王雪蓮，孫麗華

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科，上海 201700

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤，是一組在遺傳學(xué)、病理特征、免疫表型和臨床表現(xiàn)及治療反應(yīng)上均具有高度異質(zhì)性的侵襲性血液腫瘤[1]。DLBCL的影響因素包括遺傳分子生物學(xué)、生活方式、家族史、藥物、免疫紊亂和職業(yè)等，DLBCL還具有不同的組織學(xué)特征，易在疾病早期發(fā)生遠處擴散。利妥昔單抗與環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松的聯(lián)合使用(R-CHOP方案)是目前治療DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。盡管使用了R-CHOP方案進行治療，仍有許多DLBCL患者出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)，甚至死亡[2]。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤微環(huán)境(TME)在DLBCL中的作用機制及其對預(yù)后判斷的價值已成為最新的研究熱點。TME是基于腫瘤細胞與基質(zhì)成分、細胞外基質(zhì)、炎癥細胞和免疫細胞之間的相互作用，并在這個相互作用中表現(xiàn)出組成空間特征的顯著異質(zhì)性[3]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM) 作為TME的重要組成部分，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其中CD68是TAM的特征性標(biāo)志物之一。有研究發(fā)現(xiàn)，套細胞淋巴瘤中CD68陽性巨噬細胞計數(shù)升高與預(yù)后不良有關(guān)[4]。CD34是常用的血管內(nèi)皮標(biāo)志物，TAMMA等[5]通過對濾泡性淋巴瘤的研究發(fā)現(xiàn)，CD34陽性的微血管不僅數(shù)量較多，而且CD34陽性的微血管數(shù)量與CD68陽性和CD163陽性巨噬細胞計數(shù)呈正相關(guān)，提示該類型巨噬細胞亞群具有重要血管生成潛力，微血管密度(MVD)升高者預(yù)后較差。所以，尋找有效的生物標(biāo)志物來判斷DLBCL的預(yù)后就顯得非常重要。本研究應(yīng)用免疫組化(SP)法檢測DLBCL中CD68和CD34的表達，并分析二者判斷DLBCL預(yù)后的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2016年5月至2019年5月本院診斷為DLBCL的67例患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)制訂的淋巴造血組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)；(2)經(jīng)病理檢查確診，且為初次診斷；(3)確診后正常治療；(4)患者的生存期大于3個月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并代謝性疾病及嚴(yán)重心、肝、肺、腎功能障礙的患者；(2)有自身免疫性疾病病史的患者；(3)既往有惡性腫瘤病史患者；(4)由惰性淋巴瘤進展為DLBCL的患者。所有患者均簽署知情同意書，本研究已通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 采用SP法檢測CD68和CD34在DLBCL中的表達情況。手術(shù)切除腫瘤組織，石蠟切塊、脫蠟、水化、烤片，浸于二甲苯5 min，并采用100%、95%、90%、85%和75%乙醇梯度處理，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再進行抗原修復(fù)，分別滴加稀釋CD68單克隆抗體和鼠抗人CD34 單克隆抗體一抗，4 ℃條件下過夜，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，PBS沖洗，增敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染5 min，充分水洗，分化，返藍，乙醇梯度，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.3結(jié)果判斷 CD68陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：隨機選取5個高倍視野，與背景著色相對比，對染色強度進行評分，無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。對陽性細胞所占的百分比進行評分，陰性記0分，陽性細胞<10%記1分，陽性細胞為10%～<30%記2分，陽性細胞為30%～<50%記3分，陽性細胞為50%～<75%記4分，陽性細胞≥75%記5分。最后得分為染色強度與陽性細胞百分比分?jǐn)?shù)之和，0～1分為CD68陰性表達，2～8分為CD68陽性表達。CD34標(biāo)記的MVD判定：采用MVD計數(shù)方法，在低倍鏡下選擇3個密度最高的微血管區(qū)域，計算CD34所染成棕色的微血管數(shù)量，所得平均值則為MVD。

1.4隨訪 隨訪時間從疾病確診開始，截止時間為2022年5月31日，隨訪內(nèi)容包括患者的一般情況、治療和近期復(fù)查情況，方式為查閱電子版和紙質(zhì)版病歷。另以電話的形式隨訪患者的3年總生存率(OS)和無進展生存率(PFS)，OS的計算是從DLBCL的確診到腫瘤本身引起的死亡，或隨訪滿3年終止；PFS的計算是從DLBCL的確診到腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或病情惡化。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，組間生存期的比較采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CD68和CD34的總體表達情況 67例DLBCL患者中，40例CD68表達為陽性，陽性率為59.7%，染色的細胞膜有棕黃色顆粒，并呈現(xiàn)多角形、擴張狀和閉塞的條索狀等不規(guī)則狀態(tài)；35例CD34表達為陽性，陽性率為52.2%，細胞膜或者細胞質(zhì)呈棕褐色或者棕黃色，形態(tài)清晰。見圖1。

注：A為CD68陽性表達；B為CD68陰性表達；C為 CD34陽性表達；D為CD34陰性表達。

2.2不同特征DLBCL患者的CD68和CD34表達情況比較 不同年齡、性別、原發(fā)部位、B癥狀出現(xiàn)情況[淋巴瘤患者出現(xiàn)以下任意一項癥狀者：原因不明的發(fā)熱(通常38 ℃以上)、盜汗、原因不明的體質(zhì)量減輕10%以上]、血清乳酸脫氫酶(LDH)水平的DLBCL患者CD68及CD34陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Ann Arbor臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分為3～4分、有骨髓侵犯DLBCL患者的CD68及CD34陽性率明顯高于Ann Arbor臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI評分為0～2分、無骨髓侵犯DLBCL患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同特征DLBCL患者的CD68和CD34表達情況比較[(n)%]

2.3不同特征DLBCL患者的CD68和CD34共同表達情況比較 不同年齡、性別、原發(fā)部位、B癥狀出現(xiàn)情況、血清LDH水平DLBCL患者的CD68和CD34共同表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Ann Arbor臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～4分、有骨髓侵犯的DLBCL患者CD68和CD34共同表達率明顯高于Ann Arbor臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI評分為0～2分、無骨髓侵犯DLBCL患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4CD68和CD34表達對DLBCL患者生存預(yù)后的影響 67例DLBCL患者中，共有4例患者失訪，失訪率為6.0%。CD68陽性患者的3年OS和PFS分別為52.5%和45.0%，CD68陰性患者的3年OS和PFS分別為77.7%和70.4%，CD68陽性患者的3年OS和PFS均低于CD68陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.047、0.044)；CD34陽性患者的3年OS和PFS分別為51.4%和42.9%，而CD34陰性患者的3年OS和PFS為75.0%和68.8%，CD34陽性患者的3年OS和PFS也低于CD34陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030、0.013)。見圖2～5。

表2 不同特征DLBCL患者的CD68和CD34共同表達情況比較[(n)%]

續(xù)表2 不同特征DLBCL患者的CD68和CD34共同表達情況比較[(n)%]

圖2 CD68陽性與陰性患者的3年OS生存曲線比較

圖3 CD68陽性與陰性患者的3年P(guān)FS生存曲線比較

圖4 CD34陽性與陰性患者的3年OS生存曲線比較

圖5 CD34陽性與陰性患者的3年P(guān)FS生存曲線比較

3 討 論

DLBCL占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，臨床上常表現(xiàn)為單個或多個、淋巴結(jié)內(nèi)或淋巴結(jié)外快速增長的腫塊。目前DLBCL的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，即使患者使用包括R-CHOP方案在內(nèi)的多種不同方案進行治療，患者5年生存情況也不理想，因此，尋找新的治療方法迫在眉睫[2]。另外，由于DLBCL在免疫表型、細胞形態(tài)和臨床特征等方面均具有明顯的異質(zhì)性，所以不同的亞型、不同的個體間在治療效果、臨床特點和預(yù)后方面存在明顯差異。目前，針對免疫檢查點、TME、分子信號通路和表觀遺傳畸變的療法，以及細胞免疫療法共同構(gòu)成了DLBCL治療的新格局[6]。所以，準(zhǔn)確和有效地識別危險度不同的患者就顯得非常重要，特別是對于高?；颊?，早期診斷有助于采取積極有效的治療措施，對改善患者的預(yù)后具有重要的意義。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)及免疫治療技術(shù)的發(fā)展，TME中的某些相關(guān)因子在DLBCL中的表達及其臨床意義逐漸受到重視。在TME中，TAM不僅能夠促進TME中的炎癥反應(yīng)，還可以產(chǎn)生細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)因子和促血管生長因子，刺激腫瘤的生長[7]。 CD68是巨噬細胞通用型標(biāo)志物，有研究表明CD68的表達可以評估TME中TAM水平，在某些DLBCL中CD68的高表達提示預(yù)后不良[8]。LI等[9]通過對DLBCL的研究發(fā)現(xiàn)，CD68高表達患者的OS和PSF均低于CD68低表達患者,此外，還可以通過檢測CD68的表達進一步識別高?；颊?，尤其是那些被IPI歸類為低/中危的患者。

同時，血管為腫瘤生長提供營養(yǎng)和氧氣支持，為臟器轉(zhuǎn)移提供特殊通道，腫瘤血管密度越高則越利于癌細胞生長，腫瘤的侵襲性越強。而CD34作為公認(rèn)的血管內(nèi)皮標(biāo)志物，存在于內(nèi)皮依賴性血管的細胞上，CD34表達與血管生成有關(guān)，在腫瘤新生血管的內(nèi)皮細胞中高表達，在正常組織的血管內(nèi)皮細胞中不表達或者低表達。采用CD34抗體進行SP染色觀察腫瘤MVD，可以有效反映腫瘤的血管生成。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能夠促進血管內(nèi)皮細胞的生長，誘導(dǎo)TME中微血管的生成，促進DLBCL的發(fā)生及進展。TAMMA等[10]在另一項針對黏膜相關(guān)淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，MVD和M2型巨噬細胞呈正相關(guān)，該結(jié)論可為開發(fā)新的免疫治療策略提供積極幫助。

本研究采用67例DLBCL患者作為研究對象，研究結(jié)果顯示：40例CD68表達為陽性，陽性率為59.7%，35例CD34表達為陽性，陽性率為52.2%，CD68和CD34的陽性率均達到50.0%以上；同時比較了不同特征患者CD68、CD34的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ann Arbor臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI評分為3～4分、有骨髓侵犯DLBCL患者的CD68及CD34陽性率明顯高于Ann Arbor臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI評分為0～2分、無骨髓侵犯DLBCL患者(P<0.05)。本研究進一步分析了CD68和CD34表達對DLBCL患者生存預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，CD68陽性和CD34陽性患者的3年OS和PFS分別低于CD68陰性和CD34陰性患者，提示TAM與DLBCL的預(yù)后有關(guān)。TAM的成分及成分之間的相互作用與患者的預(yù)后密切相關(guān)，TAM能夠更好地區(qū)分預(yù)后較差的患者，并為下一步治療提供一個新的方向[3]。

綜上所述，CD68和CD34陽性表達與DLBCL患者的Ann Arbor臨床分期、IPI 評分、骨髓侵犯及生存預(yù)后具有一定的關(guān)系，且CD68和CD34陽性DLBCL患者預(yù)后不良。