敖茂宏，馬伏寧，彭 楊，黃東梅，邢文婷，吳 斌，許 奕*

1.貴州省亞熱帶作物研究所，貴州興義 562400；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站/海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571101；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院/海南省南繁生物安全與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省崖州灣種子實(shí)驗(yàn)室，海南三亞 572000

西番蓮（Passiflora eduliaSims）是原產(chǎn)于熱帶地區(qū)的藤本植物，屬被子植物門(mén)雙子葉植物綱西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora），是珍稀的熱帶亞熱帶水果。果實(shí)酸甜可口，風(fēng)味濃郁，芳香怡人，故有“果汁之王”美譽(yù)，其又被稱為百香果。果實(shí)被譽(yù)為天然香料，是重要的高檔甜點(diǎn)調(diào)味劑、調(diào)香劑，全株都具有藥用價(jià)值，是世界上已知最芳香的水果之一，是一種極具開(kāi)發(fā)前景的優(yōu)質(zhì)水果。因此，西番蓮在熱帶農(nóng)業(yè)中具有非常重要的地位。西番蓮在國(guó)內(nèi)的種植面積是7.33萬(wàn)hm2（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2021年數(shù)據(jù)），已超過(guò)起源地巴西（6.66萬(wàn) hm2），位列世界第一。然而，其是典型的“易種難管”的熱帶高品質(zhì)果樹(shù)，“難管”的其中最重要的原因就是環(huán)境變換導(dǎo)致的逆境脅迫時(shí)常發(fā)生，且給產(chǎn)業(yè)造成毀滅性傷害，如高溫導(dǎo)致座果率降至正常溫度的10%~15%，低溫致死，干旱和高鹽抑制生長(zhǎng)發(fā)育，究其根本原因就是抗性品種的缺乏，且西番蓮特有的抗逆機(jī)制不清楚。因此通過(guò)對(duì)西番蓮的抗逆基因資源進(jìn)行挖掘，研究該基因的功能來(lái)進(jìn)一步提高西番蓮的抗逆性就成為一個(gè)重要的手段。

有大量的研究表明，植物細(xì)胞中的膜蛋白在植物抗逆過(guò)程中具有重要作用，水通道蛋白（aquaporin, AQP）就是其中研究較為深入和系統(tǒng)的一類膜蛋白。水通道蛋白是一類位于各種細(xì)胞膜上24～34 kDa的小分子跨膜蛋白，能夠調(diào)節(jié)水分以及其他小分子物質(zhì)的運(yùn)輸。植物中存在較多的水通道蛋白成員，其中擬南芥中有 35個(gè)[1]，水稻中有33個(gè)[2]，玉米中有36個(gè)[3]，香蕉中有47個(gè)[4]。根據(jù)序列同源性，AQP被分為8大亞家族，分別為質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins, PIPs）、液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic proteins, TIPs）、類Nod26膜內(nèi)在蛋白（nodulin 26-like intrinsic proteins, NIPs）、堿性小分子膜內(nèi)在蛋白（small basic intrinsic proteins, SIPs）、GlpF樣內(nèi)在蛋白（GlpF-like intrinsic proteins, GIPs）、未鑒定膜內(nèi)在蛋白（uncategorized members designated X intrinsic proteins, XIPs）、雜種內(nèi)在蛋白（hybrid intrinsic proteins, HIPs）、大的內(nèi)在蛋白（large intrinsic proteins, LIPs）[5]。這8類AQP具有高度保守結(jié)構(gòu)，都有6個(gè)傾斜的右旋性跨膜結(jié)構(gòu)（TM1 to TM6），并被5個(gè)環(huán)（loop）所連接。

AQP不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程如生殖生長(zhǎng)、種子萌發(fā)、氣孔運(yùn)動(dòng)等方面起著重要作用[6-8]，而且能夠控制植物體內(nèi)的水分平衡而響應(yīng)干旱、高鹽和低溫等各種非生物脅迫[9-11]。相關(guān)報(bào)道顯示，在植物中過(guò)量表達(dá)一些 AQP家族基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)低溫脅迫的耐受性。在擬南芥中過(guò)表達(dá)MaPIP1;1能夠提高其抗寒能力[12]，MaSIP2-1提高了轉(zhuǎn)基因香蕉的耐寒性[9]，在煙草中轉(zhuǎn)化TaAQP7提高了其耐低溫的能力[13]。

綜上所述，當(dāng)前的研究揭示了AQP基因在提高植物抵抗非生物脅迫上起著重要的作用。目前西番蓮中關(guān)于AQP基因的功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以西番蓮全基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，在前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，選取了1個(gè)受到非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的 AQP基因PePIP2，對(duì)其進(jìn)行克隆并運(yùn)用生物信息學(xué)分析其核酸序列的特征、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)子元件等信息，并對(duì)其在干旱、高鹽、低溫、高溫脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證和研究，通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了其能夠響應(yīng)干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。研究結(jié)果對(duì)于深入了解AQP基因家族功能，同時(shí)為西番蓮抗逆功能基因的挖掘及抗逆育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取西番蓮‘臺(tái)農(nóng)’嫩葉，用無(wú)菌水清洗后立即用液氮速凍放-80℃冰箱備用，西番蓮取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站種苗組培中心。pCAMBIA1304表達(dá)載體取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站?？寺≥d體 pMD19-T、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真酶 PrimeS-TAR?Max DNA Polymerase、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、T4連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司，大腸桿菌感受態(tài)（E.coliDH5α）、農(nóng)桿菌感受態(tài)（EHA105）、質(zhì)粒提取試劑盒和 DNA回收試劑盒購(gòu)自AXY-GEN公司，DNA Marker （DL 2000）購(gòu)自北京中科瑞泰公司。無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。其他化學(xué)藥品為分析純。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA提取及 cDNA的獲得 將西番蓮‘臺(tái)農(nóng)’嫩葉用液氮研磨，按照柱式Trizol總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，將其反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的基因的獲得 從西番蓮基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得西番蓮AQP家族基因PePIP2的序列，利用NCBI Primer-BLAST在線工具設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，引物序列為 PePIP2F（5＇-ATGGCAAAGGATGTG GAGACAGCAG-3＇）和 PePIP2R（5＇-CTAAACAGT TGGGTTGCTCCTGAAG-3＇），以 cDNA 為模板擴(kuò)增PePIP2全長(zhǎng)序列。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 3 min；95℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃失活10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化回收，連接克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的單克隆菌落PCR鑒定，選取幾個(gè)PCR鑒定陽(yáng)性的克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用 ProtParam（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）在軟件線計(jì)算蛋白的等電點(diǎn)（pI）、分子量（Mw）和分子式。利用 Clustal X和 MEGA3軟件，將PePIP2所編碼的氨基酸序列與其他植物中的PIP的氨基酸序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的比對(duì)分析。利用 WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolfpsort.html）在線軟件預(yù)測(cè)它們的亞細(xì)胞定位點(diǎn)。從Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PePIP2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的2000 bp基因組DNA序列，用于鑒定PePIP2基因啟動(dòng)子區(qū)域的作用元件[14]。利用DNAMAN對(duì)各物種中的PIP2的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 不同非生物脅迫處理及不同組織中的表達(dá)選擇西番蓮‘臺(tái)農(nóng)’品種的健康無(wú)病毒組培苗，在培養(yǎng)室[溫度為 30℃；光照強(qiáng)度為200 μmol/(m2·s)；12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)；70%相對(duì)濕度]中生長(zhǎng)至約1 m并具有8~10個(gè)功能葉片時(shí)進(jìn)行各種非生物脅迫處理。干旱脅迫處理時(shí)，停止?jié)菜镣寥浪譃?50%和 10%時(shí)進(jìn)行葉片取樣。高鹽脅迫處理時(shí)，用300 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行澆灌幼苗分別在第3天和第10天時(shí)進(jìn)行葉片取樣。低溫處理時(shí)，將植株在0℃下分別處理20、48 h進(jìn)行葉片取樣。對(duì)于高溫處理時(shí)，植物在 45℃分別處理2、4、24 h進(jìn)行葉片取樣。進(jìn)行西番蓮不同組織中的表達(dá)，根、莖、葉分別取生長(zhǎng)至1 m并具有8~10個(gè)功能葉的西番蓮各幼嫩組織，花、果分別采自儋州實(shí)驗(yàn)基地的健康材料。對(duì)上述各樣品用液氮速凍，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)PePIP2全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物，qPePIP2F（5＇-AGGACTATCATGACCCACCACCA GCA-3＇）和 qPePIP2R（5＇-GCGATCCCAAGAATT CCAACACCAGC-3＇），選用西番蓮EF1α為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 表達(dá)載體的構(gòu)建 用添加NcoⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)的PePIP2全長(zhǎng)引物擴(kuò)增PePIP2-19T載體獲得 PCR產(chǎn)物，進(jìn)行純化回收。用NcoⅠ和SpeⅠ將獲得的PCR產(chǎn)物和pCAMBIA1304表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切，回收片段后進(jìn)行T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，將平板上的克隆進(jìn)行搖菌 PCR檢測(cè)，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。

1.2.6 干旱脅迫下的煙草瞬時(shí)表達(dá) 將構(gòu)建成功的 PePIP2-pCAMBIA1304載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，將驗(yàn)證成功的克隆搖菌保存。取1 mL農(nóng)桿菌接種至50 mL YEP液體培養(yǎng)基中，在 28℃搖床中搖至OD600=1.0。在8000 r/min轉(zhuǎn)速下，5 min離心收菌，配置含有0.2 mmol/L AS（乙酰丁香酮），10 mmol/L MgCl2，pH 5.6（KOH調(diào)pH）的10 mmol/L MES溶液，洗菌體，重懸至OD600=1.0。將重懸后的菌液室溫放置3~5 h，用1 mL注射器，去掉針頭，注射本氏煙草的葉片下表皮，黑暗培養(yǎng)48 h，切下直徑為 0.5 cm的葉盤(pán)，在 25℃下漂浮在含有 18%（m/V）的PEG 6000（模擬干旱脅迫）1/2 MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行 0、2、4、8、12、24、36、48 h處理，將各葉盤(pán)進(jìn)行液氮凍樣提取 RNA并反轉(zhuǎn)錄，對(duì)PePIP2基因在各處理下進(jìn)行熒光定量PCR分析檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PePIP2基因的克隆與鑒定

以西番蓮‘臺(tái)農(nóng)’嫩葉的cDNA為模板，用基因全長(zhǎng)引物PePIP2F和PePIP2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PePIP2的基因全長(zhǎng)為861 bp（圖1），編碼286個(gè)氨基酸（圖2）。

圖1 PePIP2基因克隆PCR鑒定Fig.1 PCR amplification of PePIP2 gene

圖2 PePIP2基因CDS區(qū)核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of PePIP2 CDS region

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1PePIP2編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析 利用Protparam在線軟件分析PePIP2的理化性質(zhì)，其分子式為 C1417H2156N360O373S8，分子量為 30 459.37 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為8.84。預(yù)測(cè)其定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2.2 氨基酸序列比對(duì) 由PePIP2推導(dǎo)的氨基酸序列與NCBI中已登錄的其他高等植物的PIP2氨基酸序列進(jìn)行同源關(guān)系的比較，結(jié)果顯示，各種植物PIP2編碼的氨基酸序列存在較高的同源性，多數(shù)都達(dá)到64%以上（圖3）。BLASTX分析表明，PePIP2編碼的氨基酸序列與銀白楊PaPIP2（Populus alba），含羞草MpPIP2（Mimosa pudica），麻風(fēng)樹(shù)JcPIP2（Jatropha curcas），菜豆PvPIP2（Phaseolus vulgaris），雷公藤TwPIP2（Tripterygium wilfordii），雨樹(shù)SsPIP2（Samanea saman）編碼的氨基酸序列具有較高的一致性，分別為 84.72%、84.38%、69.58%,、69.23%、68.53%、64.11%。

圖3 PePIP2氨基酸序列差異比對(duì)Fig.3 Sequence difference alignment of PePIP2 amino acid

2.2.3 PePIP2編碼蛋白質(zhì)的 Motif分析 利用Motif Search（http://www.genome.jp/tools/motif/）在線軟件對(duì)推導(dǎo)的 PePIP2氨基酸序列進(jìn)行生物學(xué)意義的位點(diǎn)分析（圖4），只在 30～265位點(diǎn)之間預(yù)測(cè)到1個(gè)MIP結(jié)構(gòu)域，位點(diǎn)230的氨基酸（A，丙氨酸）為主要內(nèi)在蛋白。

圖4 PePIP2蛋白序列Motif預(yù)測(cè)分析Fig.4 Motif prediction from deduced amino acid sequence of PePIP2

2.2.4PePIP2啟動(dòng)子元件分析 利用PlantCARE軟件對(duì)PePIP2基因的啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明該片段包含多個(gè)TATA-box和CAAT-box核心cis-acting element，其余的功能元件主要包括3個(gè)脫落酸響應(yīng)元件（ABRE），1個(gè)低溫響應(yīng)元件（LTR），1個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxRR-core），2個(gè)與厭氧反應(yīng)相關(guān)的元件（ARE），2個(gè)與防御相關(guān)的元件（TC-rich repeats），7種類型的光響應(yīng)元件（TCCC-motif, TCT-motif, ATCT-motif,Box 4, G-Box, AE-box, MRE）等（圖5）。該分析表明基因的功能可能和非生物脅迫和植物發(fā)育相關(guān)。

圖5 PePIP2啟動(dòng)子順式作用元件Fig.5 cis-acting element of PePIP2

2.2.5 PePIP2進(jìn)化樹(shù)分析 利用 Clustal X和MEGA3軟件，將PePIP2所編碼的氨基酸序列與其他植物中的 PIP2的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的比對(duì)分析。結(jié)果表明西番蓮PePIP2與含羞草MpPIP2（Mimosa pudica），木豆 CcPIP2（Cajanus cajan），大豆GsPIP2（Glycine soja）這3個(gè)物種的同源基因具有較近的親緣關(guān)系（圖6）。

2.3 不同非生物脅迫下及在各組織中的表達(dá)分析

前期對(duì)西番蓮在干旱、高鹽、高溫、低溫脅迫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，其中PePIP2受到干旱、高溫和低溫脅迫，其轉(zhuǎn)錄組FPKM值如表1。本研究對(duì)其進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明該基因未受到高鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)在干旱、高溫和低溫脅迫下均被誘導(dǎo)表達(dá)（圖7），其中在土壤含水量為50%，在45℃高溫處理4 h和0℃低溫處理48 h，其表達(dá)量最高。在對(duì)其進(jìn)行組織特異性的表達(dá)結(jié)果表明，PePIP2在西番蓮的各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在根部表達(dá)量最高（圖8）。

圖7 不同非生物脅迫中PePIP2的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of PePIP2 under different abiotic stresses

圖8 PePIP2在西番蓮不同組織中的表達(dá)模式Fig.8 Expression patterns of PePIP2 in different tissues of passion fruit

表1 PePIP2在非生物脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的FPKM值Tab.1 FPKM values of PePIP2 in abiotic stress transcriptome sequencing

2.4 PePIP2表達(dá)載體構(gòu)建

將PePIP2基因連接表達(dá)載體pCAMBIA-1304質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖9所示，在 861 bp處有酶切的條帶，與該基因大小一致。表明PePIP2已經(jīng)成功連接到pCAMBIA-1304載體上。

圖9 PePIP2-pCAMBIA-1304載體酶切驗(yàn)證圖Fig.9 Picture of PePIP2-pCAMBIA-1304 vector digestion verification

2.5 干旱脅迫下煙草瞬時(shí)表達(dá)分析

將各時(shí)期干旱脅迫處理的煙草提取 RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，對(duì)PePIP2基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明在經(jīng)過(guò)不同時(shí)期的干旱脅迫處理后，PePIP2均被誘導(dǎo)表達(dá)，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，其中當(dāng)干旱脅迫12 h其表達(dá)量最大（圖10）。

圖10 瞬時(shí)表達(dá)煙草葉片不同時(shí)間干旱脅迫下PePIP2的表達(dá)Fig.10 Transient expression of PePIP2 in tobacco leaves under drought stress at different times

3 討論

近年來(lái)，AQP在植物抵御非生物逆境脅迫方面的研究成為熱點(diǎn)，相關(guān)報(bào)道顯示，在植物中過(guò)量表達(dá)一些 AQP家族基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受性。目前的研究表明植物AQP中的PIPs亞家族與非生物脅迫關(guān)系最為緊密。在植物中過(guò)表達(dá)OsPIP1、OsPIP2、OsPIP1、VfPIP1、BnPIP1能夠增加植物對(duì)滲透脅迫或干旱脅迫的耐受性[15]。另外，香蕉MaPIP1;1的表達(dá)受到高鹽脅迫誘導(dǎo)，能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性[12]。擬南芥、水稻、玉米根和葉的轉(zhuǎn)錄組分析顯示大多數(shù)水通道蛋白基因表達(dá)受低溫脅迫抑制[16-17]。水稻OsPIP2;5的相對(duì)表達(dá)在長(zhǎng)期低溫處理后被顯著誘導(dǎo)[18]。一些水通道蛋白基因的表達(dá)被證實(shí)可顯著提高不同植物對(duì)非致死低溫的耐受能力，如小麥TaAQ7、水稻OsPIP2;7、香蕉MusaPIP1;2、MaPIP2;7、MaPIP1;4和MaPIP2;5[19-20]。香蕉MaPIP2-7的表達(dá)受低溫脅迫誘導(dǎo)，在香蕉中過(guò)量表達(dá)水通道蛋白基因可顯著提高香蕉對(duì)低溫脅迫的耐受能力[4]。本研究中對(duì)克隆到的西番蓮水通道蛋白基因PePIP2在不同非生物脅迫下的表達(dá)分析表明，該基因在干旱、高溫和低溫脅迫下均能被不同程度上誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，其在不同時(shí)間的干旱脅迫下也被誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明該基因能響應(yīng)不同的非生物脅迫。

本研究對(duì)其序列推導(dǎo)蛋白的氨基酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其富含丙氨酸（A）；親疏水性分析表明其親水氨基酸少于疏水氨基酸，推測(cè)其蛋白為疏水蛋白；對(duì)序列進(jìn)行生物學(xué)意義位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，PePIP2的氨基酸序列上具有典型MIP結(jié)構(gòu)域，符合PIP蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。結(jié)果表明，PePIP2蛋白與木豆、大豆和含羞草的蛋白遺傳距離最近，與萬(wàn)壽菊和橡膠樹(shù)的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，表現(xiàn)為親緣關(guān)系近的同源性較高，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的同源性低的特點(diǎn)[21]。目前在香蕉等[6]植物的 PIP基因功能研究比較深入，可為西番蓮PIP基因的功能提供研究方向。對(duì)該啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明PePIP2基因啟動(dòng)子中包括響應(yīng)低溫、脫落酸、生長(zhǎng)素以及光響應(yīng)元件。說(shuō)明該基因可能和非生物脅迫與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程相關(guān)。啟動(dòng)子對(duì)于啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)基因在時(shí)間和空間上的表達(dá)起了重要的作用[22]。因此，選擇具有誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子能夠有效驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。

本研究通過(guò)同源克隆了西番蓮水通道蛋白基因PePIP2的全長(zhǎng)序列，運(yùn)用生物信息學(xué)分析該基因及其編碼的氨基酸序列，并根據(jù)氨基酸多重序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，啟動(dòng)子元件分析等推測(cè)其生物學(xué)功能，并在干旱、高鹽、高溫和低溫等非生物脅迫下對(duì)該基因表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明PePIP2能夠響應(yīng)干旱、高溫和低溫脅迫。在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了PePIP2能夠響應(yīng)干旱脅迫。本研究為進(jìn)一步對(duì)水通道蛋白的功能分析和表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)研究可將其過(guò)表達(dá)模式植物擬南芥等進(jìn)行進(jìn)一步研究，驗(yàn)證PePIP2在抗非生物脅迫中的功能。