王尚濤,朱成豪,江 媛,張遠(yuǎn)帆,王彥珺,張淑睿,孫志蓉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488)

美花石斛(Dendrobiumloddigesii),又稱粉花石斛、環(huán)草石斛,為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物,以新鮮或干燥莖入藥,在中國(guó)傳統(tǒng)藥用石斛應(yīng)用中具有悠久的歷史,其加工品在中國(guó)臺(tái)灣、香港以及東南亞等地享有很高的聲譽(yù)[1]。多糖類成分是美花石斛中的主要成分,現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力的作用[2-4]。美花石斛廣泛分布在我國(guó)兩廣地區(qū)、海南、云南南部、貴州西南部,歷史上又以我國(guó)貴州省興義市所產(chǎn)美花石斛質(zhì)量?jī)?yōu)、產(chǎn)量高,但由于長(zhǎng)期不合理的采收利用,加之喀斯特地貌的環(huán)境變化,導(dǎo)致其野生資源瀕臨枯竭[5],1987年被列為中國(guó)三級(jí)珍稀瀕危保護(hù)植物,2021年被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[6]。美花石斛的種子中不含胚乳,球狀原胚直接被一層透明種皮包裹,自然狀態(tài)下種子因缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以萌發(fā),繁殖率極低,與其他藥用石斛種類相比,植株生長(zhǎng)更加緩慢,更新恢復(fù)周期長(zhǎng),野生資源分布稀少[1]。通過(guò)多年的試驗(yàn)研究,雖然現(xiàn)已經(jīng)成功培育出美花石斛試管苗[7-9],但是還存在著試管苗的數(shù)量、質(zhì)量難以保證和移栽成活率低等問(wèn)題[10],因此保護(hù)野生資源,加強(qiáng)美花石斛人工栽培技術(shù)的研究非常迫切[11],如何提高美花石斛試管苗質(zhì)量仍需深入研究。

光照是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素,光照強(qiáng)度對(duì)組培植物的形態(tài)、光合作用、內(nèi)源激素及葉片結(jié)構(gòu)具有顯著影響[12,13]。研究表明,不同強(qiáng)度的光照能通過(guò)調(diào)節(jié)不同類型的、與光合作用有關(guān)的葉綠體蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成,以及光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光系統(tǒng)Ⅱ (PSⅡ)間的電子傳遞來(lái)影響植株的生長(zhǎng)[14,15]。植物所表現(xiàn)出的生長(zhǎng)現(xiàn)象、發(fā)育規(guī)律和生理生化特性是遺傳基因和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果[11,16],植物對(duì)不同調(diào)控措施所做出的形態(tài)和生理等反應(yīng)會(huì)決定生產(chǎn)目標(biāo)的數(shù)量和質(zhì)量。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者對(duì)不同光照處理的菊花(Chrysanthemummorifolium)[17]、文心蘭(Oncidiumflexuosum)[13]、黃瓜(Cucumissativus)[18]、番茄(Solanumlycopersicum)[19]和金娃娃萱草(Hemerocallisfulva‘Golden Dolli’)[20]等進(jìn)行研究,并取得初步成果,但有關(guān)光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗生理生化特性影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)研究不同光照強(qiáng)度處理下美花石斛試管苗的生長(zhǎng)發(fā)育、多糖含量、光合特性和熒光特性等變化,探索美花石斛試管苗對(duì)光照強(qiáng)度的需求特性,為美花石斛優(yōu)質(zhì)種苗培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟的美花石斛種子由貴州吉仁堂藥業(yè)公司提供。種子經(jīng)消毒后,在無(wú)菌條件下播種于種子萌發(fā)生長(zhǎng)培養(yǎng)基[MS+0.2 mg/L萘乙酸(NAA)+3%白砂糖+15%馬鈴薯提取液+0.8%瓊脂粉,pH值為5.8]表面,萌發(fā)生長(zhǎng)2個(gè)月后,將其轉(zhuǎn)接到分化生長(zhǎng)培養(yǎng)基上(MS+0.5 mg/L NAA+3%白砂糖+20%馬鈴薯提取液+0.8%瓊脂粉,pH值為5.8),培養(yǎng)條件均為光照強(qiáng)度18 μmol·m-2·s-1,光照時(shí)間12 h/d,溫度為(25±2) ℃[21]。2個(gè)月后,選苗高約0.5 cm,長(zhǎng)有1-2片真葉、1-2條短根的試管苗轉(zhuǎn)接至生根壯苗培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L NAA+3%白砂糖+20%馬鈴薯提取液+0.8%瓊脂粉,pH值為5.8)。分別設(shè)置18 μmol·m-2·s-1(G1)、36 μmol·m-2·s-1(G2)、54 μmol·m-2·s-1(G3)的光照強(qiáng)度處理試管苗,光照時(shí)間12 h/d,溫度為(25±2) ℃。接種玻璃瓶規(guī)格為直徑7 cm,高9 cm,接種密度10株/瓶,每處理接種20瓶。光照處理2個(gè)月(播種生長(zhǎng)6個(gè)月)和光照處理4個(gè)月(播種生長(zhǎng)8個(gè)月)時(shí)分別取樣,測(cè)定美花石斛試管苗生長(zhǎng)指標(biāo)、多糖含量、光合特性和熒光特性指標(biāo)。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

光照處理2個(gè)月和光照處理4個(gè)月時(shí)分別取樣,每處理隨機(jī)抽取10瓶,再?gòu)闹须S機(jī)取30株,用直尺測(cè)定株高和根長(zhǎng),用游標(biāo)卡尺測(cè)量根與莖連接處的莖粗,并將鮮樣品置于50 ℃烘箱烘至恒重后用電子天平稱重。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[22]。

1.2.3 葉綠素含量的測(cè)定

稱取0.5 g葉片,將其浸泡在12 mL 80%丙酮溶劑中,一定時(shí)間(約4 d,以葉片變白為宜)后用瑞士Kontron公司生產(chǎn)的UV810/812型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),分別測(cè)定645 nm和663 nm處的吸收值,計(jì)算出葉綠素a、b的含量以及總含量[23]。每處理重復(fù)測(cè)定3株,每株3個(gè)葉片,計(jì)算平均值。

1.2.4 表觀光合速率的測(cè)定

參照Xu等[24]的方法并加以修改。采用英國(guó)Hansatech公司生產(chǎn)的Oxy-Lab氧電極自動(dòng)測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定,反應(yīng)體積為2 mL,反應(yīng)介質(zhì)為100 mmol/L磷酸緩沖液、20 mmol/L NaHCO3,測(cè)定時(shí)每2 mL反應(yīng)介質(zhì)加入0.05 g葉片。當(dāng)光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-1時(shí),測(cè)定反應(yīng)液中O2濃度的變化,單位時(shí)間內(nèi)每克葉片的反應(yīng)液中O2變化的摩爾數(shù),即為表觀光合速率。每處理重復(fù)測(cè)定3株,每株3個(gè)葉片,計(jì)算平均值。

1.2.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

選擇光照處理2個(gè)月和光照處理4個(gè)月為測(cè)定時(shí)間點(diǎn),于上午9:00-11:30進(jìn)行測(cè)定。選取從上往下數(shù)完全展開(kāi)的第1片葉。每處理重復(fù)測(cè)定3株,每株3片葉,計(jì)算平均值。所用儀器為德國(guó)Heinz Walz GmbH公司生產(chǎn)的PAM-2100脈沖調(diào)制式熒光儀,在室溫下進(jìn)行熒光動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定。將葉片暗適應(yīng)20 min,在弱調(diào)制測(cè)量光(650 nm,脈沖光時(shí)間0.8 s,0.1 μmol·m-2·s-1)下誘導(dǎo)產(chǎn)生初始熒光Fo,隨后用強(qiáng)飽和脈沖光(650 nm,脈沖光時(shí)間0.8 s,8 000 μmol·m-2·s-1)激發(fā)產(chǎn)生最大熒光Fm。當(dāng)熒光從Fm降低至Fo水平時(shí),用光化光(665 nm,脈沖光時(shí)間10 s,600 μmol·m-2·s-1)誘導(dǎo)美花石斛生成熒光動(dòng)力學(xué)曲線,進(jìn)行熒光參數(shù)測(cè)定。在測(cè)定過(guò)程中光化光-飽和脈沖光-遠(yuǎn)紅光-黑暗交替作用,測(cè)定光適應(yīng)下的穩(wěn)態(tài)熒光Fs、最大熒光Fm′、最小熒光Fo′等參數(shù),進(jìn)而計(jì)算出PSⅡ的最大光化學(xué)效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm,PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)量子效率Y(Ⅱ)=ΔF/Fm′=(Fm′-Fs)/Fm′,光化學(xué)猝滅系數(shù)qP=(Fm′-Fs)/(Fm′-Fo′),非光化學(xué)猝滅系數(shù)qN=1-(Fm′-Fo′)/(Fm-Fo)。在完成熒光誘導(dǎo)曲線測(cè)定后,立即進(jìn)行光合電子傳遞速率(ETR)-光化光(PAR)熒光光響應(yīng)曲線的測(cè)定,測(cè)定過(guò)程與誘導(dǎo)生成熒光動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定過(guò)程基本相同,有所不同的是PAR強(qiáng)度從11 μmol·m-2·s-1依次增加到483 μmol·m-2·s-1,每個(gè)強(qiáng)度的PAR持續(xù)時(shí)間為10 s,最后通過(guò)所得的各個(gè)熒光參數(shù),利用公式ETR=Y(Ⅱ)×PAR×0.5×0.84 計(jì)算出光合電子傳遞速率ETR。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖,采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

由表1可知,隨著光照強(qiáng)度增大,光照處理2個(gè)月的試管苗苗高、葉片數(shù)、根長(zhǎng)、莖葉干重及多糖含量均顯著增大,而光照處理4個(gè)月的試管苗除葉片數(shù)和根長(zhǎng)外,其余各指標(biāo)均隨著光照強(qiáng)度增大而顯著增加。

表1 光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗生長(zhǎng)指標(biāo)及多糖含量的影響

2.2 光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗光合特性的影響

2.2.1 光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗葉綠素含量的影響

由圖1可知,光照處理2個(gè)月時(shí),試管苗的葉綠素總含量隨著光照強(qiáng)度的增大而減弱;不同光照強(qiáng)度處理間,葉綠素a/b的值均在2.0-2.1范圍內(nèi)浮動(dòng),變化較小。光照處理4個(gè)月時(shí),G2、G3處理的試管苗葉綠素總含量較高,分別為25.7 μg·g-1和23.0 μg·g-1,與G1處理(16.8 μg·g-1)相比差異顯著;不同光照強(qiáng)度處理間,葉綠素a/b的值均在2.0-2.5范圍內(nèi),且G1、G2處理的葉綠素a/b的值顯著高于G3處理。光照處理2個(gè)月時(shí),中、低光照強(qiáng)度處理的試管苗葉綠素總含量高于高光照強(qiáng)度處理的試管苗;光照處理4個(gè)月時(shí),中、高光照強(qiáng)度處理的試管苗葉綠素總含量高于低光照強(qiáng)度處理。隨著試管苗生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各處理間葉綠素a/b比值的差異增大,光照處理4個(gè)月試管苗的葉綠素a/b比值均高于對(duì)應(yīng)光照強(qiáng)度處理2個(gè)月試管苗的水平。

Significant differences were denoted by different letters.

2.2.2 光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗表觀光合速率的影響

由圖2可知,3種光照強(qiáng)度條件下,處理2個(gè)月試管苗的表觀光合速率均比處理4個(gè)月試管苗的高。光照處理2個(gè)月時(shí),各處理間的表觀光合速率差異顯著,并隨著光照強(qiáng)度增大表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì),其中G2處理的表觀光合速率最大,為0.045 9 nmol·g-1·s-1。光照處理4個(gè)月時(shí),3種光照強(qiáng)度下試管苗的表觀光合速率值的變化情況與光照處理2個(gè)月時(shí)的相反,以G2處理的表觀光合速率值最低,而G1與G3處理的表觀光合速率較為接近。上述結(jié)果說(shuō)明不同光照強(qiáng)度下,美花石斛試管苗的光合能力不相同,且不同發(fā)育時(shí)期的試管苗對(duì)光照強(qiáng)度的適應(yīng)性也有所不同。

Significant differences were denoted by different letters.

2.3 光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗熒光特性的影響

由圖3可知,3種光照強(qiáng)度條件下,光照處理2個(gè)月試管苗的Fo在各處理間差異不顯著;而PSⅡ的Fv/Fm以G2處理最高,G3處理最低,各處理間差異顯著。光照處理4個(gè)月,G1、G2處理試管苗的Fo與G3處理差異較大,而PSⅡ的Fv/Fm以G1處理較高,但各處理間差異不顯著。從Fo、Fv/Fm的變化情況來(lái)看,不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期,美花石斛試管苗對(duì)3種強(qiáng)度的光照的響應(yīng)不同。

Significant differences were denoted by different letters.

從圖4可知,3種光照強(qiáng)度條件下,光照處理2個(gè)月和處理4個(gè)月試管苗的Y(Ⅱ)和ETR均以G3處理最高,且處理2個(gè)月的Y(Ⅱ) 和ETR均高于對(duì)應(yīng)光照強(qiáng)度下處理4個(gè)月的。光照處理2個(gè)月和處理4個(gè)月試管苗的qN均以G2處理最高,但光照處理2個(gè)月的以G3處理最低,光照處理4個(gè)月的以G1處理最低。光照處理2個(gè)月和處理4個(gè)月試管苗qP均以G3處理最高。不同光照和處理時(shí)間下的Y(Ⅱ)和ETR的結(jié)果表明,G3處理的光照有利于PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子效率和非環(huán)式電子傳遞速率的提高,而這兩個(gè)參數(shù)是由Fv/Fm和碳循環(huán)速率共同決定的,表明隨著不同光照的光照強(qiáng)度和處理時(shí)間的增加,在所發(fā)生的、實(shí)際光化學(xué)量子效率提高這個(gè)過(guò)程中,碳循環(huán)的變化可能起主導(dǎo)作用。另外,qN的變化情況可反映兩個(gè)時(shí)期美花石斛試管苗熱耗散的變化,G2處理的光照對(duì)播種生長(zhǎng)6個(gè)月試管苗的熱耗散系統(tǒng)的建立較為有利,而G2和G3處理的光照對(duì)播種生長(zhǎng)8個(gè)月試管苗熱耗散系統(tǒng)的建立較為有利。qP的變化結(jié)果與Y(Ⅱ)的結(jié)果相似,表明G3處理的光照有利于PSⅡ反應(yīng)中心將光能轉(zhuǎn)化為電勢(shì)能。

圖4 光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗熒光參數(shù)Y(Ⅱ)、ETR、qN和qP的影響

3 討論

美花石斛試管苗移栽初期,是從無(wú)菌、溫度和光照強(qiáng)度恒定、濕度飽和的環(huán)境向有菌的、不穩(wěn)定的自然環(huán)境過(guò)渡,因此,在移栽前對(duì)其進(jìn)行壯苗培養(yǎng)尤為重要。故本研究設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)選擇在美花石斛轉(zhuǎn)移到生根壯苗培養(yǎng)基上開(kāi)始,以分析不同光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛根上部生長(zhǎng)的影響并探討碳同化作用。

光照強(qiáng)度直接影響植物的光合作用,進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。較低光照強(qiáng)度會(huì)影響試管苗對(duì)培養(yǎng)基中氮素和磷素的吸收[25],同時(shí)影響葉片的氣孔發(fā)育[26],進(jìn)而影響光合速率。在前期實(shí)地調(diào)查中發(fā)現(xiàn),生產(chǎn)中組培室內(nèi)美花石斛試管苗壯苗培養(yǎng)光照強(qiáng)度在27 μmol·m-2·s-1左右,但此壯苗培養(yǎng)條件下美花石斛試管苗生長(zhǎng)發(fā)育狀況差,故本研究設(shè)置18-54 μmol·m-2·s-1的梯度變化來(lái)考察光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗生長(zhǎng)的影響。光合色素能夠吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能,是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[20],葉綠素的含量、比例是植物適應(yīng)環(huán)境和利用環(huán)境資源的重要指標(biāo),葉綠素總含量高、葉綠素a/b的值小的植物具有較強(qiáng)的耐陰性。本研究結(jié)果表明,隨著光照強(qiáng)度加大和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),G3處理的美花石斛試管苗的生長(zhǎng)量如苗高、莖粗等,生物量積累如莖葉干重、根干重和多糖含量等均高于G1處理。不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同光照強(qiáng)度下美花石斛試管苗的葉綠素a/b的值均小于3,這符合陰生植物的特性[27]。隨著光照強(qiáng)度處理時(shí)間延長(zhǎng),美花石斛試管苗葉片葉綠素a/b的比值逐漸增大;光照處理2個(gè)月時(shí),G1處理的光照比G2、G3處理的更有利于試管苗葉綠素的合成,而光照處理4個(gè)月時(shí),G2處理的光照強(qiáng)度更有利于試管苗葉綠素的合成。根據(jù)課題組前期研究基礎(chǔ),從美花石斛試管苗的氣孔發(fā)育考慮,可能與18 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度阻礙了美花石斛的試管苗氣孔發(fā)育有關(guān)[28],即18 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度下,生長(zhǎng)前期的美花石斛試管苗已受弱光脅迫,當(dāng)時(shí)該光照強(qiáng)度雖然能短暫滿足該階段試管苗的光合能力需求,但是隨著處理時(shí)間的增加,其未正常發(fā)育的氣孔便會(huì)影響后期試管苗的光合能力。

Krause等[29]研究表明,Fo來(lái)自葉綠素a,即在正常情況下,一定范圍內(nèi)Fo的大小與葉綠素a的含量呈正相關(guān)。隨著光照處理時(shí)間延長(zhǎng),處理4個(gè)月時(shí)G1、G2處理的Fo與G3處理之間差異顯著。隨著光照處理時(shí)間從2個(gè)月到4個(gè)月,各處理間的PSⅡ最大光化學(xué)效率差異從顯著變?yōu)椴伙@著,這表明美花石斛試管苗的PSⅡ最大光化學(xué)效率在發(fā)育初期對(duì)光照的反應(yīng)比較敏感,一旦光反應(yīng)系統(tǒng)形態(tài)建成后,其受光照調(diào)節(jié)的幅度逐漸減小。從Fv/Fm的變化結(jié)果來(lái)看,播種生長(zhǎng)6個(gè)月時(shí)36 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度有利于試管苗PSⅡ最大光化學(xué)效率的提高。隨著光照處理時(shí)間延長(zhǎng),試管苗的Y(Ⅱ)、ETR和qP值逐漸減小,但2次取樣均以G3最高;qP的變化結(jié)果與Y(Ⅱ)的結(jié)果相似,表明G3處理的光照有利于PSⅡ反應(yīng)中心將光能轉(zhuǎn)化為電勢(shì)能;qN的變化進(jìn)一步反映兩個(gè)時(shí)期美花石斛試管苗對(duì)不同強(qiáng)度的光照的響應(yīng)不同,G2處理的光照有利于播種生長(zhǎng)6個(gè)月試管苗熱耗散系統(tǒng)的建立。綜合熒光參數(shù)的變化,36 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度有利于播種生長(zhǎng)6個(gè)月試管苗PSⅡ最大光化學(xué)效率的提高和熱耗散能力的增強(qiáng)。播種生長(zhǎng)8個(gè)月時(shí)的試管苗的qP值以54 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度處理下最高,這表明該光照強(qiáng)度有利于PSⅡ反應(yīng)中心將光能向電勢(shì)能轉(zhuǎn)化。考慮植物呼吸速率和熒光相關(guān)參數(shù)對(duì)光反應(yīng)系統(tǒng)的影響,即54 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度處理下的試管苗的表觀光合速率顯著高于36 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度處理下的試管苗,且Fo比36、18 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下高,這表明54 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度更有利于播種生長(zhǎng)8個(gè)月的美花石斛試管苗光反應(yīng)系統(tǒng)的完善。qN在G2、G3處理下都較高,且測(cè)定值較為接近,表明36、54 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度對(duì)8個(gè)月試管苗的熱耗散系統(tǒng)的建立都很有利。考慮植物呼吸速率對(duì)熱耗散系統(tǒng)的影響,即54 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度處理下的試管苗的表觀光合速率顯著高于36 μmol·m-2·s-1下的試管苗,認(rèn)為54 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度更有利于播種生長(zhǎng)8個(gè)月的美花石斛試管苗熱耗散系統(tǒng)的能力增強(qiáng)。由于條件限制,本研究所設(shè)置的光照強(qiáng)度梯度有限,在G3與G2處理?xiàng)l件下所測(cè)得的美花石斛部分葉綠素?zé)晒鈪?shù)差異不顯著,是否更大的光照強(qiáng)度會(huì)顯著影響美花石斛試管苗的光合作用參數(shù),還需后續(xù)進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

光照強(qiáng)度對(duì)美花石斛試管苗的生長(zhǎng)發(fā)育,尤其是光系統(tǒng)建成具有重要影響。在不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期美花石斛試管苗對(duì)光照強(qiáng)度的需求不同,隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其對(duì)光照強(qiáng)度的要求有所增大。培育過(guò)程中可根據(jù)試管苗的生長(zhǎng)節(jié)律適度進(jìn)行光照強(qiáng)度的調(diào)節(jié),以促進(jìn)優(yōu)質(zhì)壯苗的培育。