劉 永 ，李子健 ，閆世雄 ，孫大衛(wèi) ，付 晶 ，段竹青

（1.云南開放大學 云南鄉(xiāng)村振興教育學院，云南 昆明 650101；2.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201；3.云南省畜牧獸醫(yī)科學研究院 草食家畜研究所，云南 昆明 650224；4.云南省安全生產(chǎn)技術(shù)中心，云南 昆明 650041）

禽白血病（AL）是由禽白血病病毒（ALV）和禽肉瘤病毒（ASV）群引起的造血組織中某些細胞成分增生為主的腫瘤性傳染病的統(tǒng)稱[1-3]，已列入我國二類動物疫病[4]。ALV 感染雞群后，會導致雞群發(fā)生腫瘤性疾病，更重要的是會造成患病雞群生產(chǎn)能力和免疫力降低，嚴重影響蛋雞產(chǎn)蛋質(zhì)量和肉雞生長，嚴重威脅家禽業(yè)的健康、持續(xù)、高效發(fā)展?，F(xiàn)階段還沒有治療AL 的方法，只能通過ELISA 檢測法[6]檢測病原，淘汰AL 陽性雞來凈化種群[5]。隨著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展以及科研、生產(chǎn)的需要，研究防治AL的方法將是今后養(yǎng)禽業(yè)的重要任務(wù)之一[7]。

在人類醫(yī)學上，中草藥治療白血病已被臨床應(yīng)用[8-9]，如金銀花、蒲公英、紫花地丁等[8]。免疫是機體對自身和非自身的識別，清除非自身的大分子物質(zhì)，保證機體平衡的一種生理學反應(yīng)。免疫分子是免疫應(yīng)答的具體執(zhí)行者，主要有膜表面抗原受體、主要組織相容性復合物抗原、白細胞分化抗原、黏附分子、抗體、補體、細胞因子、抗原等[10]?？贵w又稱免疫球蛋白（Ig），是免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B 細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白[11-13]，是衡量機體免疫功能的重要指標。禽類已證實的免疫球蛋白有IgG、IgM 和IgA等3 種，其中IgG 是體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，在血清中含量最高，具有吞噬、凝集、沉淀抗原以及中和病毒和毒素的作用。IgA 是黏膜免疫反應(yīng)產(chǎn)生的主要效應(yīng)分子，在機體的防御機制中發(fā)揮重要作用。IgM 是B 細胞表面表達最早的抗體，也是B細胞分化過程中主要的表面標志[14-15]。補體是一組有酶活性的球蛋白，激活、調(diào)控補體的各成分以及補體受體統(tǒng)稱為補體系統(tǒng)[16]。補體系統(tǒng)是具有重要生物學意義的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)[17]。C3、C4 是補體系統(tǒng)中的固有成分。C3 在補體激活中起重要作用，其高低與總補體的含量相平行，通過測定C3 可反應(yīng)血清總補體水平[18]。C4 在經(jīng)典途徑的活化階段起著重要作用[19]。C3、C4 是衡量體液免疫的重要指標。

本研究選擇了已證明具有增強免疫力和提高抗病毒能力的13 味中草藥按一定比例配合，添加到飼料中進行飼喂，統(tǒng)計AL 陽性雞成活率、免疫球蛋白IgG、IgA，補體C3、C4 含量，以尋求最佳的提高武定雞免疫力和抗病毒能力，抑制（或治療）白血病的復方中草藥配方。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 供試動物選用云南農(nóng)業(yè)大學教學實習雞場孵化的通過ELISA 胎糞檢測為AL 陽性的220 羽武定雞。

1.1.2 試驗藥材 增加免疫力復方：黃芩、黨參、黃精、何首烏、雞血藤、白術(shù)等6 味中草藥（云南廣昆堂農(nóng)業(yè)科技有限公司）。

抗病毒復方：板藍根、連翹、魚腥草、穿心蓮、大青葉、黃芩、黃連等7 味中草藥（云南廣昆堂農(nóng)業(yè)科技有限公司）。

1.1.3 儀器及試劑盒 Thermo Fisher 全波長多功能酶標儀（美國Thermo 公司），禽白血病抗原ELISA 檢測試劑盒（武漢科前生物股份有限公司），禽免疫球蛋白IgG、IgA 檢測試劑盒（江蘇寶萊生物科技有限公司），禽補體C3、C4 檢測試劑盒（江蘇寶萊生物科技有限公司）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗雞于云南農(nóng)業(yè)大學教學實習雞場飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至90日齡，采集血液進行AL 復檢，根據(jù)陽性情況，選擇體質(zhì)相近的180 羽雞分為6 組（對照組、劑量1、劑量2、劑量3、劑量4、劑量5）進行試驗。復方中草藥分別由增強免疫力配方及提高抗病毒能力配方復合而成，其配方如表1 所示。

表1 復方中草藥的配方Tab.1 Compound Chinese herbal formulas%

對照組在整個試驗期間飼喂基礎(chǔ)日糧，5 個試驗組分別按0.2%增免疫+0.2%抗病毒（劑量1）、0.4%增免疫+0.4%抗病毒（劑量2）、0.6%增免疫+0.6%抗病毒（劑量3）、0.8%增免疫+0.8%抗病毒（劑量4）、1%增免疫+1%抗病毒（劑量5）在飼料中添加復合中草藥飼喂。

整個試驗期的飼養(yǎng)根據(jù)云南農(nóng)業(yè)大學教學實習雞場飼養(yǎng)管理規(guī)范進行，按常規(guī)免疫接種，自由采食和飲水，定時觀察雞群健康狀況，做好日常記錄工作。試驗期飼糧根據(jù)中國雞飼養(yǎng)標準（1986年）及參照美國NRC 飼養(yǎng)標準配制，如表2 所示。

表2 日糧營養(yǎng)水平Tab.2 Dietary nutrient level

在飼料中添加復方中草藥飼喂0月（90日齡）、1月（120日齡）、2月（150日齡）、3月（180日齡）、4月（210日齡）后測定體質(zhì)量并進行翅下采血，測定AL 抗原含量及血液免疫指標C3、C4、IgA、IgG含量。

1.3 測定項目及方法

AL 抗原含量和血液免疫指標補體C3、C4 以及免疫球蛋白IgA、IgG 含量的測定按照檢測試劑盒生產(chǎn)廠商提供的說明書進行操作。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2013 和SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復方中草藥飼喂武定雞的體質(zhì)量分析

不同日齡不同組別間體質(zhì)量比較如圖1 所示。

圖1 不同日齡不同組別間體質(zhì)量比較Fig.1 Comparison and analysis of body weight among different groups at different days

從圖1 可以看出，復方中草藥添加飼喂0月（90日齡）、1月（120日齡）、2月（150日齡）、3月（180日齡）、4月（210日齡）和對照組體質(zhì)量相比，飼料中添加復合中草藥飼喂對試驗雞生長無明顯影響。

2.2 復方中草藥飼喂武定雞的補體C3 含量分析

不同日齡不同組別間血清中C3 含量比較如圖2 所示。

圖2 不同日齡不同組別間血清中C3 含量比較Fig.2 Comparison of C3 content in serum among different groups at different days

由圖2 可知，飼料中按不同劑量添加復合中草藥飼喂試驗雞后，血清中C3 含量變化情況，相同日齡各處理組與對照組間，120、150、180、210日齡各劑量組血清中C3 含量均低于對照組，且120日齡劑量1 組血清中C3 含量顯著低于對照組（P＜0.05），劑量2 組210日齡血清中C3 含量顯著低于對照組（P＜0.05）。相同日齡不同處理組間，120日齡劑量2 組血清中C3 含量顯著低于劑量1 組（P＜0.05）。相同處理組不同日齡間，對照組和劑量1 組120日齡血清中C3 含量極顯著高于150日齡（P＜0.01），劑量3 組210日齡血清中C3 含量顯著高于120日齡（P＜0.05），且除劑量3 組，外其他各組別血清中C3含量隨著日齡的增加均呈先下降后上升的趨勢。

2.3 復方中草藥飼喂武定雞的補體C4 含量分析

由圖3 可知，飼料中按不同劑量添加復合中草藥飼喂試驗雞后，血清中C4 含量變化情況，相同日齡各處理組與對照組間，120、150、180、210日齡各劑量組血清中C4 含量均低于對照組，且120日齡劑量2 組血清中C4 含量顯著低于對照組（P＜0.05）。相同日齡不同處理組間，120、150、180、210日齡各劑量組血清中C4 含量無顯著差異（P＞0.05）。相同處理組不同日齡間，劑量4 組120日齡血清中C4 含量顯著高于150日齡（P＜0.05），且各組別血清中C4 含量隨日齡的增加均呈先下降后上升的趨勢。

圖3 不同日齡不同組別間血清中C4 含量比較Fig.3 Comparison of C4 content in serum among different groups at different days

2.4 復方中草藥飼喂武定雞的免疫球蛋白IgA 含量分析

從圖4 可以看出，飼料中按不同劑量添加復合中草藥飼喂試驗雞后，血清中免疫球蛋白IgA 含量變化情況，相同日齡各處理組與對照組間，120、150、180、210日齡各劑量組血清中免疫球蛋白IgA含量均低于對照組，且120日齡劑量1 組血清中免疫球蛋白IgA 含量顯著低于對照組（P＜0.05），210日齡劑量2 組血清中免疫球蛋白IgA 含量極顯著低于對照組（P＜0.01）。相同日齡不同處理組間，210日齡劑量3 組血清中免疫球蛋白IgA 含量極顯著高于劑量2 組（P＜0.01）、顯著高于劑量5 組（P＜0.05）；180日齡劑量3 組血清中免疫球蛋白IgA 含量顯著高于劑量5 組（P＜0.05）。相同處理組不同日齡間，劑量2 組120日齡血清中免疫球蛋白IgA 含量極顯著高于210日齡（P＜0.01），劑量5 組150日齡血清中免疫球蛋白IgA 含量顯著高于210日齡（P＜0.05）。

圖4 不同日齡不同組別間血清中IgA 含量比較Fig.4 Comparison of IgA content in serum among different groups at different days

2.5 復方中草藥飼喂武定雞的免疫球蛋白IgG 含量分析

不同日齡不同組別間血清中IgG 含量比較如圖5 所示。

圖5 不同日齡不同組別間血清中IgG 含量比較Fig.5 Comparison and analysis of IgG content iin serum among different groups at different days

從圖5 可以看出，飼料中按不同劑量添加復合中草藥飼喂試驗雞后，不同處理組血清中免疫球蛋白IgG 含量變化情況，相同日齡各處理組與對照組間，除180日齡外，120、150、210日齡各劑量組血清中免疫球蛋白IgG 含量均低于對照組，且120日齡劑量2 組血清中免疫球蛋白IgG 含量顯著低于對照組（P＜0.05）。相同日齡不同處理組間，180日齡劑量1 組血清中免疫球蛋白IgG 含量顯著高于劑量2 組（P＜0.05）。相同處理組不同日齡間，對照組120日齡血清中免疫球蛋白IgG 含量極顯著高于180日齡（P＜0.01），劑量3 組120日齡血清中免疫球蛋白IgG 含量顯著高于180日齡（P＜0.05）。

2.6 復合中草藥抑制家雞白血病的效果

從表3 可以看出，在添加復合中草藥飼喂試驗雞4 個月后，劑量1、2、3 組成活率均不同程度高于對照組，且劑量2 組成活率達93%；劑量2、3 組出現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象，說明該復合中草藥配方具有增強武定雞免疫力和抗病毒能力，抑制（或治療）AL 的效果。

表3 復合中草藥抑制家雞白血病效果Tab.3 Inhibitory effect of compound Chinese herbs on avian leukemia%

3 結(jié)論與討論

AL 是威脅家禽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一，是一種有脂囊膜的反轉(zhuǎn)錄病毒[20]，可分類為A～J 10 個亞群[21]。其中，A～E 和J 亞群主要感染雞；尤其是感染J 亞群之后，家禽通常會多發(fā)腫瘤、腎病和成紅細胞增多等病癥，最終導致生長延遲、免疫耐受，甚至死亡[22]。ALV 會引起禽類免疫器官出現(xiàn)障礙等[23-24]，導致喪失免疫功能，降低抗病毒能力。

中草藥有藥源廣泛、遺傳毒性低等優(yōu)點，可在治療同時對機體的功能從根本上進行恢復，增強免疫力和抗病毒能力是當前防治疾病新藥研發(fā)的熱點。如黃芩、黨參、黃精、白術(shù)、板藍根、穿心蓮、大青葉等都具有增強免疫力、提高抗毒能力、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡等作用[25]。免疫球蛋白IgG、IgM 和IgA 是衡量機體免疫功能的重要指標，在機體的防御機制中發(fā)揮重要作用。C3、C4是補體系統(tǒng)中的固有成分，是衡量體液免疫的重要指標。本試驗主要測定了飼料中按不同劑量添加復合中草藥飼喂試驗雞后，血清中免疫球蛋白IgG、IgA 及補體C3、C4 的含量，以揭示在飼料中添加復合中草藥飼喂AL 陽性雞后免疫球蛋白及補體水平的變化，結(jié)果顯示，無論是試驗組還是對照組隨著日齡的增長IgG、IgA 及C3、C4 含量都大致呈現(xiàn)先下降后增長的趨勢，且在180日齡時含量最低。這與何健等[26]給肉鴨飼喂自然霉變玉米，隨著日齡的增加其血液中免疫球蛋白IgG 也隨之增加；馬金萍[27]通過新城疫弱毒苗感染免疫雛雞，與非感染組相比IgA 抗體水平均有所提高；馮焱等[28]研究發(fā)現(xiàn)，免疫亢進組血液免疫指標均不同程度的低于非免疫組和常規(guī)免疫組；QI 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，攻毒沙門氏菌后，北京油雞的IgY、IL-6、TNF-α 血清介質(zhì)水平顯著高于白來航雞的研究結(jié)果一致。從而說明，在機體受到外界病原體感染時，體內(nèi)IgG、IgA、C3、C4 含量會有所提高以抵御病原體感染。本研究中各試驗組IgG、IgA、C3、C4 含量均不同程度低于對照組，可間接說明添加中草藥飼喂后有增強AL 陽性雞免疫能力的作用。

廖呂燕等[30]研究表明，由黃芪、黨參、白術(shù)等制成的中藥多糖能在一定程度上對抗環(huán)磷酰胺所致的免疫損傷。方磊涵等[31]研究表明，由黃芪、黨參、茯苓、麥冬等制成的中藥多糖不僅能促進雛雞的生長，同時能顯著提高雞體內(nèi)的免疫球蛋白及抗體效價，增強雛雞的免疫功能。CHANG 等[32]研究黃連、魚腥草等6 味中藥制成的復方預防小鼠傷寒沙門氏菌感染時發(fā)現(xiàn)，黃連可使血清IgA 水平降低41%。本研究中，飼料中添加不同劑量的復合中草藥組免疫球蛋白IgA、IgG 和補體C3、C4 含量均不同程度的低于對照組，說明本復合中藥配方能夠緩解AL 所造成的免疫機能受損。5 個劑量組中劑量2、3 效果最佳，成活率達93%、86%，且還有轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象，轉(zhuǎn)陰率達7%。說明該復合中藥配方還有抑制（或治療）AL 發(fā)病或者緩解AL 所造成的免疫機能受損的功效。但劑量4、5 組出現(xiàn)了死亡率增加的現(xiàn)象可能是因為中草藥的毒性效應(yīng)，計劃在下步驗證試驗中重點注意添加劑量的控制。

在本試驗中，從120日齡開始隨著日齡的增加免疫球蛋白和補體均表現(xiàn)為先降低后增加的趨勢；試驗組的免疫球蛋白和補體含量均低于對照組。隨著日齡的增長，當達到體成熟時，武定雞的抗病能力最強；本復合中藥配方可以提高AL 感染武定雞的成活率、免疫能力和抗病力；本中草藥配方具有抑制（或治療）武定雞AL 的效果，以劑量2 組（0.4%抗病毒+0.4%增免疫）效果最佳。