李隱俠，牙生江·那斯?fàn)?，賽里克·都曼，錢 勇*，曹少先，王偉列，孟春花，張 俊，張建麗

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所， 南京 210014； 2.新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州克州畜牧獸醫(yī)局， 阿圖什 845350；3.新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州祥泰牧業(yè)有限公司， 阿圖什 845350)

柯爾克孜羊是新疆地方特色綿羊品種，以四肢高長、體型勻稱、緊湊而著稱，具有耐粗飼、抗病和抗逆性強、肉質(zhì)好、風(fēng)味獨特等優(yōu)良特性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，柯爾克孜羊體格較大，周歲公羊平均體重為36.65 kg，體高為64.77 cm，體長為65.63 cm[3]。柯爾克孜羊公羊體重與體尺指標(biāo)均大于母羊，且體重與各項體尺相關(guān)性顯著[4]?？聽柨俗窝蛉獯种尽⒋值鞍?、不飽和脂肪酸、油酸、亞油酸和微量元素(鈣、銅和鐵)含量優(yōu)勢明顯，重金屬含量低于國家標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)有機食品上具有品種優(yōu)勢[5-6]。雖然柯爾克孜羊從上世紀(jì)90年代已經(jīng)開始選育，但是從未對其進行過系統(tǒng)保種、遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評估等工作，導(dǎo)致其品種特性退化嚴(yán)重，現(xiàn)有群體遺傳結(jié)構(gòu)不清晰，嚴(yán)重阻礙了柯爾克孜羊的資源保護和利用。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是最早廣泛應(yīng)用于基因組水平的遺傳標(biāo)記基因分型方法，通過對群體內(nèi)的個體進行全基因組范圍內(nèi)的SNPs位點分析，得到群體的遺傳多樣性、親緣關(guān)系及家系結(jié)構(gòu)[7-9]。SNP芯片具有密度大、覆蓋廣、價格低等優(yōu)點，是現(xiàn)階段重要的育種工具之一，在豬[10-11]、牛[12-13]、山羊[14-15]上均有廣泛應(yīng)用。利用SNP芯片評估馬身豬保種群的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性豐富，但近交程度高，家系較少，需要從原種場引入新的血統(tǒng)，擴大保種群數(shù)量，降低近交系數(shù)[10]?；赟NP芯片對里岔黑豬進行遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析，表明里岔黑豬遺傳多樣性豐富，但群體近交現(xiàn)象明顯[11]；利用SNP芯片信息評估新疆近交?；蚪M純合度，為新疆近交牛遺傳資源的育種規(guī)劃及未來該群體的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)[12]?；诟咄縎NP芯片建立了一種可評估牛早期胚胎染色體質(zhì)量和生產(chǎn)性能的方法，為胚胎牛育種提供了技術(shù)支撐[13]，使用60K山羊SNP 芯片分析云上黑山羊的遺傳結(jié)構(gòu)，顯示其在基因組水平具備較好的品種一致度和群體穩(wěn)定性，已具備獨立的品種特點[14]；利用50K芯片解析巴基斯坦山羊品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，為巴基斯坦國家育種計劃提供了寶貴的基因庫[15]。

ROH(runs of homozygosity)指長的純合基因型的連續(xù)片段，被定義為來自同一個祖先，是使用基因型評估遺傳多樣性的最新方法[16-18]?；赗OH的基因組近交系數(shù)FROH與基于系譜的近交系數(shù)相比更接近于真實的近交系數(shù)[19]，長ROH片段反映最近世代發(fā)生過近交，而短ROH說明較遠世代產(chǎn)生的近交[20-22]。

新疆克州阿圖什市柯爾克孜羊良繁中心現(xiàn)有種公羊31只，能繁母羊1 000余只，其遺傳多樣性、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)并不清晰，不利于后續(xù)保種和選育工作的開展。本試驗采用高密度SNP芯片對該柯爾克孜羊群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，為柯爾克孜綿羊的保護、選育及種質(zhì)創(chuàng)新利用等提供分子水平的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究中柯爾克孜羊來自新疆克州阿圖什市柯爾克孜羊良種繁育中心，共采集61頭年齡2～3歲種羊，其中公羊31頭，母羊30頭，所有個體的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)境條件一致。采集61頭種羊的靜脈血于EDTA抗凝管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取和鑒定

采用磁珠法提取柯爾克孜羊DNA，通過NanoDrop2000、Agilent 2100和Qubit方法測定基因組DNA的濃度和純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。

1.3 柯爾克孜羊基因組DNA的SNP分型

DNA基因組分型在北京康普森生物技術(shù)有限公司進行，采用InfiniumTM Ovine SNP50K Genotyping Array v3芯片進行測序和基因分型。

1.4 SNP 芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控

數(shù)據(jù)分析前進行重復(fù)樣本的檢測，使用Plink (V1.90)軟件對基因型數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為：使用常染色體上的位點，最小等位基因頻率(MAF)≥ 0.01，哈代溫伯格平衡檢驗P值≥0.000 001，SNP檢出率(call rate)≥90%，個體檢出率≥90%。

1.5 柯爾克孜羊群體遺傳多樣性分析

采用Plink (V 1.90) 軟件對質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進行分析，計算柯爾克孜羊群體的多態(tài)標(biāo)記比例 (PN)、期望雜合度 (He)、觀察雜合度 (Ho)、多態(tài)性信息含量 (PIC)、有效等位基因數(shù) (Ne) 和最小等位基因頻率(MAF)。

1.6 柯爾克孜羊群體ROH分析

使用Plink (V1.90) 軟件計算柯爾克孜羊群體中每個樣本基因組上的長純合片段ROH，統(tǒng)計ROH在柯爾克孜羊群體中的分布、長度、數(shù)目等，根據(jù)每個樣本中ROH片段的總長度占常染色體基因組總長的比例計算基于ROH的近交系數(shù)(FROH)[23]，采用R軟件(https://www.r-project.org/)繪制FROH小提琴圖。

1.7 柯爾克孜羊群體IBS距離矩陣和G矩陣分析

利用Plink (V1.90) 軟件計算群體個體間的狀態(tài)同源性(identical by state, IBS)，計算個體間的遺傳距離，同時根據(jù)VanRaden[24]提出的基因組關(guān)系G 矩陣構(gòu)建方法構(gòu)建柯爾克孜羊群體G矩陣，分析群體個體間的親緣關(guān)系，并使用R軟件繪制IBS距離矩陣和G矩陣結(jié)果熱圖。

1.8 柯爾克孜羊群體家系構(gòu)建分析

采用MegaX (V10.0)[25]軟件對質(zhì)控后的SNP 位點進行分析，采用鄰接法 (neighhor-Joining, NJ) 構(gòu)建群體進化樹，分析柯爾克孜羊群體中種公羊的家系結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計不同家系種公羊的數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 柯爾克孜羊DNA提取和結(jié)果檢測

采用磁珠法提取柯爾克孜種公羊和種母羊的靜脈血DNA， 檢測發(fā)現(xiàn)DNA樣品平均濃度在50 ng·L-1左右，OD260 nm/OD280 nm為1.8～2.0。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)DNA條帶清晰，無拖帶現(xiàn)象，說明柯爾克孜羊基因組DNA質(zhì)量較好，達到芯片檢測要求，可以用于后續(xù)的試驗研究(圖1)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～61. 柯爾克孜羊基因組DNA

2.2 柯爾克孜羊群體基因組DNA的SNP分型和質(zhì)控

使用InfiniumTM Ovine SNP50K Genotyping Array v3芯片對柯爾克孜羊基因組DNA進行基因分型和質(zhì)控檢測，結(jié)果見表1。61只柯爾克孜羊共檢測到64 734個SNPs，表明此款芯片適用于分析柯爾克孜羊基因組的SNP位點；質(zhì)控后的SNPs數(shù)量為56 763，其中1號染色體上SNPs位點分布最多(6 305個)，24號染色體上SNPs位點分布較少(845個)(圖2)。

圖2 柯爾克孜羊SNPs在每條染色體上的分布

2.3 柯爾克孜羊群體的遺傳多樣性分析

柯爾克孜羊群體的遺傳多樣性見表2。SNPs位點的平均多態(tài)信息含量為0.273±0.112， 其中多態(tài)性信息含量在0～0.15之間的SNPs位點較少(占15.6%)；多態(tài)性信息含量在0.30～0.45之間的SNPs位點較多(56.9%)，27.5%的SNPs位點的多態(tài)性信息含量處于0.15～0.30之間(圖3A)。具體來說，多態(tài)性信息含量在0～0.25之間的SNPs位點有12 419個，占比21.9%，多態(tài)信息含量在0.25～0.5之間的SNPs位點有44 344個，占比78.1%，說明柯爾克孜羊群處于中度遺傳性。61只柯爾克孜羊共檢測到有效等位基因數(shù)為96.567，平均有效等位基因數(shù)為1.583。SNPs位點的多態(tài)性標(biāo)記比例為0.889，此群體的平均期望雜合度和觀察雜合度均為0.368，說明現(xiàn)在的柯爾克孜羊群體無外源血統(tǒng)的引入和近交現(xiàn)象發(fā)生。平均最小等位基因頻率為0.263±0.147，分布相對均勻，0.1～0.2占比最少(17.0%)，0.4～0.5占比最多(23.0%)(圖3B)。

表2 柯爾克孜羊群體遺傳多樣性

A.多態(tài)信息含量分布；B.最小等位基因頻率分布

2.4 柯爾克孜羊群體的親緣關(guān)系分析

2.4.1 ROH分析 61只柯爾克孜羊共檢測到200個ROHs，ROHs在柯爾克孜羊群體的染色體上均有分布，其中在2號染色體上分布最多，24號染色體上分布最少(圖4A)。在61只柯爾克孜羊中，56只羊的ROH長度在0～50 Mb之間(圖4B)。在柯爾克孜羊群中，長度1～5 Mb的ROHs最多，占67.5%左右，長度為15～20 Mb的ROHs最少，占4% 左右 (圖4C)?？聽柨俗窝蛉后w基于ROH的平均近交系數(shù)FROH為0.008 19±0.018 8，其中D8392的FROH最大為0.115，31只柯爾克孜公羊的FROH為0.004 65±0.008，其中9只公羊的FROH近交系數(shù)為0(圖5)。

A. ROH在染色體上分布； B. 柯爾克孜羊個體ROH長度的分布情況； C. 柯爾克孜羊不同長度ROH分布

圖中心的白色點代表群體FROH的中位數(shù)，中間黑色方框的上緣和下緣分別為群體FROH的上四分位數(shù)和下四分位數(shù)。小提琴圖的寬窄表示群體FROH的概率密度分布，圖越寬表示處于該水平的樣本數(shù)目越多，反之越少

2.4.2 基于G矩陣的柯爾克孜羊群體間的親緣關(guān)系分析 利用全基因組SNPs位點構(gòu)建的G矩陣能真實反映個體間的親緣關(guān)系，柯爾克孜羊群體親緣關(guān)系結(jié)果見圖6，顏色越接近紫色表示親緣關(guān)系越近，G 矩陣結(jié)果顯示柯爾克孜羊群體間親緣關(guān)系均較遠。

該圖展示兩兩個體間的基因組親緣關(guān)系系數(shù)，顏色越接近紫色表示親緣關(guān)系越近

2.4.3 基于IBS距離矩陣的柯爾克孜羊群體遺傳距離分析 61只柯爾克孜羊之間的IBS遺傳距離在0.229～0.307之間，平均遺傳距離為0.294；31只種公羊間IBS遺傳距離在0.229～0.306之間，平均遺傳距離為0.294?？聽柨俗窝蛉后wIBS距離矩陣的結(jié)果見圖7，結(jié)果顯示柯爾克孜羊個體間IBS遺傳距離較遠，說明此群體近交風(fēng)險較低。

該圖展示兩兩個體間的遺傳距離，顏色越接近綠色表示親緣關(guān)系越近

2.5 柯爾克孜羊群體中公羊的家系結(jié)構(gòu)分析

鑒于公羊?qū)τ谡麄€群體的重要性，采用MegaX (V10.0) 軟件構(gòu)建柯爾克孜羊31只種公羊群體進化樹，結(jié)合基因組親緣關(guān)系分析結(jié)果，以公羊間基因組親緣關(guān)系系數(shù)大于等于0.1為標(biāo)準(zhǔn)進行聚類分析，將現(xiàn)有種公羊劃分為25個家系(圖8)，其中家系17包含4只公羊，家系18包含2只公羊，家系20包含3只公羊，其余家系目前均只有1只公羊。

圖8 基于基因組親緣關(guān)系系數(shù)的柯爾克孜公羊群體進化樹

3 討 論

柯爾克孜羊是新疆優(yōu)良的綿羊品種之一，具有獨特的形態(tài)特征，但是其遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)尚未得到系統(tǒng)的研究，尤其是在基因組水平上。本研究采用50K高密度SNP芯片技術(shù)檢測阿圖什市良繁中心柯爾克孜羊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量的全基因組SNPs，并基于這些高質(zhì)量SNPs對柯爾克孜羊的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)進行評估。研究發(fā)現(xiàn)，遺傳雜合度越高，群體的變異越大，雜合度高于0.5表明群體沒有受到高強度選擇[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，柯爾克孜羊群體平均預(yù)期雜合度和觀測雜合度均為0.368，說明此柯爾克孜羊群無血統(tǒng)流失或者外來血統(tǒng)的引入。趙冰茹等[27]采用9個微衛(wèi)星檢測了南疆地區(qū)4個綿羊品種的平均雜合度，發(fā)現(xiàn)柯爾克孜羊的平均雜合度為0.737，預(yù)期雜合度為0.857，與本研究的結(jié)果相差很大，這可能與微衛(wèi)星位點的選擇有關(guān)，也與采樣地區(qū)和樣本量有關(guān)。不同地方綿羊群體的雜合度不同，西藏浪卡子綿羊的觀測雜合度為0.235，青海山谷型藏羊的觀測雜合度為0.323[28]，甘肅灘羊的觀測雜合度高達0.875[29]，說明不同品種綿羊的群體變異與地域環(huán)境及其選育程度有較大的關(guān)系。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因片段多態(tài)性的常用有效指標(biāo)[30-32], Botstein 等[33]認(rèn)為，對于微衛(wèi)星位點來說，PIC>0.5時定義為高度多態(tài)位點，PIC<0.25時定義為低度多態(tài)位點，PIC位于0.5和0.25之間為中度多態(tài)位點，柯爾克孜羊SNPs位點的平均多態(tài)信息含量為0.273，但是56.9%的SNPs多態(tài)信息含量分布在0.30～0.45之間，78.1%的多態(tài)信息含量在0.25～0.5之間，說明柯爾克孜羊群處于中度遺傳[33]，且柯爾克孜羊群體間個體差異很大。以上結(jié)果顯示，阿圖什良繁中心柯爾克孜羊群體具有中度遺傳變異，雖然沒有經(jīng)過系統(tǒng)選育、合理利用和保種，但是從二十世紀(jì)90年代開始對柯爾克孜羊進行不斷的選育，導(dǎo)致其遺傳變異下降。

根據(jù)ROH覆蓋的基因組比例評估近親繁殖系數(shù)被認(rèn)為是檢測近親繁殖效益的一種強大而準(zhǔn)確的方法[34]，也是一種有效的替代譜系近親繁殖的系數(shù)[35-36]。全基因組SNP芯片顯示，通城豬平均ROH長度為23.7 Mb, 范圍為11.26～69.02 Mb，基于ROH的平均近交系數(shù)為0.04%，表明近交水平較低，研究結(jié)果為制定通城豬的管理和保種策略提供了理論依據(jù)[37]； 用ROH檢測8個印度牛品種的遺傳多樣性，表明在較小的本地種群中近交水平達到臨界狀態(tài)，研究結(jié)果為保護生物多樣性提供了有用的工具[38]。本研究在61只柯爾克孜羊群中發(fā)現(xiàn)，91.8 %的ROH長度在0～50 Mb之間，ROH總長度較短，且基于ROH的近交程度分析發(fā)現(xiàn)，此柯爾克孜羊群體平均近交系數(shù)為0.008，近交系數(shù)較低。但是隨著保種時間延長，加上群體規(guī)模局限性和相對封閉的運行模式，近交系數(shù)必然上升[39]。所以在日常管理中應(yīng)該加強系譜檔案的管理，完善配種記錄，避免系譜錯誤導(dǎo)致近親繁殖，維持柯爾克孜羊群體的遺傳多樣性。同時，加強柯爾克孜羊本品種選育，進一步提純復(fù)壯。

遺傳距離是指不同種群或個體間基因差異的程度，是探究物種起源、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和分析群體間親緣關(guān)系的基礎(chǔ)，對育種工作中指導(dǎo)親本選育有重要作用[40]。本研究也分析了柯爾克孜羊群體間IBS遺傳距離，以此評價個體間的親緣關(guān)系[33]。柯爾克孜羊群體的IBS平均遺傳距離為0.294 2，31只公羊間平均遺傳距離為0.294 4，說明柯爾克孜羊種公羊和種母羊之間具有適中的遺傳距離[18]。因為種公羊在整個群體中的重要性，基于31只種公羊的遺傳距離構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，按照親緣關(guān)系小于0.1的標(biāo)準(zhǔn)將種公羊劃分為25個家系，大部分家系只有1只種公羊，后期應(yīng)注意后代的選育，避免血統(tǒng)流失。而測序的30只母羊與所有檢測的公羊血緣關(guān)系都比較遠，可以任意進行交配。

4 結(jié) 論

本研究基于InfiniumTM Ovine SNP50K Genotyping Array v3芯片分析了柯爾克孜羊群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)柯爾克孜羊群體遺傳多樣性較豐富，群體內(nèi)近交程度低，雖然家系較多，但是每個家系種公羊數(shù)量太少，需要加強種公羊的后代選育，避免血統(tǒng)流失。