黃偉婷, 何露欣, 李世曉, 丘文樺, 趙 曦, 王戴妮, 龔曉璇, 梁遠(yuǎn)維*

(1. 廣東海洋大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,廣東 湛江 524088; 2. 遼寧省環(huán)保集團(tuán)科源環(huán)境技術(shù)有限公司,遼寧 沈陽 110161)

蒽類化合物是天然產(chǎn)物中一類比較重要的活性成分,主要分布在蓼科、鼠李科、茜草科、豆科、百合科和玄參科等高等植物中。蒽類化合物存在形式多樣,包括氧化蒽酚、蒽酚和蒽酮等[1]。許多蒽類衍生物具有不同的生理活性,主要表現(xiàn)為降血脂、利尿、抗氧化和抗腫瘤等,尤其是抗腫瘤方面表現(xiàn)出較大的潛力[2]。但由于蒽類衍生物種類繁多,活性參差不齊,很多情況下需通過原材料進(jìn)行分離提純,大大限制了蒽類化合物的應(yīng)用和開發(fā)。因此,對(duì)蒽類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,獲得理想活性的藥物,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

α,β-不飽和酮衍生物在天然產(chǎn)物和藥物分子中分布廣泛,由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,在合成化學(xué)領(lǐng)域有重要研究前景[3]。α,β-不飽和酮不僅是重要的有機(jī)合成中間體,廣泛應(yīng)用于化學(xué)和材料等領(lǐng)域,還具有顯著的生物藥理活性及獨(dú)特的可塑性結(jié)構(gòu),在抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗菌等方面有潛在應(yīng)用價(jià)值[4]。α,β-不飽和酮衍生物在抗腫瘤方面具有細(xì)胞毒性小,選擇性高的特點(diǎn)[5]。

氮芥類藥物是最早應(yīng)用于抗腫瘤作用的藥物之一,也是目前抗腫瘤藥用研發(fā)的重要方向之一。氮芥類藥物是一類高度活潑的基團(tuán),主要由氮芥部分和載體部分組成,在臨床上有廣泛的應(yīng)用[6]。氮芥部分是抗腫瘤藥的活性功能基團(tuán),載體部分主要影響藥物的物化性質(zhì),以及在體內(nèi)的吸收、分布等藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)[7]。雖然氮芥類藥物抗瘤譜廣、對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力強(qiáng),但仍存在生物利用度低、選擇性差且毒副作用大等缺點(diǎn)[8]。

目前,關(guān)于含氮芥和蒽環(huán)的α,β-不飽和酮衍生物的抗腫瘤藥物尚未見報(bào)道,本文擬將氮芥、蒽環(huán)和α,β-不飽和酮等3個(gè)單元進(jìn)行結(jié)合,合成含氮芥和蒽環(huán)的新型α,β-不飽和酮(1a和1b,圖1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)紫外、熒光光譜、質(zhì)譜和核磁共振等表征。通過MTT試驗(yàn)法檢測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)A549、 786-O、 Hela和MDA-MB-231等4種腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性,比較了2個(gè)化合物的活性,并進(jìn)一步探討化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移作用和對(duì)細(xì)胞周期的影響。

圖1 含氮芥和蒽環(huán)的α,β-不飽和酮的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BRUKER AVANCE 300/600 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo));Waters Xevo G2-XS Tof型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀;RF-6000型熒光分光光度計(jì);TU-1901型紫外可見分光光度計(jì);Thermo Multiskan FC型酶標(biāo)儀;Beckman Gallios型流式細(xì)胞儀。

所用試劑均為分析純(畢得醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 1a和1b的合成通法

將N,N-二甲基甲酰胺(9 mmol, 657 mg),三氯氧磷(5 mmol, 767 mg)和N,N-二羥乙基苯胺(2 mmol, 362 mg)加入圓底燒瓶中,加熱至90 ℃,反應(yīng)3 h。將液體倒入冰水中,用1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH≈7,過濾,濾餅依次用純水和冷乙醇洗滌兩次,真空干燥得中間體4-[雙-(2-氯乙基)氨基]苯甲醛(化合物2),淡黃色固體449 mg,產(chǎn)率 85%;1H NMR(300 MHz, DMSO-d6)δ: 9.72(s, 1H, CHO), 7.72(d,J=8.89 Hz, 2H, ArH), 6.90(d,J=8.89 Hz, 2H, ArH), 3.85(t,J=5.78Hz, 4H, CH2), 3.79(t,J=5.78 Hz, 4H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C11H14Cl2NO{[M+H]+}246.0452, found 246.0468。

將化合物2(1 mmol, 246 mg)、 9-乙酰蒽或2-乙酰蒽(1 mmol,220 mg)和堿催化劑(NaOH, K2CO3或三乙胺,1 mmol)加入乙醇(13 mL)中,反應(yīng)24 h。除去乙醇,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:CH2Cl2∶CH3OH=45 ∶1,V∶V)純化得目標(biāo)化合物1a和1b。

化合物1a:黃色固體368 mg,產(chǎn)率82%, m.p.127.6～128.6 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.73(s, 1H, ArH), 8.18(d,J=8.51Hz, 2H, ArH), 7.81(d,J=8.49 Hz, 2H, ArH), 7.57～7.52(m, 4H, ArH), 7.46(d,J=8.96 Hz, 2H, ArH), 7.22(d,J=16.07 Hz, 1H, CH), 7.05(d,J=16.07 Hz, 1H, CH), 6.73(d,J=8.96 Hz, 2H, ArH), 3.78(t,J=6.20 Hz, 4H, CH2), 3.72(t,J=6.20 Hz , 4H, CH2);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 198.96, 149.61, 148.52, 135.68, 131.58, 131.15, 129.15, 128.24, 128.06, 127.15, 126.09, 125.40, 124.88, 122.62 122.42, 52.12, 41.44; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H24Cl2NO{[M+H]+}448.1235, found 448.1234。

化合物1b: 黃色固體341 mg,產(chǎn)率76%, m.p.129.8～130.8 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.96(s, 1H, ArH), 8.72(s,1H, ArH), 8.31(d,J=8.70 Hz, 1H, ArH), 8.13(dd,J=8.17 Hz, 13.19 Hz, 2H, ArH), 7.94(d,J=6.80 Hz, 1H, ArH), 7.67(d,J=8.93 Hz, 2H, ArH), 7.64(dd,J=6.90 Hz, 8.62Hz, 1H, ArH), 7.62～7.56(m, 3H, ArH, CH), 7.39(d,J=15.61 Hz, 1H, CH), 6.94(d,J=8.97 Hz, 2H, ArH), 3.84(t,J=6.81 Hz, 4H, CH2), 3.78(t,J=6.11 Hz , 4H, CH2);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 194.49, 149.31, 146.34, 137.41, 132.22, 132.15, 131.89, 131.57, 131.46, 129.02, 128.33, 128.25, 127.81, 127.38, 126.65, 126.63, 124.91, 124.81, 123.26, 122.37, 112.44, 52.21, 41.51; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H24Cl2NO{[M+H]+}448.1235, found 448.1233。

1.3 體外抗增殖活性測(cè)試

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞(A549、 786-O、 Hela和MDA-MB-231)接種于96孔板(接種密度2×103cells/well)。待細(xì)胞貼壁后,每孔加入不同濃度的1a或1b(0、 1、 2、 4、 8、 16、 32和64 μM),于37 ℃孵育72 h,吸棄96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基,每孔加入25 μL MTT試劑,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h。MTT在活細(xì)胞內(nèi)被還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(λmax=570 nm),而死細(xì)胞無此功能,因此甲臜形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。用DMSO將其溶解后,通過酶標(biāo)儀讀取每孔OD570數(shù)值,計(jì)算不同濃度藥物處理后細(xì)胞的存活率[9]。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞接種于6孔板(4×105cells/well),待貼壁后,用槍頭在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域垂直劃線,碎片用PBS清洗并吸棄,添加培養(yǎng)基,加入不同濃度的化合物1a并孵育至設(shè)定的時(shí)間,吸棄培養(yǎng)基后加入Hoechst染料于37 ℃孵育染色30 min,用PBS清洗2次后,在倒置熒光顯微鏡下拍照[10]。

1.5 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中(1×106cells/well),貼壁后加入藥物,待藥物作用48 h后,將細(xì)胞消化收集于離心管,扣干,用PBS重懸1次再扣干,并用72%酒精固定溫度于4 ℃, 12 h后離心扣干,加入300 μL PI染色,避光孵育30 min。用尼龍網(wǎng)過濾后加入上機(jī)樣品管內(nèi),用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測(cè),得出細(xì)胞處于G1期,S期和G2/M期的比例[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成分析

含氮芥和蒽環(huán)的α,β-不飽和酮的合成路線見圖1,起始原料為N,N-二羥乙基苯胺,第一步反應(yīng)由POCl3和DMF組成的Vilsmeier-Haack試劑對(duì)苯環(huán)進(jìn)行甲?；磻?yīng)[12],該反應(yīng)為親電取代反應(yīng),過量的POCl3對(duì)2個(gè)羥基進(jìn)行氯化反應(yīng)得到化合物2。這里由于氮原子p軌道孤對(duì)電子與苯環(huán)形成p-π共軛,增大了苯環(huán)的電子云密度,活化了苯環(huán),因此該甲?；H電取代反應(yīng)較為容易進(jìn)行,產(chǎn)率也較高(85%)。第二步反應(yīng)為典型的羥醛縮合反應(yīng)[13],蒽環(huán)上的乙酰基先在堿的作用下生成碳負(fù)離子,接著進(jìn)攻醛基的碳原子,發(fā)生親核加成反應(yīng),得到的β-羥基酮進(jìn)一步脫水,生成α,β-不飽和酮,即為含氮芥和蒽環(huán)的α,β-不飽和酮1a和1b。反應(yīng)溫度為室溫,反應(yīng)時(shí)間為24 h。

羥醛縮合反應(yīng)是制備α,β-不飽和醛酮的重要方法[14]。為了比較不同的催化劑對(duì)產(chǎn)率的影響,選擇了3種堿(NaOH、 K2CO3和三乙胺)作為催化劑進(jìn)行篩選。其中強(qiáng)堿NaOH做催化劑時(shí)產(chǎn)率較高,1a和1b產(chǎn)率分別為82%和76%;而弱堿K2CO3催化時(shí)幾乎沒有產(chǎn)物生成,產(chǎn)率均小于1%;用有機(jī)堿三乙胺催化時(shí)產(chǎn)率也非常低,1a和1b產(chǎn)率僅有2%和3%，這是因?yàn)樾枰^強(qiáng)的堿才能將乙?；臍浒纬?而K2CO3和三乙胺較難撥氫,碳負(fù)離子難以生成,無法得到較多的產(chǎn)物。

表1 不同堿催化劑對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響

2.2 結(jié)構(gòu)表征分析

氫譜在化合物的表征中是必不可少的,下面對(duì)化合物1a的核磁共振氫譜進(jìn)行解析。圖2中δ8.73處為5號(hào)碳上的氫,單峰;δ8.18處為1號(hào)碳上的氫,受2號(hào)碳上的氫影響裂分為d峰,偶合常數(shù)為8.51 Hz;δ7.81處為4號(hào)碳上的氫,受3號(hào)碳影響裂分為d峰;δ7.57～7.52處為2號(hào)碳和3號(hào)碳上的氫(重疊);δ7.46處為8號(hào)碳上的氫受9號(hào)碳上的氫影響裂分為d峰,偶合常數(shù)為8.96 Hz;δ7.22處為7號(hào)碳上的氫裂分為d峰,偶合常數(shù)為16.07 Hz;δ7.05和6.74處分別為6號(hào)碳和9號(hào)碳上的氫,分別受7號(hào)碳和8號(hào)碳上的氫影響裂分為d峰;δ3.78和3.72處為10號(hào)和11號(hào)亞甲基的氫,各為三重峰。

圖2 化合物1a的核磁共振氫譜

λ/nm

紫外-可見光譜可有效表征化合物在紫外至可見光波段的吸收性能,熒光光譜則表征化合物在紫外或可見光照射下發(fā)射電磁波的性能。紫外光譜和熒光光譜在發(fā)光材料和染料等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用,能對(duì)化合物的發(fā)色團(tuán)提供很好的表征信息[15]。由于合成的化合物1a和1b具有較大的共軛體系,因此,其紫外最大吸收波長(zhǎng)和熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)會(huì)紅移?；衔?a和1b的紫外(實(shí)線)和熒光光譜(虛線)如圖3所示,1a在乙醇中的最大吸收波長(zhǎng)為396 nm;以396 nm為激發(fā)波長(zhǎng),測(cè)得熒光光譜的最大發(fā)射波長(zhǎng)為583 nm(圖3a)?；衔?b的最大吸收波長(zhǎng)為395 nm,熒光光譜的最大發(fā)射波長(zhǎng)為574 nm(圖3b)。從結(jié)構(gòu)上看,化合物1a和1b具有的最大吸收波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)主要?dú)w因于蒽環(huán)、α,β-不飽和酮和氮芥結(jié)構(gòu)p軌道電子的大共軛體系。

λ/nm圖3 化合物1a(a)和1b(b)在乙醇中的紫外吸收光譜(實(shí)線)和熒光光譜(虛線)

2.3 體外抗腫瘤活性

化合物1a和1b對(duì)A549、 786-O、 Hela和MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性見圖4,半抑制濃度(IC50, μM)見表2。由圖4和表2可知,2個(gè)化合物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制效果最好。其中1a對(duì)上述細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)為28.8 μM、 23.5 μM、 18.3 μM和27.1 μM。1b對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為33.4 μM、 27.1 μM、 24.9 μM和27.5 μM。以上結(jié)果證實(shí),2個(gè)化合物1a和1b對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好的抗增殖活性,并且化合物1a的抗增殖活性略優(yōu)于1b。

c/μM圖4 化合物1a和1b對(duì)腫瘤細(xì)胞A549、 786-O、 Hela和MDA-MB-231的抗增殖活性

2.4 化合物1a的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特性之一,很多腫瘤治療失敗的主要原因是因?yàn)檗D(zhuǎn)移。因此相對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移而言,預(yù)防比治療更重要。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以體現(xiàn)不同處理組的細(xì)胞遷移的能力。圖5a中僅經(jīng)過24 h,不加藥組的Hela細(xì)胞表現(xiàn)出非常強(qiáng)的遷移能力,而加藥組的細(xì)胞遷移則明顯受到抑制,并隨著濃度增加,抑制效果更為顯著,呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。對(duì)應(yīng)統(tǒng)計(jì)圖見圖5b,經(jīng)過24 h后,不加藥組的細(xì)胞相對(duì)遷移距離為49.5%。當(dāng)化合物1a加藥濃度分別為20 μM時(shí),相對(duì)遷移距離百分?jǐn)?shù)為74.6%,可知化合物1a明顯抑制了Hela細(xì)胞的遷移。當(dāng)濃度為40 μM時(shí),相對(duì)遷移距離百分?jǐn)?shù)為83.2%,Hela細(xì)胞的遷移進(jìn)一步被1a抑制。由以上結(jié)果可知,化合物1a可通過降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力來發(fā)揮抗腫瘤作用,具有很好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

表2 化合物1a和1b對(duì)腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度(IC50, μM)

2.5 化合物1a對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分布可以體現(xiàn)細(xì)胞每個(gè)時(shí)期的比例,進(jìn)而反應(yīng)藥物對(duì)周期的影響[16]。由圖6可知,S期的比例隨著加藥濃度的增加而增加。不加藥組的G1、 S和G2/M期的比例分別為54.1%, 30.8%和15.1%;當(dāng)1a濃度為20 μM時(shí),G1期的比例下降為20.9%。而S和G2/M期則分別升高到49.9%和29.2%;當(dāng)濃度上調(diào)到40 μM時(shí),G1期的比例進(jìn)一步下降到12.3%, S期的比例顯著升高到67.7%,而G2/M期的比例降低到20.0%。由此可知,S期的比例升高總體上呈濃度依賴關(guān)系,同時(shí)G1和G2/M期沒有明顯的增加,說明化合物1a能有效使Hela細(xì)胞阻滯于S期而發(fā)揮抗增殖作用。

DNA Content圖6 化合物1a對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

本文運(yùn)用Vilsmeier-Haack反應(yīng)和羥醛縮合反應(yīng),合成了2種含氮芥和蒽環(huán)的新型α,β-不飽和酮,兩步反應(yīng)都具有較高的產(chǎn)率。從體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:1a和1b具有良好的抗腫瘤活性,能有效地抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。其中,1a較1b的抗增殖活性稍強(qiáng)。1a具有優(yōu)異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用,并且通過使Hela細(xì)胞的周期阻滯在S期而發(fā)揮抗增殖作用。