楊燕妮，勾偉穎，段辛威，李西海，陳友琴，馬德尊，葉錦霞，付長龍，鄭春松*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；4.美國凱斯西儲大學(xué)醫(yī)學(xué)院，美國 俄亥俄州 44106；5.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種高發(fā)于青少年的常見原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有發(fā)病率高、惡性度大、轉(zhuǎn)移較早的特點(diǎn)［1］。目前西醫(yī)治療多采用手術(shù)治療，輔以化療等，但即使采用較強(qiáng)殺傷力的術(shù)前化療方案，仍有20%～30%的患者療效欠佳，表現(xiàn)為復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和最終死亡。而且，在治療過程中發(fā)現(xiàn)化療藥物對血液系統(tǒng)、胃腸道、肝臟、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)等方面具有毒副作用［2］。因此，尋找安全、高效的藥物來治療OS 是急需解決的問題。

近年來，中醫(yī)藥在治療OS 上發(fā)揮越來越重要的作用，有學(xué)者查閱了1979 年1 月—2014 年12 月中醫(yī)診療OS 的文獻(xiàn)，總結(jié)其用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)沒藥是OS 臨床中使用頻次高的活血化瘀中藥［3］。現(xiàn)代藥理研究表明，沒藥中天竺葵素（pelargonidin）、鞣花酸（ellagic acid）和槲皮素（quercetin）等化合物具有抑制OS 細(xì)胞增殖的作用，提示沒藥及其活性成分在治療OS 方面有一定的開發(fā)價值［4-6］。但是，沒藥治療OS 的具體作用機(jī)制未見相關(guān)報道。因此，本研究基于化學(xué)空間、相似度分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的計算機(jī)模擬策略［7-8］，探討沒藥治療OS 多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的整體調(diào)節(jié)作用機(jī)制，并將篩選出來的核心靶基因與對應(yīng)的沒藥活性成分進(jìn)行對接，以初步驗(yàn)證沒藥治療OS 的主要成分和靶點(diǎn)，進(jìn)而為其治療OS 的后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供方向，有助于沒藥的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。

1 方 法

1.1 沒藥潛在及已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集建立 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）檢索沒藥的化學(xué)成分［9］，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為閾值［7］，篩選出其潛在活性成分。從中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中檢索具有抗OS作用的化合物，在Discovery Studio 2.0（簡稱DS 2.0）模擬平臺［10］，轉(zhuǎn)化成三維分子結(jié)構(gòu)，用MMFF 力場優(yōu)化，分別建立沒藥潛在活性成分及已報道活性化合物的數(shù)據(jù)集sd 文件。

1.2 沒藥潛在及已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集化學(xué)空間構(gòu)建與分析 在DS QSAR 模塊下，選擇分子量、氫鍵受體數(shù)目、氫鍵給體數(shù)目、脂水分配系數(shù)和可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目等84 個分子描述符參數(shù)，分別構(gòu)建沒藥和已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集化合物的多維化學(xué)空間［11-12］；利用主成分分析技術(shù)［13］，降維到三維化學(xué)空間上。若兩數(shù)據(jù)集中的化合物在化學(xué)空間上距離越近，代表具有相似作用的可能性越大［14］，由此揭示沒藥治療OS 的可能性。

1.3 沒藥潛在及已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集的相似分子搜索 在DS Library Analysis 模塊下，選擇“Find Similar Molecular by Fingerprints”，以已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集為Reference Ligands，以沒藥潛在活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集為Input Ligands，其余參數(shù)為缺省值。運(yùn)行此Protocol，獲得沒藥中與已報道活性成分結(jié)構(gòu)特征相似的分子，以進(jìn)一步確定沒藥治療OS 的作用。

1.4 沒藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與OS 疾病靶點(diǎn)收集 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取沒藥活性成分對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫的基因名稱轉(zhuǎn)換工具，將蛋白靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為基因名，得到?jīng)]藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)基因。在GEO DataSets（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中篩選出同時含有OS 與正常骨組織樣本的基因芯片為GSE36004、GSE36001、GSE33383、GSE33382 和GSE14359，利用Log2 算法對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，篩選出每個芯片中差異表達(dá)基因，同時在OMIM（https：//www.omim.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中獲取OS 疾病相關(guān)靶點(diǎn)，將上述數(shù)據(jù)庫中的差異基因取并集，刪除重復(fù)基因［15］，作為OS 疾病基因集。

1.5 沒藥活性成分-OS 靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將沒藥活性成分的潛在靶基因與OS 疾病基因取交集，獲得共同靶點(diǎn)，將共同靶點(diǎn)及其對應(yīng)的沒藥活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 軟件［16］，構(gòu)建沒藥活性成分-OS 靶點(diǎn)作用的網(wǎng)絡(luò)。

1.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將“1.5”項(xiàng)下得到的交集基因?qū)隨TRING 11.5 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/cgi/input）中，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，選打分值高于0.9 的蛋白并除去網(wǎng)絡(luò)中與其他靶點(diǎn)斷開連接的節(jié)點(diǎn)，建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape 3.8.1 軟件中對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析［17］，獲得各節(jié)點(diǎn)介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closenness centrality，CC）、度中心（degree centrality，DC）、特征向量中心（eigenvector centrality，EC）、局部邊聯(lián)通性（local average centrality，LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）數(shù)值，以各拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)值均大于對應(yīng)中位數(shù)值作為篩選條件［18］，得到核心靶基因。

1.7 GO 和KEGG 富集分析 利用基于R 語言、面向基因組信息分析的Bioconductor 軟件合集［19］，對交集基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes genomes，KEGG）富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05，探索沒藥中各化合物作用潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及可能參與的代謝通路。

1.8 核心靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證 選擇“1.6”項(xiàng)下核心靶基因及其對應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對接［20］，即在PubChem 數(shù)據(jù)庫中查找沒藥活性成分的2D 化學(xué)結(jié)構(gòu)，用ChemOffice 軟件轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)并進(jìn)行能量最小化優(yōu)化，保存為MOL2 格式。使用PBD 網(wǎng)站（https：//www.rcsb.org/）下載靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，保存為pbd 格式，導(dǎo)入PyMol 2.4.1 軟件中，刪除水分子以及原配體，然后導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6 軟件，對靶蛋白與藥物小分子進(jìn)行處理并轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式，并設(shè)置活性口袋（Grid Box）大小，運(yùn)用Vina 進(jìn)行分子對接，獲取沒藥活性成分與靶蛋白的對接結(jié)果，用PyMol 軟件打開查看對接圖片結(jié)果，繪制結(jié)合模式圖。

2 結(jié) 果

2.1 沒藥潛在活性成分篩選 根據(jù)篩選條件OB≥30%和DL≥0.18，從TCMSP 平臺中篩選出沒藥有45 個潛在活性成分，其中有槲皮素、豆甾醇、鞣花酸等，見表1。

表 1 沒藥活性成分及其參數(shù)值

2.2 沒藥潛在及已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集的化學(xué)空間和相似度分析 沒藥潛在活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集在化學(xué)空間上具有較好的分散性，與已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集有相同或相近的化學(xué)空間，見圖1。兩者在分子量、氫鍵受體、氫鍵給體、脂水分配系數(shù)、環(huán)數(shù)目和可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)方面，具有很大部分的重疊，見表2。

2.3 沒藥潛在及已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集的相似分子搜索 以已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集為參照配體，以Tanimoto相似系數(shù)為評價指標(biāo)，從沒藥潛在活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集篩選出相似的分子MOL000098、MOL001001、MOL001126、MOL000358和MOL000449，相似度值分別為1、0.733、0.544、0.472 和0.466。

2.4 沒藥活性成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集到?jīng)]藥潛在活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)基因共393 個；在OMIM、PharmGkb、DrugBank、GEO 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫中共得到5 114 個OS 疾病差異表達(dá)基因。取交集，得到共同靶點(diǎn)129個，在TCMSP中對應(yīng)的沒藥潛在活性成分32 個，在Cyotoscape 3.8.1軟件中構(gòu)建沒藥活性成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中有161 個節(jié)點(diǎn)，283 條邊；且有3 個化合物只作用1 個靶點(diǎn)，有8 個作用2 個靶點(diǎn)，有21 個作用3 個及以上靶點(diǎn)，見圖2。

圖1 沒藥潛在及已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集的化學(xué)空間圖

表2 沒藥潛在及已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集的描述符值

圖2 沒藥活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 沒藥治療OS 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其核心靶點(diǎn)篩選 把129 個交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫中，得到?jīng)]藥治療OS 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中有116 個節(jié)點(diǎn)，449 條邊，見圖3。在Cyotoscape 3.8.1軟件中對119 個基因進(jìn)行2 次網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)篩選，得到?jīng)]藥治療OS 的8 個潛在核心基因，分別為Akt 絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt serine/threonine kinase 1，Akt1）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、FOS 原癌基因（fos proto-oncogene，F(xiàn)OS）、熱 休 克蛋 白90 α 家 族A 類 成員1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、JUN 原 癌 基 因（Jun proto-oncogene，JUN）、雌激素受體相關(guān)受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、RELA 原癌基因（RELA proto-oncogene，RELA）和MYC 原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC），結(jié)果見圖4。

圖3 沒藥治療骨肉瘤的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO 和KEGG 富集分析

2.6.1 GO 功能富集分析 對129 個交集基因進(jìn)行GO 富集分析，共有2 174 條結(jié)果，其中BP 共有1 987 條結(jié)果，主要集中在對藥物的應(yīng)答（response to drug）、輻射的應(yīng)答（response to radiation）、化學(xué)應(yīng)激（cellular response to chemical stress）、脂多糖的應(yīng)答（response to lipopolysaccharide）、細(xì)菌來源分子的應(yīng)答（response to molecule of bacterial origin）、金屬離子的應(yīng)答（response to metalion）、氧水平的應(yīng)答（response to oxygen levels）、類固醇激素的應(yīng)答（response to steroid hormone）、活性氧代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）等；CC 共 有40 條結(jié)果，主要集中在膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、細(xì)胞器外膜（organelle outer membrane）、外膜（outer membrane）、線粒體外膜（mitochondrial outer membrane）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物（serine/threonine protein kinase complex）、蛋白激酶復(fù)合物（protein kinase complex）、髓鞘（myelin sheath）等；MF 富集共有147 條結(jié)果，主要有DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA 聚合酶Ⅱ-特異性DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ-specific dna-binding transcription factor binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin protein ligase binding）、核受體活性配體激活（ligand-actived nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)結(jié)合（transcription coregulator binding）、轉(zhuǎn)錄共激活劑結(jié)合（transcription coactivator binding）等。取各類富集分析前10 個結(jié)果作氣泡圖，見圖5。

圖4 沒藥治療骨肉瘤的核心靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 沒藥GO 功能富集分析圖

2.6.2 KEGG 富集分析 KEGG 富集分析有172 條信號通路，主要有脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、卡波西肉瘤相關(guān)化學(xué)致癌-受體活化（Kaposi sarcoma-associated chemical carcinogenesis-receptor activation）、皰疹病毒感染（herpesvirus infection）、人類巨細(xì)胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、乙型肝炎（hepatitis B）、前列腺癌（prostate cancer）、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、丙 型 肝 炎（hepatitis C）、愛潑斯坦-巴爾病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路作用（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、人T 細(xì) 胞 白 血 病 病 毒1 感 染（human T-cell leukemia virus 1 infection）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、癌癥中蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、細(xì)胞衰老（cellular senescence）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）細(xì)胞凋亡（apoptosis）、C-型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、p53 信 號（p53 signaling pathway）通路、慢性骨髓性白血?。╟hronic myeloid leukemia）以及肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma）、小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer）、乳腺癌（breast cancer）等癌癥相關(guān)通路等，前30 條富集結(jié)果見圖6。

圖6 沒藥KEGG 富集分析結(jié)果圖

2.7 分子對接 對8 個沒藥治療OS 的核心靶點(diǎn)及其對應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示沒藥的化學(xué)成分與上述8 個核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均＜-4 kcal/mol，表現(xiàn)出良好的結(jié)合能力，見表3。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血瘀日久致毒，瘀毒相互膠著，合而為害，蘊(yùn)而生變，終成肉瘤，提示瘀血內(nèi)阻為OS 的重要病機(jī)之一，治療上可從活血化瘀論治［3］。而且，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明活血化瘀法可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的HIF-1α、CD4+T 細(xì)胞發(fā)揮對荷骨肉瘤裸鼠的治療作用［21］。因此，本文選擇臨床上治療OS常用的活血化瘀藥沒藥為研究對象，進(jìn)一步探究其治療OS 的機(jī)制。

本文先通過化學(xué)空間和相似度搜索技術(shù)，預(yù)測沒藥治療OS 的可能性，根據(jù)化學(xué)空間理論，相似化學(xué)空間的化合物往往具有相似的藥理活性［22］，提示沒藥與已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集有相同或相近的化學(xué)空間，即沒藥具有潛在抗OS 的作用。另外，相似度搜索發(fā)現(xiàn)沒藥中quercetin（MOL000098）、quercetin-3-O-β-D-glucuronide（MOL001001）等與已報道活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集具有相似的結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)“結(jié)構(gòu)類似的化合物具有類似的生物活性”［23］，揭示沒藥中存在抗OS 的活性化合物，為進(jìn)一步研究沒藥治療OS 的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制提供新依據(jù)。

表3 沒藥活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

從沒藥治療OS的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)得到32個活性成分，包括槲皮素（quercetin）、鞣花酸（ellagic acid）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、天竺葵素（pelargonidin）等。文獻(xiàn)報道，槲皮素能夠影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和化療耐藥的能力，起到抗OS 的作用［6］；鞣花酸能抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲，并通過抑制c-Jun 的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)G1 細(xì)胞周期阻滯［5］；天竺葵素能通過誘導(dǎo)自噬、線粒體膜電位喪失、G2/M 細(xì)胞周期和下調(diào)PI3K/Akt 信號通路誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用［4］。因此，沒藥可通過槲皮素、鞣花酸、天竺葵素等多成分治療OS。

從沒藥治療OS 的PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫胶诵幕駻kt1、MAPK1、FOS、HSP90AA1、JUN、ESR1、RELA、MYC。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Akt1的表達(dá)可促進(jìn)OS的肺轉(zhuǎn)移，下調(diào)AKT1 的表達(dá)可明顯抑制MAT1 介導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用，抑制裸鼠移植瘤生長，減少轉(zhuǎn)移性肺腫瘤的數(shù)量［24］；HSP90AA1作為一種重要的自噬調(diào)節(jié)劑，抑制HSP90AA1 可減弱骨肉瘤細(xì)胞對化療的自噬保護(hù)作用［25］；MYC 高表達(dá)與OS轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后顯著相關(guān)，降低MYC蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移等能力下降［26］。因此，沒藥可通過多個靶點(diǎn)影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等。

通過KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，沒藥活性成分治療OS 的基因主要集中在TNF、IL-17、p53 和凋亡等信號通路。研究表明，TNF 通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生存、凋亡等重要生物過程，TNF 可以和其受體TNFR 結(jié)合，作用于下游信號NF-κB，TNF/NF-κB 信號通路被激活后，可以增加CRL4BDACF11的活性，提高P21Cip蛋白的表達(dá)水平，從而阻滯骨肉瘤細(xì)胞生長周期，發(fā)揮抑制OS 的作用［27-28］；IL-17 信號通路與OS 呈負(fù)相關(guān)，與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［29］；激活p53 信號通路可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡［30-31］。因此，沒藥可通過多通路影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等方面，發(fā)揮抗OS 的作用。

綜上所述，本研究通過計算機(jī)模擬方法，初步預(yù)測沒藥治療OS 的作用及其機(jī)制，從結(jié)果可知，沒藥可通過槲皮素、鞣花酸和天竺葵素等成分，作用于Akt1、JUN 和MYC 等靶點(diǎn)，在TNF 信號通路、IL-17 信號通路、p53 信號通路等參與下，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等，發(fā)揮治療OS 的作用，為后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究提供方向。