馮夢迪，馬雪連，孫亞偉，易鵬飛，吳 靜，王 凡，陳玉珠，楊朝輝，鐘 旗，姚 剛

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院研究所，新疆烏魯木齊 830011)

母牛的妊娠損失是指胎兒或胚胎與母體之間由于疾病、中毒、應(yīng)激、營養(yǎng)和飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)榷喾N因素的影響下發(fā)生的胎兒或胚胎病理變化，造成妊娠中斷，最終胎兒死亡的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為流產(chǎn)和死胎[1]。導(dǎo)致妊娠損失的主要疫病有牛傳染性鼻氣管炎(Bovine infectious rhinotracheitis，IBR)、牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)和布魯氏菌病(Brucellosis)等。世界動物衛(wèi)生組織曾將IBR列為B類疫病[2]，我國明確規(guī)定，凡是進(jìn)出口的牛及其相關(guān)制品，必須進(jìn)行IBRV的檢測。BVD是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的一種急性、熱性傳染病[3]；20世紀(jì)80年代初首次證實(shí)BVDV在我國存在[4]，新疆部分地區(qū)牛群BVDV抗體平均陽性率在70%左右[5]。布魯氏菌病是危害公共衛(wèi)生和家畜養(yǎng)殖業(yè)的人獸共患病之一，以牛和羊的感染最為嚴(yán)重[6]。布魯氏菌可引起懷孕母畜發(fā)生流產(chǎn)，常見于妊娠的中后期，且流產(chǎn)后長期不孕[7]。本研究針對2020年-2021年新疆某安格斯肉牛場母牛妊娠損失進(jìn)行調(diào)查，對妊娠損失相關(guān)疫病IBR、BVD和布魯氏菌病進(jìn)行病原檢測，篩查導(dǎo)致母牛妊娠損失的主要原因，以期為防控牛場母牛妊娠損失提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 針對新疆某安格斯肉牛繁育場2020年-2021年母牛妊娠損失情況進(jìn)行臨床調(diào)查，并采集新疆某規(guī)?；馀７庇龍鲇腥焉飺p失史的母牛鼻拭子、肛拭子、抗凝血以及全血樣品各150份，全血分離血清，抗凝血4℃保存，其他樣品置-20℃保存，用于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.1.2 試劑 天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，2×TaqPCR Mix，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，北京莊盟國際生物基因科技有限公司產(chǎn)品；Omega組織DNA提取試劑盒，Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品；Trizol，Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；1×TAE緩沖液，揚(yáng)州優(yōu)邦生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀(Universal Hood Ⅱ)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；離心機(jī)，上海凌儀生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 IBRV的檢測

1.2.1.1 IBRV PCR檢測 根據(jù)Omega組織DNA提取試劑盒操作說明書對采集的150份鼻拭子提取DNA。參照GenBank已公布的IBRV序列利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，IBRV-F：5′-CTCTACCGCACGGGCACCT-3′，IBRV-R：5′-GCGGCTCTCGTCTCGCA-3′；擴(kuò)增片段長度為360 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

反應(yīng)體系為：PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.1.2 IBRV-Ab ELISA檢測 采用牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體(IBRV-Ab)ELISA檢測試劑盒，按照操作說明，根據(jù)顯色的深淺，并用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，判斷樣品是否含有IBRV-Ab。根據(jù)樣品的OD值判斷結(jié)果。試驗(yàn)有效性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；陰性對照孔OD值平均值≤0.15。臨界值=陰性對照孔平均值+0.15；樣品OD值<臨界值，樣品為陰性；樣品OD值>臨界值，樣品為陽性。

1.2.2 BVDV RT-PCR檢測 用Trizol法提取150份肛拭子樣品的RNA，參照GenBank已公布的BVDV序列用Primer 5.0設(shè)計(jì)的引物，BVDV-F：5′-AGTCGTCAGTGGTTCGAC-3′，BVDV-R：5′-TCCATGTGCCATGTACA-3′；擴(kuò)增片段長度為201 bp。RT-PCR檢測方法檢測BVDV，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系為：PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 布魯氏菌的檢測 對150份血清樣品進(jìn)行布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)和試管凝集試驗(yàn)(SAT)，按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行結(jié)果判定，陽性血清再用特異性高的半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(NH-GD)進(jìn)行最終確診。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用Excel MATLAB Origin數(shù)據(jù)處理軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用分布式計(jì)算集群分析和分類匯總數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 妊娠損失臨床調(diào)查結(jié)果

該牛場分別在2020年3月和6月進(jìn)行全群布魯氏菌病免疫；在2021年2月～4月全群免疫BVDV，5月底免疫效價(jià)檢測結(jié)果顯示，該牛場BVDV抗體陽性率87.5%；2021年7月～9月對部分牛進(jìn)行了IBRV免疫。本研究于2020年10月18日至2021年10月9日，調(diào)查新疆某安格斯肉牛繁育場的妊娠母牛定胎頭數(shù)9 860頭。累計(jì)妊娠損失422頭次，妊娠損失率為4.28%。其中流產(chǎn)214頭次，流產(chǎn)占妊娠損失的50.71%；死胎208頭次，死胎占妊娠損失的49.29%。流產(chǎn)平均在胎天數(shù)175 d，死胎平均在胎253 d(表1)。

表1 母牛妊娠損失的季節(jié)變化

2.2 妊娠損失相關(guān)疫病檢測結(jié)果

2.2.1 IBRV檢測結(jié)果 檢測樣本數(shù)為150頭份，ELISA陽性95頭份，陽性檢出率為63.33%；PCR陽性64頭份，陽性檢出率為42.67%。部分妊娠損失母牛鼻拭子陽性樣本PCR檢測結(jié)果見圖1。在360 bp處出現(xiàn)IBRV特異條帶。IBRV抗體陽性率為63.33%(95/150)，抗原陽性率為42.67%(64/150)。對相應(yīng)樣本的IBRV抗原與抗體檢測結(jié)果進(jìn)行比較表明，發(fā)現(xiàn)抗原呈陰性、抗體呈陽性較多，占檢測樣本總數(shù)的39.33%(59/150)，結(jié)果見表2。

表2 IBR抗原抗體檢測結(jié)果比較

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；NC.陰性對照；AC.陽性對照；1～15.樣品PCR檢測結(jié)果

2.2.2 BVDV檢測結(jié)果 用PCR技術(shù)對150份糞便樣品進(jìn)行病原檢測，共檢出2份陽性BVDV，陽性率為1.33%，部分PCR電泳結(jié)果見圖2。

2.2.3 布魯氏菌檢測結(jié)果 對150份血清樣品檢測結(jié)果顯示，RBT檢測陽性率為10.67%，SAT檢測陽性率為0，對經(jīng)RBT檢測陽性的16份樣品再進(jìn)行NH-GD檢測，陽性率為0(表3)。

表3 布魯氏菌病檢測結(jié)果

3 討論

引起母牛妊娠損失的因素很多，一般分為傳染性因素和非傳染性因素。傳染性因素[9]包括細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲等，非傳染性因素有營養(yǎng)、遺傳、應(yīng)激等因素[10]。對該牛場從飼料質(zhì)量角度分析，2021年8月部分圈舍出現(xiàn)大面積腹瀉，通過檢測飼草，查看現(xiàn)場，判斷與飼喂草料配比不規(guī)范有關(guān)。及時調(diào)整飼料配比，8月底至10月流產(chǎn)2頭，與期間共計(jì)36頭流產(chǎn)頭數(shù)相比，整改措施顯著。新疆地區(qū)冬夏溫差較大，飼料保存不當(dāng)可造成霉變或營養(yǎng)流失，妊娠母牛中毒或營養(yǎng)缺乏發(fā)生妊娠損失。該牛場發(fā)生妊娠損失的母牛均為頭胎牛，易發(fā)生妊娠損失。秋季發(fā)生妊娠損失的母牛為5.35%，比春季高1.81%，比夏季高1.13%，比冬季高1.07%。該牛場在2月～4月BVDV疫苗注射后60 d內(nèi)流產(chǎn)早產(chǎn)比例達(dá)12%，說明BVDV疫苗注射與妊娠損失有一定的關(guān)系。對免疫效價(jià)檢測顯示有其他環(huán)境菌感染的可能性。

BVDV和IBRV均可通過宮內(nèi)感染引起妊娠母牛流產(chǎn)、死產(chǎn)、不孕等癥狀，是導(dǎo)致母牛發(fā)生妊娠損失的重要病毒病原體[11]。本調(diào)研結(jié)果發(fā)現(xiàn)引起新疆某肉牛場母牛流產(chǎn)的病原主要是IBRV和布魯氏菌。IBRV抗體陽性率為63.33%(95/150)，該肉牛場應(yīng)重視IBRV防控，加強(qiáng)對IBRV的免疫。該牛場進(jìn)行了BVDV全群免疫，是否為一過性感染有待確定，所以對于BVD的防控不能松懈。對采集樣品進(jìn)行布魯氏菌病檢測，RBT陽性率為10.67%，SAT和NH-GD無陽性結(jié)果，說明該肉牛場2020年-2021年度布魯氏菌病防控工作良好。

本調(diào)查發(fā)現(xiàn)該肉牛養(yǎng)殖場存在BVDV和IBRV感染，這兩種病原體在母牛的妊娠損失中存在協(xié)同作用的可能[12]。建議用IBR滅活苗或BVD-IBR二聯(lián)滅活苗免疫健康牛，剔除BVDV的持續(xù)性感染牛；同時加強(qiáng)布魯氏菌病抗體監(jiān)測，對布魯氏菌抗體陽性牛定期復(fù)檢，如再有陽性出現(xiàn)，淘汰陽性牛。制定并實(shí)施牛場的疫苗免疫和生物安全風(fēng)險(xiǎn)防控措施，以期降低母牛妊娠損失。