保證芭蕉小植株能快速生長，且品質(zhì)較好；而在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)芭蕉，二氧化碳和乙烯濃度分別達(dá)到最大值12%和0.45 μL/L。在半固體培養(yǎng)基上最低氧濃度為15.1%，而間歇浸沒式生物反應(yīng)器中氧濃度更高，為19.3%。間歇浸沒式生物反應(yīng)器中芭蕉繁殖系數(shù)為6.4，而在半固體培養(yǎng)條件下為4.3，芽高（4.3 cm 與3.3 cm 相比）和葉數(shù)（2.6 與1.6 相比）也是如此。而且在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的畸形苗較多。利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器繼代培養(yǎng)芭蕉苗，可以明顯減少芭蕉苗的繼代接種次數(shù)，更新培養(yǎng)基相對容易，繼代材料能長時間生長于一致的繼代培養(yǎng)環(huán)境及培育狀態(tài)，明顯提高芭蕉繁殖苗的培養(yǎng)質(zhì)量及繁殖系數(shù)，進(jìn)一步提升了芭蕉產(chǎn)量[34-35]。

KIM 等[2]比較了傳統(tǒng)的固體、液體、間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)脫毒蘋果幼苗的效果，發(fā)現(xiàn)蘋果植株鮮質(zhì)量以間歇浸沒式體系最高，枝條最長，約為固體培養(yǎng)的2 倍；蘋果根系最長，根數(shù)也高于固體培養(yǎng)；植株的總莖面積最大，為1.46 mm2；同時間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的脫毒植株，且植物莖中次生木質(zhì)部發(fā)育良好。MAMUN 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，挪威云杉（Picea abiesL.）在生物反應(yīng)器中的產(chǎn)量比在固體培養(yǎng)基中高3～5 倍。MARZIEH 等[8]比較了間歇浸沒式生物反應(yīng)器（TIB）和固體培養(yǎng)康乃馨的效果，研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用3 mg/L 6-芐氨基嘌呤（BAP），在TIB 中的新芽數(shù)為14.3 個，但在相同處理下固體培養(yǎng)基上的新芽數(shù)為5.7 個；在TIB 中使用3 mg/L BAP，康乃馨的初始鮮質(zhì)量在15 d 后從10 g 增加到450 g；在TIB 中的芽產(chǎn)量是固體培養(yǎng)基的10 倍以上；通過應(yīng)用1 mg/L 吲哚丁酸（IBA），在TIB 中成功誘導(dǎo)康乃馨苗生根，與固體培養(yǎng)中的生根苗相比，TIB 中的根數(shù)最多（4.6 條）和根長度最高（6.87 cm）。EDWARD 等[9]利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行樹木類的快繁時發(fā)現(xiàn)，與固體培養(yǎng)基相比，在間歇浸沒式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)外植體可顯著提高桉樹和白楊的繁殖率和鮮質(zhì)量，但對毛樺木則無顯著影響。

3.2 高效生產(chǎn)代謝物

甜葉菊因含有低熱量的糖苷甜味劑而有益于糖尿病的治療，其自然繁殖和營養(yǎng)繁殖效率低下。通過甜葉菊的離體繁殖技術(shù)生產(chǎn)天然甜味劑有望解決此問題，但其增殖率和再生率較低。KAREL等[7]比較了甜葉菊在半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基及生物反應(yīng)器中的生物量和甜菊糖苷的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)21 d 時，生物反應(yīng)器中的再生苗形態(tài)質(zhì)量最好，且其鮮質(zhì)量和干質(zhì)量比在液體或半固體培養(yǎng)基中高7 倍以上。生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的甜菊糖苷的總含量也較高。PRAMITA 等[36]研究生長調(diào)節(jié)劑和浸沒頻率對平臥菊三七在間歇浸沒式生物反應(yīng)器中生物量和黃酮類化合物產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)在浸沒頻率為15 min/12 h 的條件下，結(jié)合MS+IAA 2 mg/L+BA 8 mg/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，可獲得最高的黃酮類化合物產(chǎn)量。

3.3 移栽馴化的再生植株品質(zhì)好

用間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的植株比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的植株更容易馴化移植成活。ACANDA 等[37]將肖竹芋生根苗在有遮陰設(shè)施的溫室中移栽馴化生長一段時間后發(fā)現(xiàn)，與固體培養(yǎng)基培養(yǎng)相比，間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的植株光合速率高，其葉面積、鮮質(zhì)量及干質(zhì)量都明顯增加。ARAGO 等[38]選擇了間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)和半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的芭蕉植株進(jìn)行移栽馴化，并比較了2 種培養(yǎng)體系的離體葉片解剖結(jié)構(gòu)、離體光合行為和生長情況，結(jié)果表明，與半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的植株相比，間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的植株葉片葉綠體和薄壁組織較厚，氣孔密度較低，表皮蠟質(zhì)較多，因此，推測可能是激活了自身的抗氧化防護(hù)系統(tǒng)，能夠抵御移植環(huán)境所帶來的威脅；半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的植株葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm值始終低于間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的植株；間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的植株移栽后第7 天葉片F(xiàn)v/Fm 值下降至0.65，之后迅速上升至0.76；而半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的植株葉片F(xiàn)v/Fm 值在移栽后第7 天下降至0.27，在第35 天緩慢上升至0.68；在離體馴化過程中，間歇浸沒式生物反應(yīng)器植株的光合速率明顯高于半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)植株；間歇浸沒式生物反應(yīng)器的植株葉面積、鮮質(zhì)量及干質(zhì)量均高于半固體培養(yǎng)基的植株。

對移植田中的RITA 培養(yǎng)的香蕉再生植株進(jìn)行生長調(diào)查，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)植株相比，在田中生長的初期，植株的莖粗、高度等參數(shù)有一定差異，但隨著種植時間的延長而逐漸消失[39]。通常，RITA 生物反應(yīng)器生產(chǎn)的組培苗在移栽后不會發(fā)生表型變異，可能與利用RITA 培養(yǎng)植株時所用的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度低和培養(yǎng)周期短等有關(guān)[40-41]。

HUGO 等[42]在半固體（SS）培養(yǎng)基、RITA 生物反應(yīng)器和雙瓶式間歇浸沒型生物反應(yīng)器（TIS）中培養(yǎng)油棕魚雷階段的體細(xì)胞胚，而后評價再生植株在溫室中的適應(yīng)性，結(jié)果表明，當(dāng)體細(xì)胞胚在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)大約90 d 后，統(tǒng)計再生植株的數(shù)量與質(zhì)量，TIS 系統(tǒng)培養(yǎng)的生物量積累最大，再生的植株有36% 高于2.5 cm，在溫室移栽成活率約為82%，且適應(yīng)性好，而在SS 和RITA 系統(tǒng)中再生的植株約有15%高于2.5 cm。GAO 等[27]比較了在間歇浸沒式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的荸薺植株和在半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的植株移栽到溫室后的生長情況，發(fā)現(xiàn)間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的荸薺植株具有較好的適應(yīng)能力，能產(chǎn)生更多的匍匐根莖（5.0～5.8 根），而半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的植株產(chǎn)生的匍匐根莖要少一些（4.2～4.8 根），意味著間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的植株產(chǎn)量將會增加。

應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)植株可實現(xiàn)植株的快速繁殖，繁殖效率大大提升，且植株品質(zhì)明顯提高，如玻璃化苗和畸形苗減少，產(chǎn)量增加，抗性增強(qiáng)，適應(yīng)環(huán)境的能力加強(qiáng)，更容易馴化成活。

4 間歇浸沒式生物反應(yīng)器的缺點及其對策

應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行植物組織培養(yǎng)也存在一定的局限性，如不是所有的植物種類都可以應(yīng)用該系統(tǒng)；由于培養(yǎng)的時間長，控制不好就會導(dǎo)致全部污染，但諸多研究也在嘗試解決污染的方法。

4.1 并不適用所有物種

不同栽培物種對間歇浸沒的生長要求各不相同，大多數(shù)在間歇式浸沒生物反應(yīng)器的培育中可以生長得很好，但也有一些物種在間歇浸沒期間不能生長得很好，反而在持續(xù)浸沒中生長會更好。FEUSER 等[43]對馬鈴薯組培苗進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與持續(xù)半浸沒相比，幼芽在間歇浸沒式生物反應(yīng)器中生長較好，但是芽的連續(xù)生長、繁殖發(fā)育速度較慢，因此，培養(yǎng)費用相對來說更高。

4.2 污染限制其推廣

在單瓶生物反應(yīng)器進(jìn)行組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，采用更大的營養(yǎng)液容器和利用蠕動泵或其他動力機(jī)械提供營養(yǎng)，由于污染難以控制而導(dǎo)致失敗?，F(xiàn)在一般采用雙瓶培養(yǎng)，進(jìn)出營養(yǎng)液均經(jīng)過嚴(yán)格的無菌化過濾，但培養(yǎng)過程仍未脫離無菌環(huán)境，大規(guī)模的應(yīng)用還是會受到污染的限制，如桉樹的生物反應(yīng)器（RITA）培養(yǎng)桉樹初代苗污染率就達(dá)到100%[44]。

常用的防污方法是消毒外植體后，將抗生素加入到培養(yǎng)基中，抗生素類藥劑主要有Plant preservative mixture（PPMTM）、Vitrofural（G-1）和納米銀（silver nanoparticles，AgNPs）等[45-47]。G-1和PPMTM在培養(yǎng)基中可以明顯地抑制污染，還會促進(jìn)植物的生長。試驗表明，G-1 能夠顯著提高培育苗的質(zhì)量，替代高溫滅菌，還節(jié)省勞力。PPMTM在多種植物微繁過程中也有應(yīng)用。崔剛等[48]對葡萄進(jìn)行了開放性試驗，發(fā)現(xiàn)抑生劑可以代替高溫處理和無菌操作，在不影響植物生長的情況下，將污染限制在10%左右。HVOSLEFEIDE 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，pH 值的迅速變化可作為植物組織培養(yǎng)是否受污染的標(biāo)示參數(shù)。一般來說，在組織培養(yǎng)初期，pH 值總會下降，因為細(xì)胞會首先使用任何銨離子，從而釋放H+離子到培養(yǎng)基中。隨后，培養(yǎng)基中的銨離子耗盡，細(xì)胞代謝將改變?yōu)槭褂孟跛猁}離子并釋放OH 離子來交換帶負(fù)電荷的硝酸鹽，所以，導(dǎo)致pH 值上升。但在生物反應(yīng)器中，pH 值會提前開始上升，其原因可能是由于生物反應(yīng)器中培養(yǎng)物的增長更快。與硝酸鹽相比，銨的吸收導(dǎo)致pH 值的降低更快；當(dāng)細(xì)胞開始吸收硝酸鹽離子時，銨離子消耗得更快。因此，在間歇浸沒式生物反應(yīng)器中，污染的物質(zhì)能迅速消耗營養(yǎng)液中的銨離子，從而使pH 值明顯上升。MARIEM 等[50]研究發(fā)現(xiàn)，添加植物防腐劑混合物能有效控制鞘氨醇單胞菌的繁殖。

4.3 多應(yīng)用于組培苗

大多數(shù)研究主要采用固體培養(yǎng)的組培苗進(jìn)行間歇浸沒式生物反應(yīng)器的培養(yǎng)，但對細(xì)胞和體胚的培養(yǎng)較少，反應(yīng)器還需要進(jìn)一步完善和精細(xì)化。2005年，ANNE 等[51]對體胚微繁生物器進(jìn)行了設(shè)計試驗，對容器內(nèi)的微環(huán)境進(jìn)行了調(diào)整優(yōu)化，促進(jìn)了體胚細(xì)胞的繁育。

在應(yīng)用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時，要選擇適宜該系統(tǒng)的植物種類，同時可以探索該系統(tǒng)在細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化體系中的應(yīng)用。

5 展望

間歇浸沒式生物反應(yīng)器技術(shù)是植物組織培養(yǎng)研究的新熱點。該技術(shù)體系與傳統(tǒng)的固體和液體培養(yǎng)方式相比較，顯著提高了繁殖效率，節(jié)省了成本，通過該技術(shù)培養(yǎng)的生根植株在溫室馴化和移栽中成活率明顯增加，已在多種植物的繁育、突變體篩選等方面應(yīng)用。目前，RITA 和TIBS 的間歇浸沒式生物反應(yīng)器是應(yīng)用較為普遍的類型，這2 種系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化，能更廣泛地應(yīng)用于植物種苗的工廠化生產(chǎn)中。同時在應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時，還可以考慮固體培養(yǎng)和生物反應(yīng)器培養(yǎng)相結(jié)合，先利用固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)外植體，再將繼代苗接種至間歇浸沒式生物反應(yīng)器中進(jìn)行快速繁殖和生根，這樣可以充分發(fā)揮間歇浸沒式生物反應(yīng)器的優(yōu)勢。