姚倫，周雍進(jìn)

（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)研究部，遼寧 大連 116023）

人類對化石資源的使用引起了全球變暖和氣候變化，進(jìn)而導(dǎo)致如干旱、洪澇、高溫等極端天氣以及海平面上升、土壤荒漠化、生物多樣性減少等，嚴(yán)重威脅了人類的生存和發(fā)展。因此，迫切需要改變對化石資源的依賴。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，對生物系統(tǒng)進(jìn)行改造，已經(jīng)實現(xiàn)利用糖、淀粉、木質(zhì)纖維素等原料合成各種能源燃料、大宗化學(xué)品、材料、藥物等產(chǎn)品，能夠部分取代目前依賴化石資源的能源和化學(xué)品的生產(chǎn)。

第一代生物制造以糖、淀粉等為原料，主要來源于玉米、甘蔗、高粱等，存在“與人爭糧、與糧爭地”等問題。以燃料乙醇為例，2021 年全球產(chǎn)量達(dá)273 億加侖（1 加侖=3.78541L），主要以玉米（美國）和甘蔗（巴西）為原料生產(chǎn)[1]，其中，僅美國就有51.5億蒲式耳（1.31億噸）玉米用于燃料乙醇生產(chǎn)，占其全部玉米產(chǎn)量的34%[2]。近期的研究表明，由于美國《可再生燃料標(biāo)準(zhǔn)》的實施，燃料乙醇大量生產(chǎn)，使得玉米價格上漲30%左右，同時帶動了其他糧食價格上漲，如大豆、小麥等價格提高20%左右；此外，玉米的大量需求使得其種植面積增加8.7%，進(jìn)而帶來額外的土地開墾（690 萬英畝，1 英畝=4046.864798m2）、化肥的生產(chǎn)和使用、水體污染等，間接導(dǎo)致了額外的CO2排放，使得生物乙醇與傳統(tǒng)汽油相比，反而產(chǎn)生更高CO2排放（24%）[3]。

第二代生物制造以木質(zhì)纖維素為主要原料，包括農(nóng)作物秸稈、林業(yè)廢棄物等。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要經(jīng)過預(yù)處理、酶解等過程才能被微生物利用，因此，仍然面臨效率低、成本過高的困境[4]。其中，預(yù)處理過程（氣爆、酸處理、堿處理等）能耗高、成本高，占全部設(shè)備成本的30%～50%和運(yùn)行成本的20%～25%；此外，預(yù)處理過程還容易產(chǎn)生呋喃醛、酸類、酚類等對細(xì)胞有毒性的物質(zhì)，影響后續(xù)微生物發(fā)酵過程。酶解過程需要大量使用纖維素酶，占全部成本的30%，目前纖維素酶存在穩(wěn)定性差、壽命短、活性低等缺陷，致使酶解過程效率偏低，成本過高[5]。

一碳化合物（CO2、CO、甲烷、甲醇、甲酸等）來源廣泛、生產(chǎn)量大、價格相對低廉，除了以傳統(tǒng)化石資源為原料，利用成熟技術(shù)大量生產(chǎn)外，也能夠利用多種可再生資源制備（圖1），是較為理想的新一代生物制造原料。自然界中存在多種能夠利用一碳化合物的微生物，對大腸桿菌、釀酒酵母等模式微生物進(jìn)行改造，也能構(gòu)建合成型一碳利用微生物，并實現(xiàn)一碳資源到多種產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化[6]。因此，基于一碳化合物的生物制造有望實現(xiàn)能源和化學(xué)品的綠色、可持續(xù)生產(chǎn)，對于實現(xiàn)碳減排、碳達(dá)峰和碳中和具有重要意義。

圖1 一碳化合物原料來源

1 一碳化合物原料來源

一碳化合物有氣態(tài)（CO2、CO和甲烷）和液態(tài)（甲醇和甲酸等）兩種類型，自然界和許多工業(yè)生產(chǎn)過程均產(chǎn)生大量的一碳?xì)怏w。其中，CO2資源最為豐富，來源廣泛，大氣中的CO2體積分?jǐn)?shù)約為0.041%?；Y源的利用過程會釋放大量的CO2，這也是造成全球氣候變化的主要原因。根據(jù)國際能源署（IEA）報告，2021 年全球與能源和工業(yè)過程相關(guān)的CO2排放量達(dá)363 億噸，達(dá)歷史最高水平，其中煤炭、石油和天然氣導(dǎo)致的CO2排放分別為153 億噸、107 億噸和75 億噸，CO2排放主要來源于電力和供熱、鋼鐵冶煉、交通運(yùn)輸以及建筑等行業(yè)[7]。2021年，中國的CO2排放量達(dá)119億噸，是最大的碳排放國[7]。近年來，利用CO2加氫、光催化、電催化等制備還原性一碳化合物（CO、甲烷、甲酸、甲醇）取得快速進(jìn)展，為CO2的資源化利用和還原性一碳化合物的可持續(xù)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[8]。

CO 和甲烷來源也非常廣泛?；剂系牟煌耆紵掍摰裙I(yè)生產(chǎn)過程均會排放大量的CO。另外，CO 也是合成氣的主要成分之一，合成氣是重要的化工原料，既可由煤、焦炭等固體燃料氣化產(chǎn)生，又可由天然氣、煤層氣、頁巖氣和石腦油等輕質(zhì)烴類制取，還可由重油經(jīng)部分氧化法生產(chǎn)[9]。甲烷是天然氣、沼氣的主要成分，也是造成溫室效應(yīng)的第二大氣體。國際能源署（IEA）報告顯示，2021年全球能源領(lǐng)域的甲烷排放量高達(dá)1.35億噸，甲烷排放主要來源于包括煤炭和油氣開采、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物質(zhì)燃燒、垃圾填埋等[10]。生物質(zhì)作為儲量最大的可再生原料，通過氣化獲得含有CO、CO2、氫氣、甲烷等的混合氣體[11]，可實現(xiàn)一碳?xì)怏w的可持續(xù)供應(yīng)。

液態(tài)一碳原料中，甲醇是重要的基礎(chǔ)化工原料，來源穩(wěn)定，價格相對低廉。甲醇主要以天然氣和煤為原料經(jīng)合成氣制備，技術(shù)成熟度較高。2020年，全球甲醇產(chǎn)能達(dá)到1.27 億噸，產(chǎn)量約8000 萬噸，我國是最大的甲醇生產(chǎn)國，年產(chǎn)量超過6000 萬噸[12]?？稍偕募状贾苽渲饕袃蓷l線路：一是以生物質(zhì)為原料，通過氣化然后制備甲醇，潛在的主要原料包括農(nóng)業(yè)和林業(yè)廢棄物、城市固體廢棄物、垃圾填埋場和污水產(chǎn)生的沼氣等；二是利用CO2加氫（可再生能源發(fā)電生產(chǎn)的氫氣）生產(chǎn)甲醇[13]。其中，中國科學(xué)院大連化學(xué)物研究所李燦院士團(tuán)隊研發(fā)的“液態(tài)陽光”技術(shù)已完成千噸級綠色甲醇合成示范工程，目前正在開展十萬噸級綠色甲醇合成工業(yè)示范[14]。甲酸的可持續(xù)供應(yīng)與甲醇類似，除CO2還原外，也可由生物質(zhì)氧化制備[15?16]。

2 一碳化合物的生物利用途徑

一碳化合物中，CO2是碳的最高氧化態(tài)，而甲烷的還原度最高。微生物細(xì)胞中，還原態(tài)的一碳化合物（甲烷、甲醇、甲醛、甲酸和CO）均可發(fā)生氧化反應(yīng)，最終生成CO2，為細(xì)胞提供能量和還原力。甲烷可發(fā)生氧化反應(yīng)生成甲醇，甲醇發(fā)生氧化反應(yīng)生成中間代謝物甲醛，甲醛可以進(jìn)入同化途徑，包括核酮糖單磷酸途徑（ribulose monophosphate pathway，RuMP）、木酮糖單磷酸途徑（xylulose monophosphate pathway，XuMP） 和 絲 氨 酸 循 環(huán)（serine cycle），也可以進(jìn)一步被氧化生成甲酸。甲酸再被甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）徹底氧化生成CO2。CO 能發(fā)生氧化反應(yīng)生成CO2，為細(xì)胞提供能量，也可經(jīng)Wood?Ljungdahl途徑進(jìn)入中心代謝[17]。CO2則經(jīng)卡爾文循環(huán)（Calvin?Benson?Bassham cycle，CBB cycle）等碳固定途徑進(jìn)入中心代謝（圖2）。

圖2 微生物中一碳化合物代謝途徑

2.1 CO2固定

自然界中存在多條CO2固定途徑，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7 條天然CO2固定途徑，即卡爾文循環(huán)、Wood?Ljungdahl 途 徑、 二 羧 酸/4?羥 基 丁 酸 循 環(huán)［dicarboxylate/4?hydroxybutyrate （DC/HB） cycle］、3?羥基丙酸/4?羥基丁酸循環(huán)［3?hydroxypropionate/4?hydroxybutyrate（HP/HB）cycle］、3?羥基丙酸雙循環(huán)（3?HP bicycle）、還原三羧酸循環(huán)（reductive TCA cycle，rTCA）和還原甘氨酸途徑（reductive glycine pathway，rGlyP）[18]。Liu 等[19]對這些途徑進(jìn)行詳細(xì)的總結(jié)和闡述。

卡爾文循環(huán)是光能自養(yǎng)微生物、化能自養(yǎng)微生物等多種微生物固定CO2的途徑，卡爾文循環(huán)可分為三個階段。① 羧化：核酮糖1,5二磷酸（RuBP）在核酮糖1,5二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose?1,5?bisphosphate carboxylase/oxygenase， RuBisCO） 的作用下與CO2結(jié)合，隨后分解為2分子3?磷酸甘油酸。② 還原：3?磷酸甘油酸首先在磷酸甘油激酶催化下被ATP磷酸化形成1,3?二磷酸甘油酸，再由甘油醛磷酸脫氫酶催化被NADPH還原形成3?磷酸甘油醛。③ RuBP的再生：3?磷酸甘油醛經(jīng)過一系列反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)??磷酸核酮糖，再由磷酸核酮糖激酶催化進(jìn)行磷酸化形成RuBP。整個過程需要消耗7個ATP，固定3分子CO2并生成一分子丙酮酸，因此卡爾文循環(huán)被認(rèn)為是能量利用效率最低的碳固定途徑[20]。

卡爾文循環(huán)中的RuBisCO是決定碳同化速率的關(guān)鍵酶，也是光合作用的主要限速步驟之一，其催化效率較低，催化常數(shù)kcat為1～12s?1[21]。RuBisCO既能催化RuBP 與CO2的羧化反應(yīng)，也能以氧氣為底物，使RuBP進(jìn)入光呼吸途徑，消耗光合作用合成的有機(jī)物，從而抑制RuBisCO的羧化酶活性[22]。微藻、藍(lán)細(xì)菌等光合微生物中存在CO2濃縮機(jī)制（CO2concentrating mechanism，CCM），通過在羧酶體內(nèi)濃縮CO2提高其濃度，從而提高RuBisCO催化CO2羧化反應(yīng)的效率，減少RuBisCO 加氧酶的活性和光呼吸，進(jìn)而增加光合作用效率。由于RuBisCO的合成需要復(fù)雜的分子伴侶系統(tǒng)協(xié)助其折疊和組裝，對其進(jìn)行直接改造提高活性難度較大，目前研究主要集中于挖掘新的更高效的RuBisCO 酶[23?25]。Matsumura 等[26]將水稻中的RuBisCO 小亞基替換為來源于C4植物高粱的RuBisCO 小亞基，得到的雜合型的RuBisCO相較于水稻野生型RuBisCO具有更高的催化速率（kcat），與CO2的親和力提高，而與氧氣的親和力降低。Lin 等[25]利用來源于不同茄科植物的RuBisCO 構(gòu)建了其系統(tǒng)進(jìn)化樹，并預(yù)測RuBisCO的進(jìn)化過程和祖先酶，將不同RuBisCO祖先酶在大腸桿菌中表達(dá)，篩選得到了具有更優(yōu)催化特性的RuBisCO。

還原甘氨酸途徑是最近在硫酸鹽還原菌（Desulfovibrio desulfuricans）中被證實天然存在的CO2固定途徑[18]，在該途徑中，CO2首先被還原生成甲酸，然后經(jīng)過還原和環(huán)化形成5,10?亞甲基四氫葉酸，然后經(jīng)核心固碳酶甘氨酸裂解體系（glycine cleavage system，GCS）催化與CO2和氨生成甘氨酸，甘氨酸經(jīng)過甘氨酸還原酶復(fù)合體、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶催化生成乙酰輔酶A，整個過程固定2 分子CO2。還原甘氨酸途徑常被用來在模式微生物中構(gòu)建CO2和甲酸的同化途徑[17]。

2.2 CO的氧化和同化

CO氧化首先由關(guān)鍵酶一氧化碳脫氫酶（carbon monoxide dehydrogenase，CODH） 催 化 生 成CO2，為細(xì)胞提供能量。CODH 有兩種形式：① 單功能酶，催化CO 氧化生成CO2；② 雙功能酶，不僅能夠?qū)O2還原為CO，還參與催化甲基、CO 和輔酶A 生成乙酰輔酶A。CODH 可分為兩大類：一類為存在于需氧微生物中的Mo?Fe?黃素CODH，該類酶對氧氣不敏感；另一類為存在于厭氧微生物中的Ni?Fe CODH，對氧氣敏感。在這兩類金屬酶中，位于活性中心起關(guān)鍵作用的金屬分別是鉬（Mo）和鎳（Ni），因此這兩類酶分別被稱為Mo?CODH和Ni?CODH，而Ni?CODH 的催化活性遠(yuǎn)高于Mo?CODH[27?28]，其中，來源于產(chǎn)氫一氧化碳嗜熱菌（Carboxydothermus hydrogenoformans）的ChCODH?Ⅱ是目前報道的催化活性最高的CODH[27]，但是由于ChCODH?Ⅱ的氧氣敏感性，限制了其實際應(yīng)用。近期，Kim 等[29]通過將ChCODH?Ⅱ與氧氣相對不敏感但催化活性較低的ChCODH?Ⅳ進(jìn)行結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)了ChCODH?Ⅱ氣體通道的關(guān)鍵氨基酸（A559），對該氨基酸進(jìn)行突變能夠大幅改善ChCODH?Ⅱ的氧氣敏感性，而不影響其催化活性。

CO 的同化經(jīng)由Wood?Ljungdahl 途徑完成。該途徑又稱還原乙酰輔酶A 途徑（reductive acetyl?CoA pathway），是產(chǎn)乙酸菌和一些古細(xì)菌（如產(chǎn)甲烷菌）的固碳途徑，以CO 或者氫氣氧化提供能量。Wood–Ljungdahl 途徑由甲基分支和羰基分支組成。在甲基分支中，CO2由甲酸脫氫酶催化還原生成甲酸，隨后由甲基四氫葉酸合成酶催化生成甲酰四氫葉酸，最后由甲基轉(zhuǎn)移酶將其甲基轉(zhuǎn)移形成甲基類咕啉鐵硫蛋白（Methyl?CoFeS）；羰基分支中，以CO為碳源時，CO分子能夠被直接同化進(jìn)入羰基分支，以CO2為碳源時，CO2首先由一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合成酶復(fù)合體（CODH/ACS）催化形成CO。最后在CODH/ACS催化下，甲基基團(tuán)、羰基基團(tuán)和輔酶A共同合成乙酰輔酶A[30]。

2.3 甲烷代謝

甲烷的代謝過程首先由甲烷單加氧化酶（methane monooxygenase，MMO）催化氧化生成甲醇。甲烷單加氧化酶包括兩種類型，即存在于細(xì)胞質(zhì)中的可溶性甲烷單加氧化酶（soluble MMO，sMMO）以及與膜結(jié)合、顆粒狀的甲烷單加氧化酶（particulate MMO，pMMO）。sMMO由3個蛋白組成，即羥化酶（hydroxylase，MMOH）、還原酶（reductase，MMOR）和調(diào)節(jié)蛋白（regulatory protein，MMOB），其中羥化酶MMOH 負(fù)責(zé)甲烷的氧化。顆粒狀的甲烷單加氧化酶由三個亞基組成（pmoB、pmoA 和pmoC），該酶依賴銅離子發(fā)揮活性，對甲烷具有更強(qiáng)的親和性[31]。甲烷氧化生成甲醇后，再被甲醇氧化酶（methanol dehydrogenases，MDH）氧化生成甲醛，然后通過RuMP途徑或絲氨酸循環(huán)被同化進(jìn)入中心代謝。

2.4 甲醇代謝

甲醇代謝起始于其氧化生成甲醛，該反應(yīng)由甲醇脫氫酶/醇氧化酶（MDH/AOX）催化，是甲醇代謝的關(guān)鍵酶。目前已發(fā)現(xiàn)三類甲醇脫氫酶/氧化酶：① 吡咯喹啉醌（PQQ）依賴的甲醇脫氫酶（MDH），該酶依賴細(xì)胞色素c介導(dǎo)電子傳遞；② 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的甲醇脫氫酶；③氧依賴的醇氧化酶（AOX）[32]。前兩者存在于甲醇細(xì)菌和甲烷氧化菌中，氧依賴的AOX 則存在于甲醇酵母中，AOX 氧化甲醇生成甲醛和過氧化氫，過氧化氫再被細(xì)胞中的過氧化氫酶分解生成水和氧氣。甲醇酵母的甲醇氧化過程在過氧化物酶體中完成，因此能夠一定程度上降低甲醛和過氧化氫的細(xì)胞毒性[33]。在這三類MDH中，NAD+依賴的MDH應(yīng)用最為廣泛，甲醇氧化得到的電子能夠儲存于NADH，可直接用于后續(xù)產(chǎn)物合成，然而，該類MDH 酶對甲醇的親和性較低[34]。Wu 等[35]對來源于鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator）的甲醇脫氫酶進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變和高通量篩選，獲得了對甲醇親和性大幅度提高的MDH，其催化甲醇氧化的kcat/Km值提高了6倍。Roth等[36]利用甲醛響應(yīng)系統(tǒng)開發(fā)了噬菌體輔助的非連續(xù)進(jìn)化技術(shù)，利用該技術(shù)對甲醇芽孢桿菌的甲醇脫氫酶（MDH2）進(jìn)行定向進(jìn)化和篩選，使酶的最大反應(yīng)速率Vmax提高3.5倍。

甲醛可進(jìn)入異化途徑或同化途徑。在異化途徑中，甲醛首先被甲醛脫氫酶（formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)ADH）氧化成甲酸，進(jìn)而被甲酸脫氫酶徹底氧化生成CO2。甲醛同化途徑則使其進(jìn)入中心代謝，甲基營養(yǎng)微生物中主要有三條同化途徑：存在于酵母中的XuMP途徑，以及存在于細(xì)菌中的RuMP 途徑和絲氨酸循環(huán)。XuMP 途徑中，甲醛首先由二羥丙酮合酶（dihydroxyacetone synthase，DAS）催化后與5?磷酸木酮糖縮合生成3?磷酸甘油醛和二羥丙酮。二羥丙酮進(jìn)一步被二羥丙酮激酶（DAK）催化磷酸化生成磷酸二羥丙酮，最后經(jīng)由1,6?二磷酸果糖和6?磷酸果糖生成3?磷酸甘油醛和5?磷酸木酮糖[33]。

RuMP 途徑可分為固定、水解和重排三個過程。在固定過程中，甲醛與5?磷酸核酮糖在3?己酮糖?6?磷酸合酶的催化下縮合形成6?磷酸己酮糖；水解過程由磷酸果糖激酶（PFK）催化6?磷酸果糖形成1,6?二磷酸果糖，進(jìn)而分解形成3?磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮；在重排過程中，6?磷酸果糖和磷酸丙糖重新形成5?磷酸核酮糖，用于后續(xù)甲醛同化[37]。

在絲氨酸循環(huán)途徑中，甲醛可通過兩條途徑進(jìn)入絲氨酸循環(huán)。在第一條途徑中，甲醛直接與四氫葉酸結(jié)合形成亞甲基四氫葉酸；在第二條途徑中，甲醛首先經(jīng)一系列反應(yīng)生成甲酸，然后再形成亞甲基四氫葉酸。亞甲基四氫葉酸再與甘氨酸縮合形成絲氨酸，該步驟由絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyltransferase）催化。絲氨酸經(jīng)過多步反應(yīng)生成乙醛酸和乙酰輔酶A，乙醛酸則用于甘氨酸再生，而乙酰輔酶A通過乙基丙二酰輔酶A途徑被細(xì)胞利用。

2.5 甲酸代謝

甲酸的異化途徑由甲酸脫氫酶催化甲酸氧化生成CO2，為細(xì)胞提供還原力。甲酸的同化需要對其進(jìn)行還原，甲酸首先與四氫葉酸形成甲?；臍淙~酸，該反應(yīng)由甲酸四氫葉酸連接酶催化，同時需要消耗ATP，然后甲酰基四氫葉酸被還原生成亞甲基四氫葉酸，然后可進(jìn)入絲氨酸循環(huán)、Wood?Ljungdahl 途徑和還原甘氨酸途徑。亞甲基四氫葉酸也可進(jìn)一步被分解，生成甲醛，然后經(jīng)過XuMP和RuMP被同化進(jìn)入中心代謝[38]。

3 一碳化合物的微生物利用和轉(zhuǎn)化

自然界中廣泛存在能夠天然利用一碳化合物的微生物，對這些利用微生物進(jìn)行改造，已經(jīng)實現(xiàn)利用各種一碳化合物為原料合成多種燃料和化學(xué)品，Jiang等[17]已對相關(guān)代謝工程改造策略進(jìn)行了詳細(xì)的總結(jié)和討論。各種一碳化合物利用微生物、代表物種、宿主特性、遺傳操作和產(chǎn)物合成等見表1。

表1 一碳利用微生物及相關(guān)產(chǎn)物合成

3.1 CO2

CO2的生物利用首先需要進(jìn)行固碳，由于CO2是碳的最高氧化態(tài)，因此CO2的固定均需要能量輸入。不同的微生物利用不同的能量來源進(jìn)行CO2固定。微藻、藍(lán)細(xì)菌等光能自養(yǎng)微生物利用光能通過光合作用進(jìn)行CO2固定，化能無機(jī)自養(yǎng)微生物通過氧化還原態(tài)的無機(jī)物如氫、CO、銨鹽、亞硝酸、硫、硫化氫等提供能量進(jìn)行CO2固定。

植物、微藻和藍(lán)細(xì)菌等光能自養(yǎng)生物能夠通過光合作用利用光能，生成NADPH 和ATP，通過卡爾文循環(huán)固定CO2，并合成各種糖類等有機(jī)物，是地球最主要的碳固定者，為地球生態(tài)系統(tǒng)提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。許多微藻如小球藻（Chlorella）、隱甲藻（Crypthecodinium）、筒柱藻（Cylindrotheca）等能夠在細(xì)胞中積累三酰甘油（triacylglycerides，TAGs），通常占細(xì)胞干重的20%～50%，最高可達(dá)80%[39]，尤其在缺氮、缺磷、缺硫、高鹽等脅迫條件下，細(xì)胞中的三酰甘油會大量積累，可用于合成生物柴油[40]。目前，大部分微藻缺乏成熟的遺傳操作工具，改造相對困難，只有少數(shù)微藻能夠進(jìn)行遺傳操作，如萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、微擬球藻（Nannochloropsis）等[41]。

藍(lán)細(xì)菌是能夠進(jìn)行光合作用的原核微生物，由于其結(jié)構(gòu)簡單，遺傳改造相對容易，成為熱門的光合微生物底盤細(xì)胞，用于構(gòu)建光合細(xì)胞工廠。典型菌株如集胞藻PCC6803（Synechocystissp. PCC6803）、聚球藻PCC7942（Synechococcus elongatusPCC7942）、聚球藻PCC7002（Synechococcussp. PCC7002）等，均具有相對清晰的遺傳背景和成熟的遺傳操作工具[42]。對藍(lán)細(xì)菌的代謝途徑進(jìn)行改造，已實現(xiàn)了利用光能和CO2直接合成多種能源和化學(xué)品，如乙醇、乙烯、丁醇、異丁醇、長鏈脂肪酸和脂肪醇等[43?44]。

利用光能自養(yǎng)微生物合成生物基產(chǎn)品普遍面臨能量轉(zhuǎn)化效率有限的難題，研究表明，光合作用系統(tǒng)中光能到生物質(zhì)的理論最高能量利用效率為8%～10%，實際效率則低于3%[74]。多種因素限制了光合作用的能量利用效率，例如光合作用系統(tǒng)只吸收波長400～700nm 的太陽光，僅占太陽光總能量的45%，因此可對葉綠素進(jìn)行改造，拓寬光合作用的有效利用光譜，使其具有更高的太陽能捕獲效率[75]。

鉤蟲貪銅菌（C.necator，又稱Ralstonia eutropha）能夠分別以氫氣和CO2為能源和碳源進(jìn)行生長，通過卡爾文循環(huán)固定CO2，此外C.necator也能利用甲酸或有機(jī)碳為碳源和能源生長，因此屬于兼性化能無機(jī)自養(yǎng)微生物。C. necator利用氫氣與CO2的混合氣生長時氫氣的氧化依賴細(xì)胞中的氫化酶（hydrogenase），以氧氣或硝酸鹽為電子受體，C. necator中也發(fā)現(xiàn)了類似于藻類細(xì)胞中的CCM 相關(guān)的酶，能夠提高細(xì)胞中CO2濃度，供RuBisCO進(jìn)行碳固定[69]。

C.necator能夠在細(xì)胞中天然積累大量PHB，最高可達(dá)細(xì)胞干重的80%[70]，因此，可用于生產(chǎn)可降解塑料。該菌株具備相對成熟的遺傳操作體系[71?72]。通過引入外源合成途徑，同時敲除細(xì)胞內(nèi)源PHB 合成途徑，能夠?qū)⑻荚匆肫渌衔锏暮铣?，如異丙醇（最高產(chǎn)量達(dá)9.8g/L）[73,76]、異丁醇、異戊二烯類化合物[77]，糖類[78?79]和脂肪酸及其衍生物等[80?81]。C. necator也被用于微生物電合成系統(tǒng)的構(gòu)建，利用體外電子實現(xiàn)CO2的固定和轉(zhuǎn)化，模擬光合作用系統(tǒng)，該人工光合作用系統(tǒng)理論能量利用效率可達(dá)18%，實際效率達(dá)10%（利用純CO2），以大氣濃度的CO2培養(yǎng)時能量利用效率可達(dá)3%～4%[71]。

3.2 CO

自然界存在多種能夠利用CO 的微生物，包括許多細(xì)菌和古菌，這些微生物被稱作一氧化碳自養(yǎng)菌（carboxydotrophs）。根據(jù)CO 代謝時電子受體的不同，可以分為需氧和厭氧兩種類型。需氧的一氧化碳自養(yǎng)菌其CO 氧化以氧氣為最終電子受體。厭氧型一氧化碳自養(yǎng)菌種類繁多，包括產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌和硫酸鹽還原菌等，厭氧的CO 代謝能夠產(chǎn)生多種燃料分子和化學(xué)品，如氫氣、甲烷、乙醇和多種有機(jī)酸等，有很大的潛在應(yīng)用價值。一氧化碳自養(yǎng)菌也能夠利用合成生長，對合成氣的利用沒有嚴(yán)格的氣體純度和成分比例的要求，且能耐受氣體中其他污染物，因此一氧化碳自養(yǎng)菌在處理工業(yè)（水泥生產(chǎn)、火力發(fā)電、煉鋼冶煉等）廢氣（含有CO、CO2、氫氣等）用于合成燃料和化學(xué)品方面具有應(yīng)用前景。

需氧的一氧化碳自養(yǎng)菌通過氧化CO提供能量，利用卡爾文循環(huán)固定CO2，也能以氫氣氧化為細(xì)胞提供能量，用于CO2固定。這類微生物遺傳操作工具相對匱乏[45]，目前，僅有少數(shù)菌株實現(xiàn)了遺傳改造[46?47]。代表菌株食羧寡養(yǎng)菌（Oligotropha carboxidovorans）和類黃色氫嗜菌（Hydrogenophaga pseudoflava）是被研究最為廣泛的兩株需氧型一氧化碳自養(yǎng)菌。食羧寡養(yǎng)菌屬兼性化能無機(jī)自養(yǎng)微生物（chemolithoautotrophic），除了能夠以CO 為唯一碳源和能源生長，也能以氫氣和CO2的混合氣生長，此外，還能利用乙酸、乳酸、丙酮酸等進(jìn)行異養(yǎng)生長。自養(yǎng)生長時生長速率較低，倍增時間較長，以CO為碳源和能源時倍增時間約20h，以氫氣和CO2為能源和碳源倍增時間約7h[82]，利用合成氣時倍增時間為40～50h[47]。近期，Siebert 等[45]建立了食羧寡養(yǎng)菌穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化、基因敲除、基因表達(dá)等遺傳操作系統(tǒng)，為該菌的后續(xù)研究和改造奠定了基礎(chǔ)。類黃色氫嗜菌是另外一株被廣泛研究的需氧型一氧化碳自養(yǎng)菌，其以CO 為唯一碳源和能源生長時倍增時間約12h，利用氫氣和CO2培養(yǎng)時倍增時間約7h，該菌株已被成功進(jìn)行代謝工程改造，利用合成氣合成α?紅沒藥烯[46]。

產(chǎn)乙酸菌（acetogens）是被廣泛研究的厭氧CO利用微生物，除CO外，產(chǎn)乙酸菌還能利用合成氣、氫氣和CO2的混合氣體、甲醇、甲酸、乙醇等進(jìn)行生長。產(chǎn)乙酸菌通過Wood?Ljungdahl 途徑進(jìn)行碳固定，能夠利用一碳化合物天然合成乙醇、乙酸、乳酸、丁醇、2,3?丁二醇等，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。其中，以一碳?xì)怏w為原料，利用野生型產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum，C. autoethanogenum）生產(chǎn)乙酸、乙醇和2,3?丁二醇已實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)[48]。以不同碳源為原料進(jìn)行發(fā)酵時，產(chǎn)乙酸菌能夠合成不同的產(chǎn)物，例如Eubacterium limosum在一碳?xì)怏w（H2/CO2/CO）為碳源和能源發(fā)酵時，主要產(chǎn)物為乙酸，而不合成丁酸；當(dāng)以甲醇為碳源發(fā)酵時，能夠大量積累丁酸[53]，顯示產(chǎn)乙酸菌具有很強(qiáng)的代謝可塑性。

厭氧梭狀芽孢桿菌（Clostridium，又稱食氣梭菌）是產(chǎn)乙酸細(xì)菌中的重要類群，代表菌株包括永達(dá)爾梭菌（C. ljungdahlii）、產(chǎn)乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌（C.carboxidivorans）等，是目前合成氣發(fā)酵中研究最多的菌株，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。另外，伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodii，A. woodii）也是產(chǎn)乙酸菌的模式菌株，被廣泛研究。目前，大部分產(chǎn)乙酸菌都缺乏成熟穩(wěn)定的遺傳操作工具，少數(shù)能夠進(jìn)行遺傳改造的菌株包括C. ljungdahlii、C. autoethanogenum、A. woodii等。近年來，啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、復(fù)制質(zhì)粒、CRISPR 系統(tǒng)、DNA 轉(zhuǎn)化、同源重組系統(tǒng)等逐漸被開發(fā)和完善，為后續(xù)產(chǎn)乙酸菌的研究和改造提供了便利[49]。除乙酸、乙醇等天然合成的產(chǎn)物外，通過對產(chǎn)乙酸菌進(jìn)行代謝工程改造，成功合成了其他多種能源和化學(xué)品。通過引入丙酮合成途徑，在C. ljungdahlii和A. woodii實現(xiàn)了以一碳?xì)怏w為原料丙酮的合成[50,83]；通過構(gòu)建PHB的合成途徑，實現(xiàn)了在Clostridium coskatii中PHB的合成[84]；在產(chǎn)乙酸菌中構(gòu)建的其他產(chǎn)物合成途徑包括乳酸[52]、丁酸[51]、異戊二烯和甲羥戊酸等[85]。

3.3 甲烷

甲烷氧化菌（methanotroph）能以甲烷為唯一碳源和能源生長，包括好氧甲烷氧化菌和厭氧甲烷氧化菌，在自然界中廣泛分布。好氧甲烷氧化菌以氧氣為電子受體進(jìn)行甲烷氧化，厭氧甲烷氧化菌以硫酸鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽以及金屬離子（Fe3+、Mn4+）等為電子受體氧化甲烷[86]。相關(guān)研究主要集中在好氧甲烷氧化菌，根據(jù)碳同化途徑的不同，可以將好氧甲烷氧化菌分為三類：第Ⅰ類通過核酮糖單磷酸途徑對甲烷進(jìn)行碳同化，屬于γ變形菌；第Ⅱ類通過絲氨酸循環(huán)對甲烷進(jìn)行碳同化，屬于α變形菌；第Ⅲ類主要由嗜熱、嗜酸菌組成，通過卡爾文循環(huán)固定CO2實現(xiàn)碳同化，屬于疣微菌門[86]。

目前，關(guān)于甲烷氧化菌代謝途徑的研究和利用主要集中在第Ⅰ類和第Ⅱ類甲烷氧化菌。甲烷氧化菌能夠天然利用甲烷積累多種化合物，如PHB、四氫嘧啶、谷氨酸、糖類、脂類等，另外利用甲烷氧化菌以廉價的甲烷或沼氣為原料生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白也一直被廣泛研究[54]。通過代謝工程改造，也在甲烷氧化菌中實現(xiàn)了多種其他化合物的合成，包括短鏈有機(jī)酸（乳酸、3?羥基丙酸、丁烯酸、琥珀酸）、長鏈脂肪酸、醇類（異丁醇、2,3?丁二醇、1,4?丁二醇）、萜類（異戊二烯、檸檬烯、法呢烯、蝦青素）等[54?55]。

利用甲烷氧化菌合成甲醇也受到廣泛關(guān)注。甲醇是甲烷氧化的直接產(chǎn)物，通過抑制甲醇脫氫酶（MDH）可實現(xiàn)甲醇的積累。Xin 等[87]發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)體系中存在CO2時，甲烷氧化菌Methylosinus trichosporiumIMV 3011 能夠通過分解體內(nèi)積累的PHB提供能量，用于固定CO2生成甲醇。由于沼氣中含有一定量的CO2，以沼氣為原料進(jìn)行甲烷氧化菌發(fā)酵也能實現(xiàn)甲醇的積累，研究還發(fā)現(xiàn)，沼氣中的CO2對于MDH 有抑制作用，因此有助于中間產(chǎn)物甲醇的積累[88]。

3.4 甲醇

自然界中存在多種能夠以甲醇為唯一碳源和能源的微生物，包括原核的甲醇細(xì)菌（扭脫甲基桿菌、甲醇芽孢桿菌等）和真核的甲醇酵母（巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母、博伊丁假絲酵母等），廣泛分布于廢水、土壤和植物表面。由于甲醇是甲烷代謝的中間產(chǎn)物，因此甲烷氧化菌也能夠利用甲醇為底物生長。

扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens）是目前研究最為詳細(xì)的甲醇細(xì)菌，屬于兼性甲基營養(yǎng)菌，不僅能以還原性的一碳化合物（甲醇、甲胺等）為底物生長，也能以乙酸、琥珀酸等二碳和多碳化合物為底物生長[57,89]。扭脫甲基桿菌利用PQQ 依賴型的甲醇脫氫酶氧化甲醇，其甲醇氧化過程位于細(xì)胞周質(zhì)空間。細(xì)胞中含有兩類甲醇脫氫酶，一類為依賴鈣離子的甲醇脫氫酶（MxaFI），另一類為近年來發(fā)現(xiàn)的依賴鑭系金屬的甲醇脫氫酶（XoxF）[90]。甲醇芽孢桿菌（Bacillus methanolicus）是另一株被廣泛研究的嗜熱甲醇細(xì)菌，最適生長溫度為50～53℃[58]。甲醇芽孢桿菌通過RuMP 進(jìn)行一碳固定，具有優(yōu)良的氨基酸合成能力，野生型菌株MGA3在以甲醇為碳源條件下，能夠積累0.4g/L 的L?賴氨酸、12g/L的L?丙氨酸和60g/L的L?谷氨酸[91]。

甲醇細(xì)菌尤其是在模式菌扭脫甲基桿菌中，已建立了相對成熟的遺傳操作體系，包括基因表達(dá)、基因敲除、轉(zhuǎn)座子突變以及基于CRISPR/Cas9的基因編輯和基因調(diào)控等工具[59?60,92?94]，為甲醇細(xì)菌的深入研究和開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。通過代謝工程改造，已在甲醇細(xì)菌中實現(xiàn)了甲醇到多種能源和化學(xué)品的生物轉(zhuǎn)化，包括聚羥基脂肪酸酯類化合物（PHAs）、氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸類化合物以及各種精細(xì)化學(xué)品等[61,95]。

甲醇酵母的甲醇代謝位于過氧化物酶體，能夠區(qū)隔中間代謝物甲醛和過氧化氫，降低其細(xì)胞毒性。巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii，又名Pichia pastoris）和多形漢遜酵母（Ogataea polymorpha）是兩株代表性菌株，除甲醇外，還能利用葡萄糖和甘油等多種碳源。兩株甲醇酵母中均建立了相對完善的基因表達(dá)、同源重組、CRISPR/Cas9基因敲除等遺傳操作體系[62?63,66,68]。利用甲醇酵母為宿主，通過代謝工程改造實現(xiàn)了利用甲醇合成乳酸和蘋果酸等小分子有機(jī)酸以及長鏈脂肪酸及其衍生物等[64?65,67,96?98]，相關(guān)綜述已在這方面作了詳細(xì)的總結(jié)和闡述[99]。

3.5 甲酸

甲酸的微生物利用分為需氧和厭氧兩種類型。在需氧的甲酸代謝中，甲酸被氧化生成CO2，為細(xì)胞提供能量并用于CO2固定。C. necator除了能利用氫氣和CO2的混合氣體生長外，也能以甲酸為唯一碳源和能源生長，是研究最多的甲酸利用微生物之一，其甲酸代謝以氧氣為電子受體。C. necator利用相對耗能的CBB循環(huán)進(jìn)行CO2固定，所以以甲酸為碳源和能源進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和產(chǎn)物合成時得率較低。Claassens 等[100]嘗試通過將C. necator中的碳固定途徑由卡爾文循環(huán)替換為更高效的還原甘氨酸途徑，最終以甲酸為碳源生長時細(xì)胞生物量得率接近野生型菌株，雖然沒有檢測到生物量得率的進(jìn)一步提高，但是為后續(xù)改造提供了思路。

厭氧的甲酸利用微生物主要為產(chǎn)乙酸菌，這些產(chǎn)乙酸菌能夠直接同化甲酸進(jìn)入Wood?Ljungdahl途徑最終生成乙酰?CoA。除甲酸外，甲醇也能通過該途徑被直接同化，而不經(jīng)過中間代謝物甲醛。近期，Moon 等[101]挖掘了模式產(chǎn)乙酸菌A. woodii甲酸利用的關(guān)鍵酶（甲?；?四氫葉酸合酶和甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），這兩個基因的敲除使細(xì)胞甲酸利用速率大幅降低。該作者又詳細(xì)研究了A. woodii的甲酸利用特性，結(jié)果顯示，利用甲酸培養(yǎng)時，細(xì)胞會大量積累乙酸，而以氫氣和CO2培養(yǎng)時，細(xì)胞會暫時積累甲酸，然后又被重新利用，而甲?；?四氫葉酸合酶和甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的雙敲除突變體無法重新利用前期積累的甲酸。

4 合成型一碳化合物利用體系

與模式微生物相比，能夠天然利用一碳化合物的微生物遺傳背景不夠清晰，缺乏完善的合成生物學(xué)工具，許多菌株難以進(jìn)行遺傳操作（如大部分微藻、產(chǎn)乙酸菌等），因此利用模式微生物如大腸桿菌、釀酒酵母等為宿主，通過引入一碳化合物代謝途徑，構(gòu)建合成型一碳化合物利用微生物成為近年來的研究熱點(diǎn)。其中，大腸桿菌是最常用的宿主，通過分別構(gòu)建卡爾文循環(huán)、還原甘氨酸途徑、POAP 循環(huán)、FORCE 途徑、RuMP 途徑、絲氨酸循環(huán)等，使得大腸桿菌能夠同化CO2、甲酸、甲醇等多種碳源。在釀酒酵母、解脂耶氏酵母和谷氨酸棒桿菌中分別引入甲醇代謝途徑（XuMP 途徑、RuMP 途徑），使得這些微生物具備了甲醇同化能力（表2）。

表2 合成型一碳化合物利用體系

合成型一碳化合物利用微生物雖然具備一定的一碳化合物同化能力，然而，這些微生物普遍面臨一碳化合物利用速率慢、異源一碳代謝途徑與宿主內(nèi)生代謝途徑不匹配等問題，導(dǎo)致菌株無法生長或生長緩慢。因此，在菌株構(gòu)建時，除了理性設(shè)計和代謝模型輔助設(shè)計合成型一碳利用途徑外，適應(yīng)性進(jìn)化也是解決合成型一碳化合物利用菌株生長緩慢的有效途徑。Gleizer等[102]通過在大腸桿菌中引入卡爾文循環(huán)和甲酸氧化途徑，嘗試構(gòu)建以甲酸氧化提供能量固定CO2的自養(yǎng)型大腸桿菌，然而初期得到的菌株以甲酸和CO2培養(yǎng)時無法生長，該作者通過數(shù)月的適應(yīng)性進(jìn)化，成功得到了能夠自養(yǎng)生長的菌株，進(jìn)一步研究表明，進(jìn)化后的菌株在糖代謝、氨基酸合成、核苷酸合成和脂類合成等許多途徑發(fā)生突變，說明細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)需要建立新的平衡才能有效利用一碳底物。

另外，構(gòu)建體外酶催化體系也是實現(xiàn)一碳底物有效利用和轉(zhuǎn)化的途徑之一。體外酶催化體系易于控制，能夠避免活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，克服活細(xì)胞代謝和生長易受毒副產(chǎn)物抑制等難題，具有催化專一性高、副產(chǎn)物少、便于后續(xù)產(chǎn)物分離純化等優(yōu)點(diǎn)，因此在一碳化合物利用和轉(zhuǎn)化方面越來越受到重視。最近，馬延和研究員團(tuán)隊[134]通過多酶催化體系的模塊化組裝，利用C1模塊（甲醛合成）、C3模塊（3?磷酸甘油醛合成）、C6模塊（葡萄糖6?磷酸合成）和Cn模塊（淀粉合成），構(gòu)建了高效合成淀粉的多酶催化系統(tǒng)，結(jié)合CO2人工甲醇合成，實現(xiàn)了以CO2為原料人工合成淀粉的重大突破，其效率可達(dá)到植物天然淀粉合成途徑的8.5 倍。然而，體外酶催化體系需要克服酶的高效和低成本分離純化、提高酶的穩(wěn)定性、輔因子高效再生等難題。

5 結(jié)語和展望

一碳化合物作為下一代生物制造原料，其高效轉(zhuǎn)化和利用對于推動低碳、綠色、可持續(xù)的發(fā)展具有重要意義，也是實現(xiàn)“碳達(dá)峰、碳中和”目標(biāo)的重要途徑之一。雖然一碳化合物生物利用和轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究正取得快速進(jìn)展，并已實現(xiàn)微生物和體外酶催化系統(tǒng)利用一碳原料合成多種能源燃料、大宗化學(xué)品和精細(xì)化學(xué)品，然而一碳化合物的生物轉(zhuǎn)化涉及代謝途徑設(shè)計、菌株構(gòu)建、過程優(yōu)化等多方面內(nèi)容仍然面臨諸多難題有待解決，需要進(jìn)一步開展研究。

（1）一碳化合物利用微生物的遺傳背景、一碳代謝途徑及其調(diào)控等普遍缺乏深入了解，缺乏高效的合成生物學(xué)工具，限制了一碳化合物利用微生物開發(fā)和利用。

（2）關(guān)鍵酶的篩選與改造，一碳化合物代謝的許多關(guān)鍵酶催化效率偏低，需要挖掘新的高催化活性的酶，或者對已有的酶進(jìn)行改造，RuBisCO、一氧化碳脫氫酶、甲醇脫氫酶等的篩選和改造為這方面研究提供了思路[35?36,135]。

（3）CO、甲酸等一碳化合物還原度低，其氧化提供的能量有限，導(dǎo)致生物轉(zhuǎn)化時得率低，可通過與其他高還原度的化合物（甲烷、氫氣等）共培養(yǎng)，利用這些化合物的氧化提供額外電子。

（4）一碳?xì)怏w水溶解度低，培養(yǎng)時傳質(zhì)效率低，是氣體發(fā)酵的限速步驟，因此需要對相關(guān)氣體反應(yīng)器進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計[136]。