蔣蘭蘭　魯敏　安華明

關鍵詞：刺梨；無籽刺梨；次生代謝物；中藥化學成分；抗氧化物質

中圖分類號：S661.9 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）01-0111-15

代謝組學于20世紀70年代由Devaux等提出，主要研究生物體內源代謝物的種類、含量及其變化規(guī)律等。代謝物是生物體表型的基礎，代謝水平可作為生物體對環(huán)境變化和遺傳修飾的終端響應，通過其能更直觀有效地了解生物學過程及其機制。植物代謝組學主要研究植物不同基因型及不同發(fā)育時期，或在受到某些刺激或脅迫前后代謝物的相應變化，包括其種類及含量，進而發(fā)現(xiàn)或驗證一些基因及蛋白的功能，有助于進一步闡明多種植物天然產物的生物合成途徑。目前，代謝組學已應用于植物研究的多個方面，如不同芝麻品種間的營養(yǎng)差異、四季豆的抗病性、野生稻與栽培稻之間的代謝物差異。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）與無籽刺梨（R.sterilisS.D.Shi）均是薔薇科薔薇屬多年生落葉果樹，主要分布于中國西南地區(qū)，其中貴州省刺梨種質資源豐富。在筆者研究組收集的多個優(yōu)異刺梨種質資源中，Rr-3與多個刺梨基因型間的代謝物差異較小，更具代表性，且單果質量較大，有望成為貴農5號的補充栽培資源，以促進刺梨產量的提高。此外，研究表明刺梨與無籽刺梨果實均富含生物活性物質，包括酚酸、黃酮、有機酸、氨基酸和維生素C等。據《本草綱目拾遺》《中藥大辭典》等記載，刺梨花、果、葉、根、籽可入藥，有健胃、消食、滋補作用，根皮有止瀉的功效等。刺梨還具抗癌、預防動脈粥樣硬化和抗氧化等功效。時京珍等研究發(fā)現(xiàn)，刺梨與無籽刺梨的藥理作用相似，均具有抗炎及鎮(zhèn)痛作用。但兩者間的營養(yǎng)成分及活性物質含量均有差異；刺梨的維生素C及必需氨基酸含量高于無籽刺梨，被認為具較高營養(yǎng)價值；與刺梨相比，無籽刺梨具較高的總黃酮與總酚含量。在刺梨與無籽刺梨代謝物研究中，刺梨具較高的兒茶素與楊梅素含量；而金刺梨酒石酸和槲皮素含量較高。研究表明刺梨與無籽刺梨的主要香氣物質也存在差異。此前已有研究檢測并鑒定了刺梨果實次生代謝物及中藥化學成分；而無籽刺梨的次生代謝物研究多集中在酚酸、黃酮、萜類、氨基酸與揮發(fā)性物質等方面，其中藥化學成分暫不清楚；因此，筆者在本研究中采用廣泛靶向代謝組學技術檢測和鑒定無籽刺梨果實的次生代謝物及中藥化學成分。此外，研究表明，相較無籽刺梨，刺梨具更高抗氧化能力，但對刺梨及無籽刺梨中具抗氧化能力次生代謝物的研究主要集中在酚酸、黃酮、三萜及有機酸等分類方面，而研究表明鞣質也具有較高的抗氧化能力，因此筆者在本研究中以2個刺梨基因型（Rr-5，Rr-3）與Rs果實為試材進行代謝物分析，明確刺梨與無籽刺梨次生代謝物中的中藥化學成分及抗氧化物質并分析其間的差異，為促進刺梨與無籽刺梨的合理應用提供理論參考。

1材料和方法

1.1材料

以無籽刺梨（R.sterilisS.D.Shi，簡稱Rs）與兩個刺梨（R.roxburghii Tratt.）基因型[貴農3號（Gui-nong 3，簡稱Rr-3）和貴農5號（Guinong 5，簡稱Rr-5）]的成熟果實為試驗材料。果實樣品均采自貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學刺梨種質資源圃（106°67.353′E，26°42.408′N），每個樣本均來源于連續(xù)面積為3.35hm2的刺梨圃中生長良好且樹齡均為4～5 a（年）的植株。從各基因型的3棵樹的4個方向的樹冠邊緣采集3個果實作為生物學重復；每個生物學重復包括12個果實。采集后立即去籽在液氮中快速冷凍，并于-80℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2樣品前處理

首先將供試樣品放置于凍干機（Scientz-lOOF）中真空冷凍干燥；后使用研磨儀（MM400，Retsch）以30 Hz研磨1.5 min;稱取100 mg粉末，溶解于1.2 mL70%（p）甲醇提取液中；溶解后的樣品于4℃冰箱過夜，期間渦旋6次；以12000r·min^-1離心10 min后，取上清，用微孔濾膜（0.22μm pore size）過濾樣品，保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3 UPLC-MS/MS分析

液相條件-色譜柱：Agilent SB-C18 1.8μm，2.1mm×100 mm;流動相：A相為超純水（加入0.1%甲酸），B相為乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，9.00 min內B相比例線性增加到95%并維持1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%并平衡至14min;流速0.35mL·min^-1;柱溫40℃；進樣量4μL。

質譜條件-電噴霧離子源溫度550℃，質譜電壓5500 V（正模式）/-4500 V（負模式），簾氣25 psi，碰撞誘導電離參數(shù)設置為高。在三重四級桿中，每個離子對根據優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進行掃描檢測。

1.4中藥化學成分及抗氧化能力

將刺梨與無籽刺梨果實中檢測到的次生代謝物在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫分析平臺（Traditional Chi-nese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）進行查詢，篩選出中藥化學成分并找出其對應的靶點及疾病。后根據生物口服利用度（0B≥5%）、藥物相似性（DL≥0.14）進一步篩選關鍵活性成分。將所有代謝物在系統(tǒng)藥理學抗癌草藥數(shù)據庫中查詢（CancerHSP，其中抗癌草藥2439種，抗癌成分3575種），鑒定其中抗癌朋中瘤成分。在TCMSP數(shù)據庫的疾病名稱菜單中輸入“糖尿病”“心血管疾病”“高血壓”“動脈粥樣硬化”和“血栓性疾病”。然后下載每種抗病物質的相關成分。最后，將UPLC-MS/MS中鑒定出的代謝物與獲得的抗病相關成分進行比較，鑒定出試樣中抗5種疾病相關的活性藥物成分。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-pic-rylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除活性、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2-Azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]陽離子自由基清除活性和鐵離子還原活性（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定參考Moure等、Martinez-Villaluenga等和Benzie等的方法且略有調整；其中Rr的3種抗氧化能力數(shù)據由Rr-3與Rr-5求和后取平均值而得。并將代謝物相對含量與三種抗氧化能力進行相關性分析，鑒定出刺梨與無籽刺梨中主要的抗氧化代謝物。

1.5數(shù)據分析

基于自建數(shù)據庫MWDB（metware database），根據二級譜信息進行物質定性，獲得不同樣本的代謝物質譜分析數(shù)據后，對所有物質質譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正。采用多元數(shù)據統(tǒng)計分析，對樣本進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析和正交偏最小二乘判別分析（or-thogonal PLS-DA，OPLS-DA）。結合差異倍數(shù)值和OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable impor-tance in projection，VIP）值篩選差異代謝物。篩選標準：選取fold change≥2和fold change≤0.5，且VIP≥1。對所測抗氧化能力利用SPSS進行單因素方差分析，并對抗氧化能力與代謝物相對定量進行皮爾遜相關性分析。

2結果與分析

2.1次生代謝物總體分析

通過對質控樣本（quality control sample，QC）質譜檢測分析的總離子流圖（圖1-A）及多反應監(jiān)測模式的代謝物檢測多峰圖（圖1-B）進行展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測的結果穩(wěn)定，數(shù)據可靠且重復性良好。筆者在本研究中共檢測到12類530種次生代謝物，其中包括99種脂質，90種酚酸，64種氨基酸及其衍生物，62種黃酮，57種鞣質，40種核苷酸及其衍生物，34種有機酸，23種萜類，14種生物堿，7種木脂素和香豆素，1種醌類和39種其他物質（表1）。

所有樣本的主成分分析結果如圖1-C所示，每組的3個重復樣本明顯聚集，組間明顯分離。與PCA結果一致，3個樣本的相對定量熱圖也具有明顯差異（圖1-D）。結果表明，刺梨和無籽刺梨的代謝物存在明顯差異。因此，進一步分析刺梨與無籽刺梨的特有代謝物。分析表明，刺梨與無籽刺梨間存在較大差異，31種代謝物僅在刺梨中檢測到，包括10種單寧、8種酚酸、4種黃酮類化合物、4種核苷酸及其衍生物、1種有機酸、1種木脂素和香豆素以及3種其他代謝物（表1）。齊墩果酸-O-己糖-O-己糖、對氨基苯甲酸、紅車軸草素-7-0-吡喃葡萄糖苷和4-a-L-鼠李糖苷一鞣花酸這4種物質僅在無籽刺梨中檢測到。這些物質可被作為區(qū)分刺梨與無籽刺梨的生物標志物。

2.2中藥化學成分鑒定

由于兩類果實中具健康促進作用的次生代謝物尚不清楚。因此，筆者在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺（TCMSP）中進一步查詢，鑒定刺梨與無籽刺梨果實中藥化學成分及關鍵活性成分。結果表明，530種次生代謝物中有118種是中藥化學成分（包括25種酚酸，16種鞣質，12種核苷酸及其衍生物，12種氨基酸及其衍生物，12種黃酮，11種有機酸，9種其他，8種脂質，7種萜類，3種生物堿，3種木脂素與香豆素），其中91種成分對應347種靶點及359種疾?。ū?）。在118種中藥化學成分中，36種是關鍵活性成分，其中11種代謝物（羅布麻酸、二十碳烯酸、西索林、尿苷5-二磷酸、鳥苷、綠原酸、2a-羥基熊果酸、狹窄素、肉豆蔻酸、特卡坦、雙子D）沒有相應的靶點和疾病（表2）。因此，可對這些物質進行深入研究，探索其藥用價值，以用于新藥研發(fā)。更重要的是，丁香油酚甲醚、黃嘌呤、苯甲酸、特里馬素I、Tercatain、Glansrin C和水楊梅丁素僅在一個或兩個刺梨基因型中檢測到，且Terca-tain和水楊梅丁素是關鍵活性成分。因此，這些物質可被認為是刺梨與無籽刺梨間藥用價值差異的主要成分。以上結果表明，刺梨比無籽刺梨具更高的藥用價值。

目前，世界范圍內威脅人類健康的主要疾病包括癌癥朋中瘤、糖尿病、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化和血栓性疾病。為鑒定刺梨與無籽刺梨果實中抗六大疾病的活性成分，筆者對檢測的代謝物進行CancerHSP及TCMSP數(shù)據庫查詢。結果表明，刺梨及無籽刺梨果實中共有46種代謝物（包括15種黃酮，11種酚酸，8種鞣質，4種萜類，2種氨基酸及其衍生物，2種核苷酸及其衍生物，2種生物堿，2種有機酸）至少對應一種疾病，其中迷迭香酸對應六大疾病，還有多種代謝物對應3～4種疾病（表3）。更重要的是，山奈酚-3-0-（6”-O-乙酰）-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6”-丙二酰）一半乳糖苷僅在刺梨中檢測到，且分別對應4種與2種疾病。

2.3抗氧化能力分析及抗氧化物質鑒定

由圖2-A可知，Rr的3種抗氧化能力均顯著高于Rs（p<0.05）。但其中主要的抗氧化物質并不清楚。分析表明，筆者在本研究中檢測到的530種次生代謝物中，145種物質與抗氧化能力顯著相關，包括38種鞣質、27種氨基酸及其衍生物、23種酚酸、18種核苷酸及其衍生物、13種黃酮、5種有機酸、4種三萜、3種木脂素與香豆素、3種脂質、2種生物堿和9種其他物質（包括維生素C）（圖2-B）。僅在刺梨中檢測到的物質有20種，而1-0-沒食子酰-a-L-鼠李糖、2-0-二沒食子?；?β-D-葡萄糖-β-D-葡萄糖、Glansrin C、1-O-，B- D-（3，4-二羥基苯乙基）-O-咖啡?；?葡萄糖苷、3，5-二-O-沒食子莽草酸和原花青素三聚單酯、Tercatain，特里馬素I和對香豆酰酒石酸這9種代謝物與3種抗氧化能力均顯著相關（p<0.05）。而僅在無籽刺梨中檢測到的4種代謝物均與抗氧化能力呈負相關。這一結果與測得的兩類果實的抗氧化能力結果一致。因此，筆者認為刺梨具有更高的抗氧化能力，且富含更多具有抗氧化能力的次生代謝物。

2.4差異代謝物篩選及差異代謝通路分析

通過對代謝物數(shù)據進行多元統(tǒng)計分析，基于OPLS-DA結果（圖3-A，C）及獲得的多變量分析OPLS-DA模型的VIP，同時結合差異倍數(shù)值來篩選差異代謝物。由火山圖可見，Rr-3與Rs間有272種差異代謝物（圖3-B），Rr-5與Rs間有242種差異代謝物（圖3-D），而兩個比較組間篩選出171種共有的差異代謝物，包括37種鞣質、34種酚酸、21種核苷酸及其衍生物、20種黃酮、18種氨基酸及其衍生物、13種脂質、8種有機酸、7種萜類、4種木脂素和香豆素、1種生物堿與8種其他物質（圖3-E）。其中111種代謝物在刺梨中的相對定量相較于Rs來說是上調的，其中有87種抗氧化物質及31種中藥化學成分（分類如下：12種鞣質，7種核苷酸，4種有機酸，4種酚酸，2種氨基酸，1種其他，1種萜類），且其中8種差異代謝物是關鍵活性成分，分別是雙沒食子酸、腺苷、鳥苷、腺苷-3-5-環(huán)單磷酸水合物、鞣花酸、水楊梅丁素、Tercatain和Myrianthic acid；其中23種物質既是抗氧化物質也是中藥化學成分（丙二酸，胞嘧啶，組胺，延胡索酸，胸腺嘧啶，三一谷氨酸，黃嘌呤，吡哆素，沒食子酸，沒食子酸甲酯，芥子醇，尿嘧啶核苷，鳥苷，鞣花酸，雙沒食子酸，迷迭香酸，水楊梅丁素，英國櫟鞣花酸，特里馬素I，Glansrin C，Pterocarinin A，Glansrin A，PlatycaryaninA）。而Rs中上調的差異代謝物有53種，其中僅10種差異代謝物（3種酚酸，2種黃酮，2種有機酸，1種脂質，1種木脂素與香豆素，1種其他物質）是中藥化學成分，僅3個關鍵活性成分，分別是石榴酸、綠原酸和櫻桃苷。

根據2個刺梨基因型與無籽刺梨比較篩選出的差異代謝物進一步進行差異富集通路分析。結果表明，Rr-3與Rs間272種差異代謝物共注釋到73條代謝通路；Rr-5與Rs間242種差異代謝物共注釋到66條代謝通路；在兩個刺梨與無籽刺梨的差異代謝物富集的差異代謝通路中，前5條高富集程度的代謝通路是嘌呤代謝、嘧啶代謝、玉米素生物合成、碳代謝和氨基酸生物合成（圖4）。這一結果表明上述5條差異代謝通路可能被認為是刺梨與無籽間主要的差異代謝通路。

3討論

筆者首次鑒定并比較分析了兩類果實的中藥化學成分及抗氧化物質。前人研究主要集中在兩類果實揮發(fā)性物質、酚酸、氨基酸和黃酮類代謝物中，但其中藥化學成分及抗氧化物質尚不清楚。而刺梨與無籽刺梨在市場上常被混用，研究表明無籽刺梨與刺梨及不同刺梨基因型間的營養(yǎng)價值、藥用價值及抗氧化能力存在顯著差異。因此，筆者基于廣泛靶向代謝組學技術對刺梨及無籽刺梨果實的次生代謝物進行檢測，鑒定并比較分析其中藥化學成分及抗氧化物質差異。

在不同刺梨基因型代謝物研究中，檢測到723種次生代謝物，鑒定出172種中藥化學成分及41種抗氧化物質。筆者在本研究中共檢測到530種次生代謝物，31種物質僅在刺梨中檢測到，4種僅在無籽刺梨中檢測到；鑒定出118種中藥化學成分（關鍵活性成分36種）及145種抗氧化物質，其中數(shù)量較多的均是鞣質與酚酸類代謝物，表明酚類物質在刺梨與無籽刺梨果實的中藥活性及抗氧化能力中起重要作用。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)91種中藥化學成分對應347個靶點及359種疾病。進一步分析發(fā)現(xiàn)其中46種物質對6大疾病中的一種或多種疾病具抗性，而迷迭香酸對6種疾病均有抗性。由于其采樣、送檢時間的不同，邁維數(shù)據庫有所更新，因此兩次試驗檢測到的次生代謝物數(shù)量存在差異，而筆者檢測到的部分代謝物在上述研究中均未檢測到，豐富了兩類果實中次生代謝物的種類及數(shù)量。并深入挖掘了其中抗六大疾病的次生代謝物與中藥化學成分及其靶點與疾病，首次鑒定了無籽刺梨果實的中藥化學成分。

前人研究表明，刺梨果實中總酚、總黃酮及總三萜與抗氧化能力顯著相關，其中2種有機酸、5種鞣花酸及其衍生物、11種黃酮類化合物和1種三萜類化合物，是促進刺梨果實提取物抗氧化和酪氨酸酶抑制活性的主要化合物。刺梨具較高抗氧化能力很大程度上歸因于有機酸與酚類化合物，如沒食子酸、兒茶素、表兒茶素和表沒食子酸，由于羥基數(shù)量較多，它們可以作為良好的電子供體發(fā)揮自由基清除作用斷。刺梨果實中主要的抗氧化物質的研究結果表明11種酚酸、9種黃酮及21種萜類物質與抗氧化能力顯著相關。上述研究表明酚酸類、類黃酮類及萜類物質是刺梨果實中主要的抗氧化物質。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)145種次生代謝物分別與至少一種抗氧化能力顯著相關，其中鞣質類物質數(shù)量最多，其次是氨基酸及其衍生物與酚酸類物質。鞣質化學結構復雜，是具較高抗氧化能力的酚類物質，測定的總酚含量中包含鞣質。此前的研究均表明刺梨總酚含量與抗氧化能力顯著相關，與本研究結果一致。且筆者進一步挖掘出刺梨與無籽刺梨果實中主要的抗氧化物質。更重要的是，僅在刺梨果實中檢測到的代謝物中有20種抗氧化物質{1-O-沒食子酰-a-L-鼠李糖，異木犀草素，4-[3-羥基-2-[4-[（2s，3s）-3-（羥甲基）-5-（3-羥基丙基）-7-甲氧基-2，3-二氫-1-苯并呋喃-2-基]-2，6-二甲氧基苯氧基]丙基]-2-甲氧基苯酚，山奈酚-3-0-（6”-O-乙酰）-葡萄糖苷，Praecoxin D，2-O-二沒食子?；?β-D-葡萄糖-β-D-葡萄糖，Glansrin C，黃嘌呤，鞣花酸戊糖苷二聚體，吡哆醇O-二己糖苷，1-D-β-D-（3，4-二羥基苯乙基）-O-咖啡?；?葡萄糖苷，3，5-二-O-沒食子莽草酸，原花青素三聚單酯，二磷酸腺苷，（EC→EC→EC）g（1），Tercatain，特里馬素I，水楊梅丁素，山奈酚-3，7-O-二鼠李糖苷，對香豆酰酒石酸}，7種中藥化學成分（丁香油酚甲醚，黃嘌呤，苯甲酸，特里馬素I，Tercatain，Glansrin C，水楊梅丁素）及2種抗六大疾病物質（Tercatain，水楊梅丁素）。而僅在無籽刺梨中檢測到的代謝物既沒有中藥化學成分也沒有抗氧化物質。以上結果進一步說明刺梨具更高的藥用價值及抗氧化能力。黃嘌呤、特里馬素I、Tercatain、Glansrin C、水楊梅丁素這5種物質是刺梨特有的抗氧化物質及中藥化學成分，且Tercatain和水楊梅丁素也是抗六大疾病活性物質。因此，這5種物質在刺梨與無籽刺梨果實中藥活性及抗氧化能力的差異中均起重要作用。

在兩個刺梨基因型與無籽刺梨的差異代謝物分析中，Rr-3與Rs間有272種差異代謝物，Rr-5與Rs間有242種差異代謝物。上述差異代謝物映射到KEGG富集通路，富集程度較高的是嘌呤代謝、嘧啶代謝、玉米素生物合成、碳代謝、氨基酸生物合成。嘌呤可參與植物氮代謝、黃酮合成及激素合成過程，幫助植物應對不良環(huán)境；嘌呤和嘧啶核苷酸參與植物的許多生化過程，包括發(fā)芽開花結實等，它們是核酸合成的基石，是合成初生代謝物以及次生代謝物的前體；此外，植物嘌呤和嘧啶代謝的重要過程是初級代謝、次級代謝和基因表達所必需的，是細胞生長和生化過程的基礎。而映射到這兩條通路中的差異代謝物均在刺梨中上調，因此，筆者認為嘌呤代謝及嘧啶代謝通路的差異是刺梨與無籽刺梨在種子上差異的原因之一，并推斷刺梨比無籽刺梨具有更高的對逆境脅迫的耐受性。

差異代謝物中有171種是Rr-3、Rr-5與Rs共同差異的物質，其中，在兩個刺梨基因型均上調的差異代謝物有111種，包括87種抗氧化物質（31種鞣質，15種核苷酸及其衍生物，12種酚酸，10種鞣質，7種黃酮，5種其他，2種脂質，2種萜類，2種有機酸，1種木脂素與香豆素），31種中藥化學物質，8種關鍵活性成分，23種物質既是抗氧化物質又是中藥化學物質（丙二酸，胞嘧啶，組胺，延胡索酸，胸腺嘧啶，L-谷氨酸，黃嘌呤，吡哆素，沒食子酸，沒食子酸甲酯，芥子醇，尿嘧啶核苷，鳥苷，鞣花酸，雙沒食子酸，迷迭香酸，水楊梅丁素，英國櫟鞣花酸，特里馬素I，Glansrin C，Pterocarinin A， Glansrin A， PlatycaryaninA）；無籽刺梨中上調的有53種物質，包括10種中藥化學成分，3種關鍵活性成分。綜上，與無籽刺梨相比，刺梨具更高的中藥活性及抗氧化能力，其差異主要源于兩類果實中酚類物質數(shù)量與含量的不同。

4結論

筆者在本研究中首次對刺梨及無籽刺梨果實次生代謝物中的具中藥活性與抗氧化能力的次生代謝物進行鑒定與差異分析。結果表明，在兩個刺梨基因型與無籽刺梨果實中共檢測到530種次生代謝物，其中包括118種中藥化學成分與145種抗氧化物質，酚類物質是刺梨及無籽刺梨果實中最主要的抗氧化物質與中藥化學成分；刺梨不論是在特有物質中還是在差異代謝物中均具較多數(shù)量的抗氧化物質及中藥化學成分，從而具更高的中藥活性及抗氧化能力，而酚類物質的數(shù)量及含量是導致刺梨與無籽刺梨抗氧化能力及中藥活性差異的主要原因。