屈澤超 王棟馮銘哲 高翔成 張波弓伊寧 孔令擘 閆亮

1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716099 2.西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院脊柱外科，陜西 西安 710054

骨穩(wěn)態(tài)是通過破骨細(xì)胞(osteoclasts，OCs)介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞(osteoblasts，OBs)介導(dǎo)的骨形成來動態(tài)調(diào)節(jié)的，促使骨的各項指標(biāo)及功能在生理范圍內(nèi)保持平衡[1]。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是最常見的骨骼疾病，是一種以骨密度降低，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨病[2]。OP發(fā)病原因主要包括內(nèi)分泌因素、遺傳及免疫因素、營養(yǎng)因素、性別及年齡因素、疾病及藥物因素、失用及環(huán)境因素等[3-4]，其中OCs分化異常是引起OP的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)[5-6]。OCs是起源于造血干細(xì)胞的單核/巨噬細(xì)胞系，受多種激素和局部細(xì)胞因子調(diào)節(jié)分化，其中核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)與巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)是OCs分化的主要關(guān)鍵分子[7]。M-CSF在早期OCs前體細(xì)胞的存活和增殖中起著關(guān)鍵作用[8]。核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)屬于腫瘤壞死因子受體家族蛋白，表達于OCs前體、成熟OCs以及樹突狀細(xì)胞等表面[9]，其分化的關(guān)鍵步驟是OBs產(chǎn)生的RANKL與OCs前體細(xì)胞上受體RANK結(jié)合啟動下游級聯(lián)傳導(dǎo)信號，RANK的胞漿區(qū)募集并活化銜接蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF6)，激活的TRAF6觸發(fā)下游NF-κB、MAPKs、PI3K/AKT、鈣信號和活性氧等通路的活化[7,10-11]。這些信號通路最終導(dǎo)致OCs分化的主要轉(zhuǎn)錄因子NFATc1和c-Fos的表達并引起OCs分化相關(guān)基因，例如OCs相關(guān)受體(osteoclast-associated receptor，OSCAR)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrated resistant acid phosphatse，TRAP)、基質(zhì)金屬肽酶-9(matrix metallopeptidase-9，MMP-9)、OCs刺激跨膜蛋白(osteoclast stimulatory transmembrane protein，OC-STAMP)、整合素β3(integrin β3)和組織蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)等的表達[12]。綜上所述，RANKL是誘導(dǎo)OCs分化的重要調(diào)控因子，其相關(guān)下游信號通路已成為調(diào)控OCs分化形成的潛在靶點，RANKL-RANK信號通路在OCs的形成和功能中起著關(guān)鍵作用。詳見圖1。

圖1 RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化Fig.1 RANKL induced osteoclastogenesis

在過去20年中，用于治療OP的藥物主要有雙膦酸鹽(bisphosphonates，BPs)、雌激素補充療法(estrogen therapy，ET)、甲狀旁腺素類似物(parathyroid hormone analogue，PTHa)和狄諾塞麥等[13]。然而，近年來文獻報道長期使用這些藥物會引起一些不良反應(yīng)，可能不適合作為口服藥物。BPs是目前臨床上治療OP的一線藥物，雖然總體評價較高，但長期使用后會出現(xiàn)急性期反應(yīng)、胃腸道不適和眼部不適等，并在2003年首次提出使用BPs會引起頜骨壞死，同時會增加食管癌的患病率[14-15]。ET已成為治療OP的二線方案，總體上應(yīng)用較安全，但長期使用也會出現(xiàn)雌激素依賴性腫瘤、血栓性疾病和致死性腦卒中等[16]。PTHa是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一種新方法，其不良反應(yīng)主要為嗜睡和腰背四肢痛等，嚴(yán)重會引起骨腫瘤的產(chǎn)生[17]。狄諾塞麥?zhǔn)俏ㄒ猾@批靶向作用于RANKL的拮抗藥，能抑制RANKL與其受體RANK的結(jié)合，減少OCs形成與活化，降低骨吸收，然而文獻報道長期使用會引起高鈣血癥，增加原發(fā)性惡性腫瘤風(fēng)險，同時會出現(xiàn)下頜骨壞死或非典型性股骨骨折[18]。因此，尋找高效低毒的抗骨質(zhì)疏松藥物具有重要的臨床意義和醫(yī)學(xué)價值。近年來，對于天然化合物的研究日益增加，天然化合物主要作用于RANKL誘導(dǎo)OCs分化下游相關(guān)通路，對于OCs的抑制作用還可能在于它們的抗炎和抗氧化特性能夠優(yōu)化骨骼健康。本文旨在總結(jié)RANKL及其下游信號通路在OCs分化中的最新研究進展，為以RANKL為藥物靶點治療OP提供進一步的認(rèn)識。此外，筆者將簡要介紹幾種天然化合物通過調(diào)節(jié)RANKL相關(guān)信號通路而抑制OCs分化及其對骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。

1 RANKL介導(dǎo)的相關(guān)經(jīng)典信號通路

1.1 RANKL/NF-κB信號通路

在RANKL激活下游信號通路的早期階段，NF-κB對OCs的分化起重要調(diào)控作用。Jimi等[19]研究表明NF-κB基因敲除的小鼠模型由于OCs形成受限而表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨硬化病，證明NF-κB的活化是OCs形成所必需的細(xì)胞因子。NF-κB是一個二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族，在靜息狀態(tài)下，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中以p50/p65兩個亞單位的異源二聚體形式存在，并與抑制劑IκB結(jié)合形成復(fù)合物。IκB的磷酸化是NF-κB級聯(lián)激活的先決條件，它受IκB激酶(IKKs)復(fù)合物調(diào)控，IKKs復(fù)合物磷酸化IκB，使IκB蛋白酶體降解，從IκB中釋放出的活性NF-κB二聚體易位到細(xì)胞核內(nèi)，并引起OCs分化特異性基因的轉(zhuǎn)錄與表達[20]。

1.2 RANKL/MAPK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路也參與了多種細(xì)胞活性，如基因表達、有絲分裂、分化、增殖和轉(zhuǎn)化等。主要由3個激酶組成：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)和p38-MAPK，均可被RANKL刺激活化。RANKL與OCs前體上受體RANK結(jié)合，激活MAPKs相關(guān)信號分子，進一步誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NFATc1和AP-1等的表達，促進OCs分化[21]。p38-MAPK信號通路在OCs分化的早期階段尤為重要，它促進小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(micropthalmia-associated transcription factor，MITF)和TRAP的表達，驅(qū)動下游因子的激活[22-23]。

1.3 c-Src/PI3K/Akt信號通路

RANK-TRAF6復(fù)合物可以招募Src激酶家族進而誘導(dǎo)PI3K/Akt信號級聯(lián)的激活。c-Src激酶作為Src家族的一個成員，對OCs的分化形成和成熟OCs的骨吸收功能至關(guān)重要。c-Src刺激磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)，活化的PI3K I型可磷酸化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP3)。PIP3是許多細(xì)胞表面受體用來控制細(xì)胞有絲分裂、生長、存活和分化的“第二信使”，進一步招募絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，Akt)表達到質(zhì)膜上。PI3K/Akt信號可靶向使Smad1/5和CBP(CREB結(jié)合蛋白)關(guān)聯(lián)，調(diào)節(jié)OBs中M-CSF的表達，刺激OCs分化[24-26]。Moon等[27]發(fā)現(xiàn)過表達Akt可以促進GSK3β的非活性形式形成和NFATc1的核定位，Akt可以通過激活 GSK3β/NFATc1信號軸誘導(dǎo)OCs的生成。Kawamura等[28]研究表明Akt1是OBs和OCs的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過促進OBs和OCs的分化和存活來維持骨量和骨轉(zhuǎn)化。

1.4 Ca2+信號通路

Ca2+信號在OCs生成中對細(xì)胞增殖、分化、基因轉(zhuǎn)錄和骨吸收等多種功能具有重要意義[29]。RANKL誘導(dǎo)的鈣振蕩與OCs分化、骨基質(zhì)吸收和凋亡等密切相關(guān)。在OCs形成的早期階段，RANKL會刺激磷脂酶Cγ(phospholipase Cγ，PLCγ)，活化的PLCγ在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生1，4，5-三磷酸肌醇(1，4，5-triphosphate，IP3)。IP3通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存儲鈣的釋放，直接增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，Ca2+通過store-operated Ca2+entry(SOCE)和瞬時受體電位通道流入，持續(xù)的鈣信號進而誘導(dǎo)NFATc1轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，進一步上調(diào)靶基因和蛋白表達，促進OCs分化形成[30-31]。

1.5 ROS效應(yīng)

正常機體代謝可以產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，是由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)內(nèi)源性產(chǎn)生，或由線粒體電子傳遞鏈的副產(chǎn)物所產(chǎn)生[32]。ROS包含超氧陰離子自由基(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(-OH)和一氧化氮(NO)[33]。生理狀況下，ROS能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進免疫、細(xì)胞增殖等生理活動，與抗氧化劑處于動態(tài)平衡狀態(tài)。然而，過量的ROS通過降低抗氧化酶水平，阻止OBs分化和OCs形成而破壞骨。在OCs分化過程中，NADPH氧化酶1將電子從NADPH轉(zhuǎn)移到分子氧中而形成ROS[34]。ROS還可通過間接激活MAPK、PI3K和NF-κB的活化，驅(qū)動CTSK、MMP9、c-Fos和NFATc1等基因表達促進OCs的分化成熟。此外，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1/核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件信號通路與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激機制之一，可通過增加抗氧化酶血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase catalytic subunit，GCLC)的表達，增加細(xì)胞內(nèi)ROS的清除，抑制OCs的分化與吸收[35]。大量研究表明抗氧化治療可以有效挽救氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的骨丟失。

2 天然化合物

OP是一種系統(tǒng)性骨病，已成為我國面臨的重要公共衛(wèi)生問題。雖然目前已有很多藥理產(chǎn)品用于治療骨質(zhì)疏松癥，然而近年來發(fā)現(xiàn)很多藥物長期使用伴隨著不良反應(yīng)。促使研究人員致力于對天然化合物的研究，以尋找有效抑制OCs的藥物。如表1所示，天然化合物通過調(diào)節(jié)RANKL介導(dǎo)的相關(guān)通路來抑制OCs分化抗骨質(zhì)疏松的作用。

表1 12種天然化合物調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的分子結(jié)構(gòu)、劑量、體外研究細(xì)胞系及其作用機制Table 1 The molecular structure, dose, cell lines and mechanism of 12 natural compounds on modulating osteoclast differentiation

2.1 天然化合物對NF-κB或MAPKs通路的調(diào)節(jié)作用

高良姜黃素(Galangin)是一種從傳統(tǒng)中藥中提取的生物黃酮，具有抗炎和抗氧化等生物活性。Li等[36]研究表明，在骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophages，BMMs)向OCs分化過程中，高良姜黃素能抑制p38、ERK的磷酸化，降低NFATc1、c-Jun和c-Fos等下游因子的表達。鷹嘴豆芽素A(Biochanin A，BCA)是一種具有酚類結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物。Liao等[21]研究證明BCA通過抑制MAPK和NF-κB通路而下調(diào)NFATc1和c-Fos的表達，抑制OCs的分化及骨吸收功能。長春西汀(Vinpocetine，Vinp)是生物堿長春胺的衍生物，Vinp抑制RANKL誘導(dǎo)的OCs分化和F-actin的形成。此外，Vinp抑制OCs形成過程中NF-κB、MAPK和AKT信號通路的激活，降低下游特異性基因的表達。體內(nèi)實驗表明，Vinp顯著降低OCs數(shù)量，減輕去卵巢誘導(dǎo)的骨丟失。Vinp可能成為一種潛在的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的藥物[37]。

2.2 天然化合物對Akt信號通路的調(diào)節(jié)作用

辛可寧(Cinchonine，CN)作為一種生物堿具有抗瘧疾、抗血小板和抗肥胖的作用。Jo等[38]研究表明CN抑制RANKL誘導(dǎo)的OCs分化和骨吸收，機制上CN抑制TRAF6介導(dǎo)的TAK1和AKT活性表達，引起NFATc1的下調(diào)。此外，CN能夠減輕LPS和卵巢切除誘導(dǎo)的小鼠骨溶解模型。這表明CN對于炎性骨丟失和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有治療潛力。蛇床內(nèi)酯(Cnidium lactone)是一種有效的中草藥，能夠預(yù)防去卵巢誘導(dǎo)的大鼠骨丟失模型[46]。Liang等[39]在RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化中發(fā)現(xiàn)，蛇床內(nèi)酯能夠抑制TRAP陽性多核OCs的分化和骨吸收功能。機制上，蛇床內(nèi)酯可降低p38和PI3K-Akt信號通路，進一步抑制c-Fos和NFATc1的表達。茴香腦(Anethole)作為20多種植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗癌和麻醉等活性。Qu等[40]研究發(fā)現(xiàn)茴香腦通過阻斷ERK和AKT信號通路抑制OCs的分化和骨吸收作用。在骨溶解動物模型中，茴香腦可以防止雌激素缺乏引起的骨量損失具有骨保護作用。

2.3 天然化合物對Ca2+信號通路的調(diào)節(jié)作用

青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物，廣泛用于瘧疾的臨床治療。在RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)分化中，Zeng等[41]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的OCs形成，同時抑制OCs分化關(guān)鍵基因的表達。此外，青蒿琥酯顯著降低了LPS誘導(dǎo)的OCs分化過程中上游TLR4/TRAF6和下游PLCγ1-Ca2+-NFATc1信號通路的表達，對骨侵蝕具有潛在的作用。齊墩果酸乙酯(oleanolic acid acetate，OAA)作為一種從豇豆中分離出的三萜化合物，Kim等[42]研究發(fā)現(xiàn)OAA抑制LPS誘導(dǎo)的骨丟失。機制上OAA顯著降低RANKL刺激的BMMs中PLCγ2磷酸化、Ca2+振蕩和NFATc1的表達。結(jié)果表明OAA可通過PLCγ2-Ca2+-NFATc1信號通路抑制OCs生成，并在體內(nèi)抑制炎癥性骨丟失。奇任醇(Kirenol，Kir)是一種抗風(fēng)濕中草藥的二萜類化合物，Zou等[43]研究發(fā)現(xiàn)Kir通過抑制NFATc1的表達和核易位，降低了Ca2+振蕩和小窩蛋白-1而抑制OCs的生成和骨吸收。同時，在體內(nèi)實驗中Kir通過減少OCs數(shù)量，降低Cav-1和NFATc1的表達，進一步減弱去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。

2.4 天然化合物對ROS介導(dǎo)效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

龍血素B(Loureirin B，LrB)是從血竭中分離出來的活性成分，廣泛用于治療氧化應(yīng)激和免疫紊亂等疾病，是一種包含12種以上活性化合物的中國傳統(tǒng)草藥。Liu等[44]研究表明LrB可通過影響NFATc1易位、ROS活性和鈣振蕩，降低OCs特異性基因的表達，抑制OCs的分化和骨吸收功能。體內(nèi)研究中LrB可減輕去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松。五味子甲素(Schisandrin A，Sch)是一種從中藥五味子中提取的聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素，Ni等[34]研究表明，Sch可通過下調(diào)TRAF6/Nox1信號通路，增強Nrf2的表達，減少ROS的產(chǎn)生，抑制OCs分化及骨吸收功能。體內(nèi)實驗表明，Sch通過作用于Nrf2抑制ROS的產(chǎn)生而減輕骨丟失，Nrf2信號通路可作為治療OCs相關(guān)疾病的一種新研究靶點。千層紙素A(Oroxylin A，OA)是一種從黃芩根中提取的黃酮類化合物，Xian等[45]體外研究表明OA可通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2介導(dǎo)的CAT、HO-1、GCLC等多種抗氧化酶，降低ROS產(chǎn)生，抑制OCs的分化減弱對羥基磷灰石的骨吸收作用。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，OA對LPS介導(dǎo)的骨溶解模型具有保護作用。OA可能具有抗骨質(zhì)疏松和骨溶解的潛在作用。

3 總結(jié)

破骨細(xì)胞分化異常是引起骨質(zhì)疏松癥的主要病理原因，RANKL誘導(dǎo)的下游多個信號傳導(dǎo)通路是OCs分化的關(guān)鍵步驟，這些下游信號分子的功能異常將導(dǎo)致OCs分化異常及功能障礙。本文綜述了RANKL誘導(dǎo)OCs分化相關(guān)信號通路的最新研究進展，但目前對于破骨細(xì)胞分化的具體通路及分子機制還知之甚少，需要進一步研究。雖然目前臨床上已有很多抗骨質(zhì)疏松的藥物，但長期使用會伴隨一些不良反應(yīng)。因此，探索抗骨質(zhì)疏松的天然化合物仍是目前研究的重點。如圖2示，天然化合物對OCs分化生物活性的影響及對于下游信號傳導(dǎo)的作用機制。天然化合物是探索新的候選藥物的良好來源，對于靶向破骨細(xì)胞分化的研究具有重要意義。然而，目前的研究主要依賴于體外與體內(nèi)動物實驗研究，尚未發(fā)現(xiàn)有效的人體內(nèi)試驗驗證，還需要進一步探索，期望在未來能夠有助于預(yù)防或治療骨溶解相關(guān)疾病。

圖2 天然化合物對于RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化信號通路的影響Fig.2 Effect of natural compounds on RANKL-mediated osteoclast differentiation signaling pathways