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7-羥乙基白楊素對(duì)低壓缺氧致PC12細(xì)胞損傷的改善作用及機(jī)制 Δ

2023-02-27 11:07張冬梅高迎春張潔景臨林馬慧萍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四醫(yī)院藥劑科全軍高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室蘭州730050
中國(guó)藥房 2023年4期
關(guān)鍵詞:緩沖液細(xì)胞周期存活率

張冬梅,高迎春,張潔,景臨林,馬慧萍 (聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院藥劑科/全軍高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蘭州730050)

我國(guó)高原面積廣闊,具有重要的政治、軍事和經(jīng)濟(jì)地位。氣壓低、氧含量低是高原環(huán)境最主要的特征。大腦對(duì)低氧刺激尤為敏感,動(dòng)物研究和臨床試驗(yàn)表明,急性低壓缺氧可導(dǎo)致大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞、海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷[1]。當(dāng)腦神經(jīng)細(xì)胞缺氧時(shí),氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗所導(dǎo)致的線粒體損傷、神經(jīng)細(xì)胞丟失、氧化應(yīng)激或細(xì)胞壞死、凋亡、自噬是缺氧性損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2―4],但目前關(guān)于高原低壓缺氧致神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制及藥物研究較少,其預(yù)防和治療一直面臨著較大壓力。可見,探索低壓缺氧致神經(jīng)細(xì)胞損傷的發(fā)生機(jī)制并尋找抗低壓缺氧損傷藥物具有重要意義。

近年來(lái)有研究表明,黃酮類化合物具有改善缺氧損傷神經(jīng)的藥理作用,如抗氧化、抗炎、抗凋亡作用等[5―7]。白楊素(化學(xué)名5,7-二羥基黃酮)又名白楊黃素,是來(lái)源廣、毒性低的黃酮類化合物,具有抗焦慮、抗抑郁和保護(hù)神經(jīng)等多種生物活性,但其生物利用度較低[3]。為了改善白楊素的上述缺點(diǎn),本課題組通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾合成了7-羥乙基白楊素[化學(xué)名5-羥基-7-羥乙氧基黃酮,英文名7-hydroxyethyl chrysin,以下簡(jiǎn)稱“7-HEC”][8];藥理研究表明,7-HEC能改善低壓缺氧誘導(dǎo)的腦組織損傷、認(rèn)知功能障礙,并能逆轉(zhuǎn)缺氧模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷[9],但具體機(jī)制尚不清楚。PC12細(xì)胞是研究神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理的常用細(xì)胞之一,本課題組為了更好地模擬高原環(huán)境,在單純?nèi)毖跄P偷幕A(chǔ)上進(jìn)行改良,建立了PC12細(xì)胞低壓缺氧損傷模型,并證實(shí)了低壓缺氧可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡[10]。研究指出,抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)與促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的表達(dá)比值決定了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程,活化的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)則是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子,可見,caspase-3/Bax/Bcl-2通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路[11]?;诖?,本研究擬探討7-HEC對(duì)低壓缺氧致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,同時(shí)以caspase-3/Bax/Bcl-2通路為線索,探討該化合物改善低壓缺氧致PC12細(xì)胞損傷的分子機(jī)制,以期為7-HEC在高原低壓缺氧損傷防治領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括自制壓力控制型細(xì)胞缺氧培養(yǎng)箱(實(shí)用新型專利ZL201821672535[12])、EST-10-02型氧濃度測(cè)定儀(深圳市興源恒通科技有限公司)、CKX41型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、INC 153H9T6型三氣培養(yǎng)箱(德國(guó)Memmert公司)、Spectra-Maxi3型全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)、ACEA NovoCyte型流式細(xì)胞儀(美國(guó)ACEA Biosciences公司)、ChemiDocMP Imaging System型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)等。

1.2 主要藥品與試劑

7-HEC原料藥(純度98%)由本實(shí)驗(yàn)室自制;DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、0.25%胰酶消化液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自蘭杰柯生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(批號(hào)20180728)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(批號(hào)20190412)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(批號(hào)20180728)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(批號(hào)PM508)購(gòu)自日本Dojindo公司;Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)10625-2)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;DNA含量檢測(cè)試劑盒(細(xì)胞周期)(批號(hào)20210105)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;兔抗鼠Bax單克隆抗體(批號(hào)ab32503)、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體(批號(hào)ab196495)、兔cleaved caspase-3多克隆抗體(批號(hào)ab184787)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;鼠β-肌動(dòng)蛋白(βactin)單克隆抗體(批號(hào)TA-09)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗(批號(hào)ZB-2307)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將PC12細(xì)胞接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”)中,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%~90%時(shí),用0.25%胰酶消化并按1∶3比例傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組與處理

根據(jù)不同培養(yǎng)條件,將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、低壓缺氧組和7-HEC組。對(duì)照組細(xì)胞用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;低壓缺氧組細(xì)胞根據(jù)前期確定的低壓缺氧模型條件[10],于 5%CO2、94%N2、1%O2、54 004 Pa(與5 000 m海拔處大氣壓相當(dāng))條件下培養(yǎng)24 h;7-HEC組細(xì)胞先用含7-HEC的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min后,再按低壓缺氧組方法培養(yǎng)24 h。

2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)。取生長(zhǎng)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞,用0.25%胰酶消化后,按每孔1×104個(gè)接種于96孔板中。將細(xì)胞分為對(duì)照組、低壓缺氧組、不同濃度7-HEC組(7-HEC終濃度為100、10、1、0.1、0.01 μmol/L,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔;同時(shí)設(shè)置不含細(xì)胞、不含藥物的空白組。于37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后,棄去上清液,對(duì)照組和低壓缺氧組細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基100 μL,7-HEC組細(xì)胞分別加入含7-HEC 100、10、1、0.1、0.01 μmol/L 的完全培養(yǎng)基 100 μL,按“2.2”項(xiàng)下方法處理。培養(yǎng)24 h后,每孔加入CCK-8試劑10 μL,于37 ℃下孵育1 h,使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(OD)值并按下式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.4 細(xì)胞中LDH、MDA含量和SOD活性檢測(cè)

取生長(zhǎng)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞,用0.25%胰酶消化后,按每孔2×106個(gè)接種于6孔板中。將細(xì)胞分為對(duì)照組、低壓缺氧組、7-HEC組(1 μmol/L,根據(jù)“2.3”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。按“2.3”項(xiàng)下方法培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞和上清液,使用酶標(biāo)儀以LDH試劑盒(L-P法)檢測(cè)上清液中LDH含量,以MDA試劑盒(TBA法)檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量,以SOD試劑盒(WST-8法)檢測(cè)細(xì)胞中SOD活性,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

2.5 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測(cè)

2.5.1 細(xì)胞凋亡 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取生長(zhǎng)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞,按“2.4”項(xiàng)下方法分組(每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)、處理、培養(yǎng)。隨后,棄去上清液,細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗2次,用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化1 min,于室溫下以1 500 r/min離心5 min;用4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗2次,以1 500 r/min離心5 min,棄去上清液;細(xì)胞用1×bingding buffer 400 μL重懸,制成密度為1×106個(gè)/mL的懸液;取上述懸液,加入Annexin Ⅴ-FITC試劑適量(每100 μL懸液加入Annexin Ⅴ-FITC試劑5 μL),輕輕混勻,室溫避光孵育15 min;加入PI試劑10 μL和1×binding buffer 400 μL,輕輕混勻,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(%)。

2.5.2 細(xì)胞周期 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取生長(zhǎng)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞,按“2.4”項(xiàng)下方法分組(每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)、處理、培養(yǎng)。隨后,收集各組細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液清洗2次后,于-20 ℃ 75%乙醇中固定過(guò)夜;以1 500 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液清洗2次后,用RNaseA試劑重懸并于37 ℃下孵育30 min;加入PI試劑400 μL,于4 ℃下避光孵育30 min,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各周期的分布情況。

2.6 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot方法檢測(cè)。取生長(zhǎng)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞,按“2.4”項(xiàng)下方法分組(每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)、處理、培養(yǎng)。隨后,收集各組細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液洗滌2次,加入RIPA細(xì)胞裂解液100 μL,于冰浴中放置30 min,于4 ℃下以1 500 r/min離心15 min;取上清液,以BCA法進(jìn)行定量后,加上樣緩沖液煮沸變性10 min,取變性蛋白樣品50 μg進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h,加入cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin一抗(稀釋比例均為1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜;用TBST緩沖液洗膜3次,加入二抗(稀釋比例為1∶5 000),室溫孵育1 h;用TBST緩沖液洗膜3次,以凝膠成像系統(tǒng)成像,以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平,并記錄Bax與Bcl-2表達(dá)水平的比值(Bax/Bcl-2比值),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)均以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度7-HEC對(duì)低壓缺氧細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組比較,低壓缺氧組細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.01);與低壓缺氧組比較,7-HEC 10、1、0.1 μmol/L組細(xì)胞的存活率均顯著升高(P<0.05或P<0.01),提示在上述濃度下,7-HEC可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞存活率的降低,故選擇作用較明顯的1 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度7-HEC對(duì)低壓缺氧細(xì)胞存活率的影響(±s,n=6)

3.2 7-HEC對(duì)低壓缺氧細(xì)胞中LDH、MDA含量和SOD活性的影響

與對(duì)照組比較,低壓缺氧組細(xì)胞上清液中LDH含量和細(xì)胞中MDA含量均顯著升高,細(xì)胞中SOD活性顯著降低(P<0.01)。與低壓缺氧組比較,7-HEC組細(xì)胞上清液中LDH含量和細(xì)胞中MDA含量均顯著降低(P<0.01),細(xì)胞中SOD活性顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 7-HEC對(duì)低壓缺氧細(xì)胞中LDH、MDA含量和SOD活性的影響(±s,n=6)

表1 7-HEC對(duì)低壓缺氧細(xì)胞中LDH、MDA含量和SOD活性的影響(±s,n=6)

a:與對(duì)照組比較,P<0.01;b:與低壓缺氧組比較,P<0.01

組別對(duì)照組低壓缺氧組7-HEC組LDH/(U/mL)23.45±4.11 38.85±2.99a 25.19±2.25b MDA/(nmol/mg prot)0.035±0.002 0.081±0.007a 0.040±0.004b SOD(U/mg prot)0.132±0.005 0.113±0.002a 0.134±0.003b

3.3 7-HEC對(duì)低壓缺氧細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

3.3.1 細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組比較,低壓缺氧組細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.01);與低壓缺氧組比較,7-HEC組細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見圖2。

圖2 7-HEC對(duì)低壓低氧細(xì)胞凋亡的影響(±s,n=3)

3.3.2 細(xì)胞周期 與對(duì)照組比較,低壓缺氧組G1期細(xì)胞比例顯著升高,S期、G2期細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.05或P<0.01);與低壓缺氧組比較,7-HEC組G1期細(xì)胞比例顯著降低,G2期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見圖3。

圖3 7-HEC對(duì)低壓缺氧細(xì)胞周期的影響(±s,n=3)

3.4 7-HEC對(duì)低壓缺氧細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,低壓缺氧組細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高,Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.05或P<0.01);與低壓缺氧組比較,7-HEC組細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低,Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見圖4。

圖4 7-HEC對(duì)低壓低氧細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(±s,n=3)

4 討論

本研究通過(guò)考察7-HEC對(duì)低壓缺氧PC12細(xì)胞增殖、抗氧化能力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響,評(píng)價(jià)了該化合物對(duì)低壓缺氧致神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞在低壓缺氧(1%O2、54 004 Pa)條件下培養(yǎng)24 h后,其存活率明顯下降;經(jīng)0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的7-HEC提前干預(yù)后,7-HEC 0.1、1、10 μmol/L組低壓缺氧細(xì)胞的存活率明顯提升,提示上述濃度的7-HEC可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞存活率的降低;其中,1 μmol/L的活性最佳,故以該濃度作為后續(xù)研究的藥物濃度。

LDH是存在于正常細(xì)胞胞質(zhì)中的酶,當(dāng)細(xì)胞膜受損后,LDH即被釋放到細(xì)胞外,故可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH的含量來(lái)判斷細(xì)胞膜的受損程度[13]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,低壓缺氧組細(xì)胞上清液中LDH含量顯著升高;與低壓缺氧組比較,7-HEC組細(xì)胞上清液中LDH含量顯著降低。這說(shuō)明7-HEC對(duì)低壓性缺氧引起的細(xì)胞膜損傷具有改善作用。

有研究指出,MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的標(biāo)志產(chǎn)物,其含量高低可反映氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度,以及組織受氧自由基破壞的損傷程度;SOD是清除生物體內(nèi)氧自由基的重要物質(zhì),兼具修復(fù)細(xì)胞的功能,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平升高時(shí),SOD的生物合成及活性將有所增強(qiáng),可用以間接反映機(jī)體氧自由基的生成量及清除氧自由基的能力[14]。本研究結(jié)果顯示,低壓缺氧組細(xì)胞中MDA含量較對(duì)照組顯著升高,SOD活性較對(duì)照組顯著降低,提示低壓缺氧細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增加,抗氧化能力減弱。與低壓缺氧組比較,7-HEC組細(xì)胞中MDA含量顯著降低,SOD活性顯著升高,提示該化合物可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增加、抗氧化能力減弱的現(xiàn)象,可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞氧化/抗氧化失衡而發(fā)揮對(duì)低壓缺氧致細(xì)胞損傷的改善作用。

本研究應(yīng)用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了低壓缺氧細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,低壓缺氧組細(xì)胞的凋亡率顯著升高;與低壓缺氧組比較,7-HEC組細(xì)胞的凋亡率顯著降低。這表明低壓缺氧可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而7-HEC具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了7-HEC對(duì)細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示,低壓缺氧組G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著升高,S期、G2期細(xì)胞比例較對(duì)照組均顯著降低,提示在低壓缺氧條件下,細(xì)胞周期阻滯于G1期;經(jīng)7-HEC處理后,上述作用得到逆轉(zhuǎn),G1期的細(xì)胞比例明顯降低,G2期的細(xì)胞比例明顯上升,S期的細(xì)胞比例亦有上升趨勢(shì),提示7-HEC可使進(jìn)入DNA復(fù)制期的低壓缺氧細(xì)胞比例增加,可改善低壓缺氧引起的細(xì)胞周期阻滯。此結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。有研究指出,處于G1期的細(xì)胞可對(duì)各種影響增殖與凋亡的信號(hào)進(jìn)行整合和傳遞,進(jìn)而決定細(xì)胞是否進(jìn)行分裂、凋亡或延遲分裂,即進(jìn)入G0期[15―16]。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,7-HEC可能通過(guò)改善低壓缺氧致PC12細(xì)胞周期阻滯而提高細(xì)胞存活率、減少細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖,但具體機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)的程序性死亡方式,受抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。通常情況下,抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax以相對(duì)穩(wěn)定的比例存在于細(xì)胞內(nèi),二者的表達(dá)失衡是造成細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素:當(dāng)Bax表達(dá)增多時(shí),Bcl-2/Bax同源二聚體增多,在缺氧刺激下,細(xì)胞線粒體膜受損,作為凋亡執(zhí)行蛋白酶的caspase-3被釋放至胞質(zhì),當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),caspase-3被活化成cleaved caspase-3,從而啟動(dòng)和誘導(dǎo)凋亡;相反當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時(shí),Bcl-2/Bax同源二聚體解離增多,細(xì)胞凋亡受到抑制[17]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低壓缺氧組細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高,Bcl-2/Bax比值顯著下降;與低壓缺氧組相比,7-HEC組細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低,Bcl-2/Bax比值顯著升高。這提示7-HEC可減少低壓缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與抑制caspase-3/Bax/Bcl-2凋亡信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述,7-HEC可明顯提高低壓缺氧細(xì)胞的存活率,降低上清液中LDH含量,改善細(xì)胞周期阻滯,降低細(xì)胞凋亡率,從而顯著減輕低壓缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,其作用機(jī)制可能與抑制caspase-3/Bax/Bcl-2凋亡信號(hào)通路的激活有關(guān)。本課題組將進(jìn)一步從細(xì)胞分子水平分析7-HEC保護(hù)作用的具體機(jī)制,為該化合物應(yīng)用于高原低壓缺氧損傷的防護(hù)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和研究線索。

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