簡永利，涂宜強(qiáng)，王會寶，高永安，王 蒙，于三科，宋軍科*

(1.溫州科技職業(yè)學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325006；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種主要寄生于人和多種動物胃腸道和呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)的寄生性原蟲，在多數(shù)國家和地區(qū)廣泛分布[1]，引起感染宿主以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的隱孢子蟲病。目前，隱孢子蟲已鑒定40多個有效種和70多個基因型[2-3]，主要通過其卵囊污染的水源、食物或接觸感染的動物或人等多種途徑進(jìn)行廣泛傳播[4]。

在家畜中，反芻動物被認(rèn)為是宿主特異性和人獸共患性隱孢子蟲的重要宿主，其排出的大量卵囊可污染周圍環(huán)境[5]。奶牛可感染的隱孢子蟲種類較多，微小隱孢子蟲(C.parvum)、牛隱孢子蟲(C.bovis)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)和瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)等是奶牛感染的主要常見隱孢子蟲蟲種，偶爾也有感染貓隱孢子蟲(C.felis)、人隱孢子蟲(C.hominis)、豬隱孢子蟲(C.Suis)、火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)等其他隱孢子蟲種的報道[6-7]。感染后奶牛主要表現(xiàn)腹瀉、腹痛、嘔吐、體重減輕、產(chǎn)奶量減少等臨床癥狀[8-9]，特別是對小于1月齡的犢牛還可能引起致死性腹瀉[10]，這不僅給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且牛感染的C.parvum和C.andersoni等隱孢子蟲種類對人類健康有潛在的威脅[1,11]。對我國陜西、河南、黑龍江和寧夏等地區(qū)牛隱孢子蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查結(jié)果顯示，感染率從4.94%～47.7%不等[1,6-7]，且在不同地區(qū)，牛隱孢子蟲的種類分布、分子特征等方面存在較大差異。

奶牛產(chǎn)業(yè)是我國農(nóng)業(yè)的重要組成部分，我國奶牛養(yǎng)殖量位居世界前列。近年來，浙江溫州地區(qū)奶牛產(chǎn)業(yè)在龍頭企業(yè)的帶動下不斷持續(xù)向好發(fā)展，年存欄量近1萬頭，但目前尚未有對該地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況的報道。本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)對該地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查，分析奶牛隱孢子蟲感染情況和種類分布，為奶牛隱孢子蟲病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 糞便樣品共85份，分別采自位于平陽縣、瑞安市、樂清市等浙江省溫洲地區(qū)的3個奶牛場。其中，3月齡內(nèi)斷奶犢牛樣品28份，3月齡～6月齡斷奶后犢牛樣品14份，6月齡～12月齡育成牛樣品26份，1歲以上成年奶牛樣品17份(表1)。除1月齡內(nèi)新生犢牛分開隔離飼養(yǎng)在籠舍內(nèi)，其他奶牛按照年齡段隔離混合飼養(yǎng)。在奶牛場做好自身生物安全防護(hù)措施的前提下，用一次性塑料手套直腸采集糞便，低溫運(yùn)送至溫州科技職業(yè)學(xué)院實驗室，每份糞便樣品保存于離心管中，并標(biāo)記動物年齡、采集地點、時間等信息，置于25 g/L重鉻酸鉀溶液中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 奶牛糞便樣品信息

1.1.2 主要試劑和儀器 25 g/L重鉻酸鉀溶液，上海試一化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；糞樣DNA提取試劑盒，Omega生物科技公司產(chǎn)品；rTaqDNA 聚合酶體系，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖、DNA Marker DL 2 000，寶生生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；PCR儀為eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 從25 g/L的重鉻酸鉀溶液中取糞樣0.2 g于1.5 mL離心管中，滅菌雙蒸水洗滌3次～4次直至上清液清亮，按照DNA試劑盒說明提取糞樣DNA，并保存于-20℃?zhèn)溆?。引物參照文獻(xiàn)[12]，由上海生工生物工程有限公司合成。SSUrRNA基因的PCR反應(yīng)為套式PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL， dNTP 2.0 μL， MgCl22.0 μL，第1輪(或第2輪)上、下游引物各1.0 μL，rTaq酶0.125 μL，模板DNA 1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。取第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍攝成像。第2輪陽性PCR產(chǎn)物直接送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.2 序列分析 雙向測序成功的隱孢子蟲基因序列拼接后，用Clustal X1.83軟件比對，再對照測序圖譜進(jìn)行校正。校正的序列在GenBank上的Blastn進(jìn)行同源性比對和分析。用MEGA6.0軟件進(jìn)行種群遺傳進(jìn)化分析，構(gòu)建Neighbor-Joining進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 SSU rRNA基因擴(kuò)增

用基于SSUrRNA基因的套式PCR對采集的85份糞樣DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在29份糞便樣品中成功擴(kuò)增出約830 bp的目的片段，部分代表性樣品的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對照；2～7、9.奶牛隱孢子蟲陽性糞便樣品；8.奶牛隱孢子蟲陰性樣品；10.陽性對照

2.2 奶牛隱孢子蟲感染情況和種類分布

本次調(diào)查的3個奶牛場均有隱孢子蟲感染，總感染率為34.1%(29/85)。其中瑞安市奶牛場奶牛感染率為12.0%(3/25)，樂清市奶牛場為46.2%(6/13)，平陽縣為42.6%(20/47)，樂清、平陽奶牛場隱孢子蟲感染率明顯高于瑞安奶牛場。不同年齡段的奶牛均有隱孢子蟲感染，斷奶前犢牛感染率為64.3%(18/28)，其余年齡段感染率由高到低依此為成年奶牛23.5%(4/17)、斷奶后犢牛21.4%(3/14)、育成牛15.4%(4/26)(表2)。

表2 溫州地區(qū)3個奶牛場隱孢子蟲感染和蟲種分布情況

基于SSUrRNA基因的序列比對分析，結(jié)果顯示，溫州地區(qū)奶牛場共檢出4種隱孢子蟲種，即牛隱孢子蟲(C.bovis)、瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)和奇異隱孢子蟲(C.occultus)。在29份陽性樣品中，C.bovis的感染數(shù)最多，占比最高，且分布范圍廣，是溫州地區(qū)奶牛場感染的優(yōu)勢蟲種。結(jié)果表明，奶牛場普遍感染2種～3種隱孢子蟲，其中瑞安牧場奶牛感染的有C.bovis和C.ryanae，樂清奶牛主要感染的有C.andersoni和C.occultus，而平陽奶牛感染有3種隱孢子蟲種，分別為C.bovis、C.ryanae和C.andersoni。另外，C.bovis、C.ryanae和C.andersoni等3個種類在斷奶前犢牛、斷奶后犢牛和育成牛都有分布，但C.bovis和C.ryanae主要集中分布于斷奶前犢牛，是斷奶前犢牛感染的優(yōu)勢蟲種。C.andersoni分布于各年齡段，但主要集中分布于斷奶前犢牛和成年奶牛。此外，在樂清牧場1個斷奶后犢牛的樣品中檢出了C.occultus。

2.3 序列分析

將29份糞便陽性樣品送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司雙向測序，除3個樣品測序不成功以外，其他序列拼接后再用Clustal X1.83軟件比對校正，總共得到26條序列。序列比對結(jié)果顯示，9份為牛隱孢子蟲、7份為瑞氏隱孢子蟲、9份為安氏隱孢子蟲、1份為奇異隱孢子蟲。

基于SSUrRNA基因位點對本研究中的隱孢子蟲進(jìn)行分類鑒定，以卵形瘧原蟲(Plasmodiumovale，GenBank登錄號： KP050371)作為外群，利用MEGA6.0軟件對獲得的序列進(jìn)行種群遺傳進(jìn)化樹分析(圖2)。結(jié)果表明，分別有9個序列與C.bovis、7個序列與C.ryanae、9個序列與C.andersoni、1個序列與C.occultus分別聚在同一分支上，親緣關(guān)系較近。

圖2 牛隱孢子蟲SSU rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

隱孢子蟲隸屬于頂復(fù)門重要原蟲，主要寄生在人和動物的胃腸道，導(dǎo)致宿主出現(xiàn)輕度、中度甚至重度腹瀉。研究表明，奶牛普遍感染隱孢子蟲，但不同國家或地區(qū)感染率不同。馬來西亞牛隱孢子蟲的總感染率為12.5%[14]，埃及奶牛的感染率為9.7%[15]，日本斷奶前犢牛感染率為83.8%[16]。本次調(diào)查中，85份奶牛樣品中，有29份樣品檢出隱孢子蟲陽性，3個奶牛場隱孢子蟲的總感染率達(dá)34.1%，其中樂清市和平陽縣奶牛場奶牛隱孢子蟲的感染率達(dá)40%以上。與國內(nèi)奶牛隱孢子蟲感染情況相比，其感染率高于曾經(jīng)在寧夏(1.61%，23/1366)、四川省(14.4%，40/278)、廣東省(24.0%，93/388)的調(diào)查結(jié)果[17-19]，也高于在牦牛(20.92%)、肉牛(10.47%)、水牛(15.50%)的調(diào)查結(jié)果[7]。本研究中，奶牛隱孢子蟲感染率明顯高于其他地區(qū)，這可能與該地區(qū)濕熱的氣候、地理環(huán)境、飼養(yǎng)方式、動物品種與年齡、檢測方法等因素有關(guān)。

研究表明，隱孢子蟲的感染與日齡相關(guān)，隨著奶牛日齡增加，隱孢子蟲感染率呈明顯下降趨勢[4,15]。本次調(diào)查中，各年齡段的奶牛均存在隱孢子蟲感染，斷奶前犢牛感染率最高(64.3%)，而斷奶后犢牛(21.4%)和育成牛(15.4%)的感染率稍低，這也與此前的研究報道結(jié)果相一致[19-20]，但成年奶牛的感染率(23.5%)略高于斷奶后犢牛和育成牛。此外，有調(diào)查結(jié)果顯示，牛隱孢子蟲種類分布也具有一定的年齡相關(guān)性，斷奶前犢牛主要感染C.parvum，而斷奶后犢牛感染有C.bovis和C.ryanae，而C.andersoni則主要感染育成牛和成年牛[4,6,19-20]。本研究表明，溫州地區(qū)3個奶牛場的奶牛感染的隱孢子蟲種類有4種，分別為C.bovis、C.andersoni、C.ryanae和C.occultus，其中斷奶前犢牛感染3種隱孢子蟲，即C.bovis、C.ryanae和C.andersoni，C.bovis和C.ryanae是斷奶前犢牛感染的優(yōu)勢蟲種，這與我國陜西、四川等地區(qū)調(diào)查的結(jié)果基本一致[21-22]，而與河南、新疆等地報道不同，斷奶前犢牛主要感染的是C.parvum[3,23]。C.andersoni在各年齡段奶牛均有分布，但主要集中分布于斷奶前犢牛和成年奶牛。

因C.occultus與C.suis遺傳進(jìn)化關(guān)系較近，此前曾被命名為C.suis-like，后來發(fā)現(xiàn)其卵囊比C.suis小，具有明顯形態(tài)學(xué)差異，因此， Kvác M在2018年將其命名為一個新的有效種[24]。C.occultus可感染牛、牦牛、水牛、老鼠等廣泛的宿主，但主要感染的宿主為老鼠。我國也有牛、牦牛、野鼠感染的情況[25-26]，廣西也有兒童感染C.occultus的首例報道[27]。本次調(diào)查中，樂清牧場的1個斷奶后犢牛樣品中檢出了C.occultus，提示存在人獸共感染的風(fēng)險，建議該牧場需加強(qiáng)奶牛糞便管理工作，避免造成食物、水源的污染。

C.parvum是一種重要的人獸共患原蟲[27]，主要感染斷奶前犢牛，近年來新疆、江蘇、河北等多地報道了新生犢牛因感染C.parvum而暴發(fā)隱孢子蟲病的案例[3,9,28]。而本次調(diào)查中，并未檢測到奶牛感染C.parvum，一方面可能是由于斷奶前犢牛排出的C.bovis和C.ryanae卵囊量較多，而用于多種隱孢子蟲鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)優(yōu)先擴(kuò)增DNA含量較高的樣本，另一方面也提示該地區(qū)奶牛傳播微小隱孢子蟲對人的風(fēng)險較低。