蔡隆強(qiáng), 梁莉華, 朱明君, 吳亞菊, 孫金川, 賓冬琪, 李芳耀

(桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,廣西 桂林 541199)

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康與生命[1],已成為全球第二大死因,而藥物治療是腫瘤治療的重要手段之一。盡管已有超過(guò)數(shù)十種抗腫瘤藥物用于臨床,但大部分化療藥物缺乏選擇性,毒副作用大,很多靶向抗腫瘤藥物容易產(chǎn)生耐藥效應(yīng)。因此,開(kāi)發(fā)新型的具有更好療效和安全性的抗腫瘤藥物以及療法是藥物化學(xué)家面臨的重大挑戰(zhàn)。

天然產(chǎn)物具有廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性和多效性,是新型抗腫瘤候選藥物和先導(dǎo)化合物的主要來(lái)源[2]。去氫樅酸(DHA)是一種含有羧基、菲環(huán)骨架的天然三環(huán)二萜類樹(shù)脂酸,與許多活性天然化合物有著相似或相近的結(jié)構(gòu)骨架,并且具有良好的生物相容性和生物可降解性。據(jù)最近報(bào)道,去氫樅酸衍生物具有廣泛的生物和藥理活性,具有抗炎[3]、抗菌[4]、抗原蟲(chóng)[5]、抗?jié)僛6]、抗病毒[7]、抗真菌[8]、抗衰老[9]和胃保護(hù)[10]等活性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，眾多去氫樅酸衍生物對(duì)宮頸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞均有較強(qiáng)抑制作用,并通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-14]。

硫化氫(H2S)是內(nèi)源性氣體信號(hào)分子,在心血管、神經(jīng)、炎癥反應(yīng)、呼吸、消化、血液新陳代謝、炎癥和腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等多系統(tǒng)或疾病過(guò)程中具有重要的病理生理作用[15]。硫化氫供體型化合物可以實(shí)現(xiàn)H2S固體化,近年來(lái)該類藥物在臨床的應(yīng)用也取得了重要進(jìn)展。朱翠琳等[16]合成了新型線粒體靶向性硫化氫供體AP39,該化合物可以抑制線粒體空泡及線粒體自噬體,改善心肌梗死大鼠心肌纖維化。李勐等[17]基于非甾體抗炎藥(NSAIDS),引入4-羥基硫代苯甲酰胺,得到一類NSAIDS的H2S供體分子,該類化合物不僅保留了NSAIDS的優(yōu)良抗炎活性,還可以有效減輕NSAIDS的胃腸道不良反應(yīng),調(diào)節(jié)平均動(dòng)脈壓,改善心血管毒副作用。硫化氫供體型化合物在抗腫瘤方面也表現(xiàn)出了一定的治療潛力[18]。有研究顯示,4-羥基硫代苯甲酰胺是一類可釋放H2S的抗腫瘤活性基團(tuán),抗炎藥萘普生與H2S供體4-羥基硫代苯甲酰胺拼合形成的ATB-346對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞有抑制增殖作用[19]。

課題組前期對(duì)去氫樅酸開(kāi)展了系列研究工作[20-24],并發(fā)現(xiàn)了若干抗腫瘤活性化合物。因此,本文在前期研究基礎(chǔ)上利用拼合原理將去氫樅酸通過(guò)不同碳鏈與H2S供體4-羥基硫代苯甲酰胺偶聯(lián)獲得一系列類似前藥性質(zhì)的“雜合體”,其合成路線如圖1所示。目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR和HR-MS表征。以阿霉素(DOX)為陽(yáng)性對(duì)照藥,采用MTT法測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人胃癌細(xì)胞(MGC803)、人膀胱癌細(xì)胞(T24)、人肺癌細(xì)胞(A549)和人正常肝細(xì)胞(LO2) 5種細(xì)胞株的體外細(xì)胞毒性,旨在發(fā)現(xiàn)新型具有抗腫瘤活性的去氫樅酸衍生物,為我國(guó)優(yōu)勢(shì)可再生的林化資源松香的高值化利用開(kāi)辟新途徑。

圖1 硫化氫供體型去氫樅酸衍生物的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WRX-4型熔點(diǎn)儀(上海易測(cè)儀器設(shè)備有限公司);AVANCE AV 400 MHz型核磁共振儀(Bruker公司,CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo));ESQUIREHCT型質(zhì)譜儀(Bruker公司);Prestige-21 FT IR型傅里葉變換紅外光譜儀(Simadzu公司,KBr壓片);OLYMPUS BX51型熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);ELX酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)。

歧化松香(AR)購(gòu)自廣西梧州松脂股份有限公司;1,2-二溴乙烷(AR)、 1,3-二溴丙烷(AR)、 1,5-二溴戊烷(AR)和1,6-二溴己烷(AR)購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;4-羥基硫代苯甲酰胺(AR)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余試劑均為分析純。HepG2、 MGC803、 T24、 A549和 LO2均由桂林醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供。

1.2 去氫樅酸-4-氨基硫代甲酰基苯酯(2)的合成

將去氫樅酸(0.50 g, 16.00 mmol),4-羥基硫代苯甲酰胺(0.17 g, 11.00 mmol),二環(huán)己基碳亞二亞胺(DCC)(0.22 g, 11.00 mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(26.00 mg, 0.22 mmol)溶于20 mL無(wú)水二氯甲烷中,室溫下攪拌24 h, TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)(石油醚 ∶乙酸乙酯=4 ∶1,V∶V)。反應(yīng)結(jié)束后,加入乙酸乙酯和蒸餾水萃取,有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥,過(guò)濾,減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析純化得0.39 g白色固體2。

化合物2:淡黃色粉末0.25 g,產(chǎn)率53.60%, m.p.175.0～176.7 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.92～7.88(m, 2H), 7.60(s, 1H), 7.20(d,J=8.2 Hz, 2H), 7.09～7.05(m, 2H), 7.02(dd,J=8.2 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.91(s, 1H), 2.99～2.92(m, 2H), 2.83(dt,J=13.8 Hz, 6.9 Hz, 1H), 2.43(dd,J=12.5 Hz, 2.0 Hz, 1H), 2.39～2.33(m, 1H), 1.99(d,J=4.6 Hz, 1H), 1.86(m, 5H), 1.65～1.61(m, 2H), 1.40(s, 3H), 1.27(s, 3H), 1.24(s, 3H), 1.22(s, 3H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 201.66(C=S), 176.80(C=O), 154.23, 146.63, 145.93, 136.54, 134.46, 128.39(2C, C3′、 C5′), 126.95, 124.22, 124.10, 121.54(2C, C2′、 C6′), 48.13, 44.89, 37.94, 37.01, 36.44, 33.48, 25.14, 23.97(2C, C16、 C17), 21.97, 18.55, 16.60; HR-MSm/z: calcd for C27H34NO2S{[M+H]+}436.2310 found 436.2307。

1.3 中間體去氫樅酸溴代酯(3)的合成

化合物3參考文獻(xiàn)[22]合成,將二溴烷烴(18.00 mmol)、去氫樅酸(1.50 g, 5.00 mmol)和無(wú)水碳酸鉀(1.30 g, 10.00 mmol)溶于20 mL DMF中,加熱至40 ℃,攪拌反應(yīng)4 h, TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)(石油醚 ∶乙酸乙酯=2 ∶1,V∶V)。反應(yīng)結(jié)束后,用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取,合并有機(jī)層后,用飽和食鹽水洗滌2次,在有機(jī)層中加入適量的無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜,過(guò)濾,減壓蒸除溶劑,粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱梯度層析得化合物3。

1.4 化合物(4)的合成

將化合物3(1.00 mmol)、無(wú)水碳酸鉀(0.20 g, 1.50 mmol)和4-羥基硫代苯甲酰胺(0.15 g, 1.00 mmol),溶于10 mL DMF中, 60 ℃攪拌反應(yīng)10 h, TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)(石油醚 ∶乙酸乙酯=3 ∶1,V∶V)。反應(yīng)結(jié)束后用二氯甲烷萃取(3×25 mL),有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌(2×30 mL),加入適量的無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜,過(guò)濾,減壓濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析得目標(biāo)化合物4。

去氫樅酸-2′-(4-氨基硫代甲?；窖趸?乙酯(4a):黃色粉末0.28 g,產(chǎn)率61.00%, m.p.88.3～90.1 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.88～7.80(m, 2H), 7.54(s, 1H), 7.15(d,J=8.2 Hz, 1H), 7.06(s, 1H), 7.00(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.90～6.86(m, 2H), 6.86(s, 1H), 4.52～4.35(m, 2H), 4.21(t, 2H), 2.87～2.77(m, 3H), 2.28(d,J=12.8 Hz, 1H), 2.24(dd,J=12.5 Hz, 2.0 Hz, 1H), 1.82(d,J=6.8 Hz, 1H), 1.74～1.61(m, 4H), 1.47～1.37(m, 2H), 1.27(s, 3H), 1.23(s, 3H), 1.21(s, 3H), 1.19(s, 3H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.27(C=S), 178.50(C=O), 161.89, 146.86, 145.83, 134.69, 131.68, 129.10(2C, C3′、 C5′), 126.96, 124.24, 123.95, 114.18(2C, C2′、 C6′), 66.13, 62.65, 47.77, 44.75, 37.95, 36.95, 36.52, 33.47, 30.10, 25.16, 24.00(2C, C16、 C17), 21.77, 18.56, 16.51; HR-MSm/z: calcd for C29H38NO3S{[M+H]+}480.2572 found 480.2570。

去氫樅酸-3′-(4-氨基硫代甲?；窖趸?丙酯(4b):黃色粉末0.21 g,產(chǎn)率43.80%, m.p.91.5～93.2 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.95～7.87(m, 2H), 7.71(s, 1H), 7.24(s, 1H), 7.19(d,J=8.2 Hz,1H), 7.03(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.92～6.86(m, 3H), 4.35～4.22(m, 2H), 4.11～4.08(m, 2H), 2.91～2.85(m, 2H), 2.85～2.82(m, 1H), 2.33(d,J=12.8 Hz, 1H), 2.26(dd,J=12.5 Hz, 2.0 Hz, 1H), 2.15(m, 2H), 1.89～1.82(m, 1H), 1.79～1.65(m, 4H), 1.54～1.48(m, 1H), 1.43～1.39(m, 1H), 1.30(s, 3H), 1.26(s, 3H), 1.24(s, 3H), 1.23(s, 3H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.25(C=S), 178.58(C=O), 162.16, 146.86, 145.82, 134.58, 131.36, 129.15(2C, C3′、 C5′), 126.96, 124.20, 124.00, 114.06(2C, C2′、 C6′), 64.75, 61.25, 47.74, 44.88, 37.97, 36.97, 36.70, 33.47, 30.09, 28.53, 25.21, 24.02(2C, C16、 C17), 21.79, 18.59, 16.55; HR-MSm/z: calcd for C30H40NO3S{[M+H]+}494.2729 found 494.2727。

去氫樅酸-5′-(4-氨基硫代甲?；窖趸?戊酯(4c):淡黃色粉末0.22 g,產(chǎn)率41.60%, m.p.146.7～147.4 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.93～7.88(m, 2H), 7.61(s, 1H), 7.19(m, 2H), 7.03(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.90(m, 1H), 6.89～6.86(m, 2H), 4.12(m, 2H), 4.03(t,J=6.3 Hz, 2H), 2.89(dd,J=9.7 Hz, 5.0 Hz, 2H), 2.84(dd,J=13.8 Hz, 6.9 Hz, 1H), 2.33(d,J=12.4 Hz, 1H), 2.28(dd,J=12.5 Hz, 1.9 Hz, 1H), 1.88(dd,J=10.4 Hz, 7.7 Hz, 1H), 1.86～1.78(m, 4H), 1.73～1.70(m, 2H), 1.66(m, 2H), 1.58～1.54(m, 2H), 1.50(m, 1H,), 1.46～1.43(m, 1H), 1.29(s, 3H), 1.25(s, 3H), 1.24(d,J=2.4 Hz, 6H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.35(C=S), 178.67(C=O), 162.48, 146.93, 145.77, 134.66, 131.08, 129.11(2C, C3′、 C5′), 126.94, 124.24, 123.98, 114.05(2C, C2′、 C6′), 67.94, 64.37, 47.69, 44.82, 37.98, 36.99, 36.67, 33.46, 30.16, 28.68, 28.41, 25.25, 24.00(2C,C16、 C17), 22.58, 21.78, 18.63, 16.55; HR-MSm/z: calcd for C32H44NO3S{[M+H]+}522.3042 found 522.3037。

去氫樅酸-6′-(4-氨基硫代甲?；窖趸?己酯(4d):黃色粉末0.22 g, 產(chǎn)率40.10%, m.p.103.4～104.5 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.88(d,J=8.1 Hz, 2H,), 7.68(s, 1H), 7.23(s, 1H), 7.17(d,J=8.1 Hz, 1H), 7.00(d,J=7.8 Hz, 1H), 6.91～6.78(m, 3H), 4.14～4.01(m, 2H), 3.98(t,J=6.1 Hz, 2H), 2.85～2.71(m, 3H), 2.29(d,J=12.4 Hz, 1H), 2.24(d,J=12.4 Hz, 1H), 1.88～1.74(m, 5H), 1.65(m, 4H), 1.51～1.38(m, 6H), 1.26(s, 3H), 1.23(s, 3H), 1.20(s, 6H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.33(C=S), 178.69(C=O), 162.54, 146.96, 145.76, 134.66, 131.06, 129.13(2C, C3′、 C5′), 126.93, 124.23, 123.98, 114.06(2C, C2′、 C6′), 68.11, 64.52, 47.68, 44.86, 38.01, 36.99, 36.68, 33.47, 30.16, 28.99, 28.59, 25.77, 25.65, 25.23, 23.99(2C, C16、 C17), 21.77, 18.64, 16.55; HR-MSm/z: calcd for C33H46NO3S{[M+H]+}536.3198 found 536.3194。

1.5 目標(biāo)化合物體外細(xì)胞毒性測(cè)試

以阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照藥,采用MTT法測(cè)試目標(biāo)化合物對(duì)HepG2、 MGC803、 T24、 A549和LO2的抑制活性。將上述5種細(xì)胞培養(yǎng)在10%完全培養(yǎng)基中(DMEM培養(yǎng)基 ∶胎牛血清 ∶雙抗(青鏈霉素)=100 ∶10 ∶1，V∶V∶V),并置于37 ℃、 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。細(xì)胞均勻接種在96孔板中,在96孔板的四周加入相同體積的PBS,培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁,分別按不同計(jì)量濃度加入阿霉素、去氫樅酸和目標(biāo)化合物,孵育44 h后每孔加入20 μL的MTT(5 mg·mL-1)處理4 h,終止培養(yǎng)。離心后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液,最后每孔加入150 μL的DMSO,震蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀在490 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定每孔吸光度OD值,計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后取平均值,利用SPSS 23.0計(jì)算IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成條件優(yōu)化

將去氫樅酸和4-羥基硫代苯甲酰胺進(jìn)行反應(yīng)時(shí),選擇酯化反應(yīng)法進(jìn)行拼接,在兩種催化條件下:(1) 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)/1-羥基苯并三唑(HOBT); (2) 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/二甲氨基吡啶(DMAP),去氫樅酸羧基與4-羥基硫代苯甲酰胺羥基化合物完成酯化。后者產(chǎn)率更高,在提純時(shí)更容易進(jìn)行，不僅節(jié)約溶劑且環(huán)保。在合成化合物3時(shí),二溴烷烴需過(guò)量3倍,其目的是為了減少雙酯副產(chǎn)物的生成。

2.2 化合物波譜解析

在1H NMR譜圖中,酰胺基團(tuán)中的伯胺和苯環(huán)上的氫化學(xué)位移特征峰出現(xiàn)在δ6.86～8.00,連接酯基和苯氧基的亞甲基上的特征峰出現(xiàn)在δ3.98～4.52。在13C NMR譜圖中,目標(biāo)化合物C=S中碳峰出現(xiàn)在δ201.00附近,羰基碳的特征峰出現(xiàn)在δ178.00附近,并且目標(biāo)化合物的質(zhì)荷比(m/z)均與所設(shè)計(jì)的目標(biāo)產(chǎn)物的分子量相吻合。由此可見(jiàn),目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)符合預(yù)期。

2.3 體外細(xì)胞毒性

采用MTT法測(cè)試了目標(biāo)化合物對(duì)HepG2、 MGC803、 T24、 A549和 LO2 5種細(xì)胞株的體外細(xì)胞毒性,結(jié)果如表1所示?；衔?對(duì)A549有一定的抑制活性,IC50值為13.45±0.54 μmol·L-1,但對(duì)其它幾種腫瘤細(xì)胞活性較弱,這可能為去氫樅酸與硫代苯甲酰胺通過(guò)酯鍵連接減弱了硫代苯甲酰胺釋放H2S的能力。因此,本文通過(guò)設(shè)計(jì)不同碳鏈將去氫樅酸與硫代苯甲酰胺偶聯(lián),研究碳鏈的長(zhǎng)度對(duì)細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)去氫樅酸與4-羥基硫代苯甲酰胺的碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)至5個(gè)碳時(shí)(化合物4c),可明顯增強(qiáng)對(duì)HepG2、 T24 和A549 的增殖抑制作用,IC50值分別為4.63±0.18、 6.06±0.49和5.79±0.14 μmol·L-1;碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)至6個(gè)碳時(shí),活性又略微下降。由此可推斷,抗腫瘤活性的提高與延長(zhǎng)分子長(zhǎng)度變化引起供體釋放H2S能力變化有關(guān),鏈接子以5個(gè)C為最佳,具體的作用機(jī)制仍有待后續(xù)研究加以確證。

表1 化合物的體外細(xì)胞毒性

本文利用前藥原理,合成了5個(gè)新型去氫樅酸-4-羥基硫代苯甲酰胺軛合物,細(xì)胞毒性結(jié)果表明:化合物4a對(duì)A549的IC50值為7.68±0.35 μmol·L-1,化合物4d對(duì)HepG2和MGC-803細(xì)胞株有較強(qiáng)的抑制活性,IC50值達(dá)到微摩爾水平,而活性最為顯著的是化合物4c,化合物4c對(duì)HepG2、 T24和A549細(xì)胞株的IC50值分別為4.63±0.18、 6.06±0.49和5.79±0.14 μmol·L-1,優(yōu)于或接近陽(yáng)性對(duì)照藥阿霉素。H2S供體4-羥基硫代苯甲酰胺的引入,可顯著提高母體化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制活性。