任 杰，祖力皮喀爾·阿卜杜熱合曼，弓 慧，鐘雪梅，鄭愛(ài)芳，李 黎

(新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 新疆 喀什 844000)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種原因復(fù)雜的異質(zhì)性疾病[1]。SERPINA1是SERPINA家族成員，是編碼α1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin，AAT)的關(guān)鍵基因,AAT缺乏是與COPD有關(guān)的遺傳危險(xiǎn)因素[2]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，SERPINA1基因rs9944155可能與維吾爾族COPD的發(fā)病有關(guān)，SERPINE2基因rs16865390與喀什地區(qū)COPD易感性無(wú)明顯相關(guān)性。有研究報(bào)道，SERPINA1 rs8004738的單核苷酸多態(tài)性可增高人群COPD的患病風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，SERPINA1在COPD發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，目前關(guān)于COPD中miRNA與SERPINA1相互的靶向調(diào)控關(guān)系的研究報(bào)道較少，其機(jī)制尚不完全清楚。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1載體、菌種及細(xì)胞 DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根公司，293T細(xì)胞、人正常肺上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)購(gòu)自ATCC公司(貨號(hào)CRL-9609)。psiCHECK2載體和Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.1.2酶及主要試劑 總RNA提取試劑Trizol、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自Invitrogen公司；miRNA提取試劑盒(miRNeasy Mini Kit，217004)、miRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScript Ⅱ RT Kit，218161)均購(gòu)自QIAGEN公司；PCR TAQ酶、連接酶購(gòu)自TAKARA公司；膠回收和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司；點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自NEB公司Site-Directed Mutagenesis Kit。miR-320c-5p模擬物(mimics)由Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成。高糖DMEM、DMEM/F-12培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司，0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM和Lipofectamine 3000購(gòu)自Invitrogen公司；Prime Script RT-PCR Kit和SYBR Premix ExTaq Ⅱ均購(gòu)自TaKaRa公司。miR-320c-5p mimics及其陰性對(duì)照片段NC mimics購(gòu)自上海吉瑪生物科技公司產(chǎn)品；miRNA特異性引物和定量PCR引物購(gòu)自上海生工。

1.2方法

1.2.1COPD細(xì)胞模型的建立 CSE的制備，方法參照文獻(xiàn)[PRKN-regulated mitophagy and cellular senescence during COPD pathogenesis]。取一支香煙均速?gòu)难b有25 mL DMEM注射器中冒出，這種培養(yǎng)液定義為100% 濃度的香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)。每次100%CSE需要新鮮制備，并使用DMEM稀釋到最終工作濃度(濃度比10%)，在30 min內(nèi)使用。正常BEAS-2B當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到為80%～90% 時(shí)，用3% CSE處理24 h，即COPD細(xì)胞模型。后續(xù)進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)。

1.2.2Realtime RT-PCR檢測(cè)目標(biāo)microRNAs和SERPINA1基因表達(dá) 將人正常肺上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)和COPD細(xì)胞培養(yǎng)至48 h收集細(xì)胞。使用QIAGEN公司miRNeasy Mini Kit試劑盒提取細(xì)胞microRNAs，miScript Ⅱ RT Kit試劑盒進(jìn)行microRNAs轉(zhuǎn)錄。Trizol法提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD230、OD260值后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

SERPINA1基因引物，F(xiàn)：5′-GACACCGAAG-AGGCCAAGAA-3′；R:5′-TGGAAGTCCTCTTC-CTCGGT-3′(位置564～745，產(chǎn)物長(zhǎng)度182 bp)。MicroRNAs上游檢測(cè)引物(F)如下：MiR-26-5p:5′-TTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3′，MiR-320c-5p:5′-AAAAGCTGGGTTGAGAGG-3′，MiR-210-5p:5′-AGCCCCTGCCCACCGCAC-3′，MiR-96-3p:5′-AATCATGTGCAGTGCCAATATG-3′。

使用2△△CT法對(duì)SERPINA1 mRNA水平的表達(dá)進(jìn)行定量分析。結(jié)果分析時(shí)，獲得基因的CT值，取基因CT值與β-actin基因濃度值的比值作為基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3Luciferase報(bào)告基因載體構(gòu)建 取人正常肺上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)，使用酚氯仿抽提基因組DNA，設(shè)計(jì)引物使用TAQ酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增SERPINA1 基因3′UTR區(qū)域，使用Not1和 Xho1雙酶切PCR產(chǎn)物和psiCHECK載體后，T4連接酶進(jìn)行DNA連接反應(yīng)，熱激轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒。陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)記為SERPINA1-WT。以為SERPINA1 -WT質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，使用NEB公司 Site-Directed Mutagenesis Kit試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行MiR-320c-5p分子靶位點(diǎn)突變，突變后質(zhì)粒命名為SERPINA1-MT。

SERPINA1 基因3′UTR區(qū)域參照NCBI序列(NT_187601)，PCR擴(kuò)增引物如下，WT-F：5′-ATAACTGCCTCTCGCTCCTCAAC-3′；WT-R:5′-TGCAAGAAATGTAGTTCTA-3′(位置12 184～13 889，產(chǎn)物長(zhǎng)度1 705 bp)。點(diǎn)突變有兩對(duì)引物，序列如下，MT-F1：5′-ATAACTGCCTCTCGCTCC-TCAAC-3′；MT-R1：5′-GAATCCTCACGATAC-GGACCT-3′(斜體序列為MiR-320c-5p分子靶位點(diǎn)，下劃線為突變位點(diǎn)，原序列為GCT)；MT-F2：5′-AGGTCCGTATCG-TGAGGATTC-3′(斜體序列為MiR-320c-5p分子靶位點(diǎn)，下劃線為突變位點(diǎn))；MT-R2:5′-TGCAAGAAATGTAGTTCTA-3′。PCR擴(kuò)增采用如下體系：TaqDNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板2 μL(100 ng)，補(bǔ)水至25 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將293T細(xì)胞接種于6孔板中，密度為4×105個(gè)/孔，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，細(xì)胞融合度達(dá) 70%～80%進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)染。按照說(shuō)明書(shū)溶解miR-195模擬物以及陰性對(duì)照NC，濃度為20 μmol/L。在聚丙烯管里準(zhǔn)備Lipectamine 3000和DNA復(fù)合物：在聚丙烯管中加入0.5 mL預(yù)熱的Opti-MEM培養(yǎng)基，加入miR-195模擬物100 nM和SERPINA1-WT的野生型和SERPINA1-MT突變型質(zhì)粒2 μg，輕輕混勻后室溫放置10 min。在另一個(gè)管中加入0.5 mL預(yù)熱的Opti-MEM培養(yǎng)基，再加入8 μL Lipectamine 3000。輕輕混勻后室溫放置10 min。將上述稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合。混合物置于室溫孵育20 min。6 h后，移去脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物，在每個(gè)培養(yǎng)皿中重新加入2 mL新鮮的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)Luciferase報(bào)告基因活性。

1.2.5Luciferase報(bào)告基因檢測(cè) 選取轉(zhuǎn)染48 h后293T細(xì)胞，用 PBS 沖洗細(xì)胞3遍后，加入1×PLB裂解液500 μL，室溫下裂解15 min。4 ℃離心10 min，吸取上清液進(jìn)行檢測(cè)。將100 μL試劑盒中LAR Ⅱ液加入96 孔酶標(biāo)板中，將20 μL細(xì)胞溶解物轉(zhuǎn)移到含有100 μL LAR Ⅱ液的酶標(biāo)板中，吹打混勻。在多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)Firefly 熒光素酶讀數(shù)。加入100 μL Stop&GloReagent，短暫混勻后測(cè)定Renilla熒光素酶讀數(shù)。樣品的相對(duì)熒光素酶活性即為 Firefly/Renilla 熒光素酶讀數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，三組間采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13%CSE細(xì)胞中5個(gè)miRNA本底表達(dá)水平結(jié)果 在3%CSE細(xì)胞株中提取總RNA，應(yīng)用 RT-qPCR熒光定量方法分別對(duì)MicR-26-5p、MicR-320c-5p、MicR-210-5p、MicR-96-3p進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，用U6作為內(nèi)參，結(jié)果顯示MicR-320c-5p及MicR-96-3p的表達(dá)量明顯低于其他，表達(dá)值分別為0.48、0.45(P<0.05),SERPINA1mrna為 3.41表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，3%CSE中MicR-320c-5p、MicR-26-5p、MicR-210-5p、MicR-96-3p表達(dá)均下調(diào)，SERPINA1表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3%CSE細(xì)胞中5個(gè)miRNA本底表達(dá)水平結(jié)果Table 1 Results of background expression levels of five miRNAs in 3% CSE cells

2.2MicR-320c-5p與3′UTR的結(jié)合及突變位點(diǎn) 本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)MicR-320c-5p和SERPINA1的3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)構(gòu)建SERPINA1 3′UTR的突變位點(diǎn)，見(jiàn)表2。

表2 MicR-320c-5p與3′UTR的結(jié)合及突變位點(diǎn)Table 2 Binding and mutation sites of MicR-320c-5p and 3′UTR

2.3雙熒光素酶活性結(jié)果 為了進(jìn)一步驗(yàn)證micR-320c-5p是否調(diào)控SERPINA1-3′UTR中的表達(dá)，本研究將micR-320c-5p與野生型或突變型SERPINA1-3′UTR結(jié)合，然后將雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，使用mimic陰性對(duì)照作為對(duì)照組，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的發(fā)光。結(jié)果顯示，micR-320-5p mimic和SERPINA1野生型3′UTR構(gòu)建體的相對(duì)熒光素酶活性明顯下降，和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而在SERPINA1突變型3′UTR構(gòu)建體的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果表明，micR-320c-5p可以直接靶向SERPINA1的3′UTR序列，SERPINA1是miR-320c-5p的直接靶基因。

熒光素酶數(shù)值：SERPINA1-WT+NC 100%與SERPINA1-WT+miR-320 mimics 65.63%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(100.00±0.17)%vs.(65.63±0.41)%，P<0.001]；SERPINA1-MT+NC 95.21%與SERPINA1-MT+miR-320 mimics 95.81%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(95.21±0.23)%vs.(95.81±0.38)%，P>0.05]。

3 討 論

COPD基因多態(tài)性與環(huán)境因素共同增加疾病發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，其臨床表現(xiàn)和致病機(jī)制存在異質(zhì)性[4]。miRNA(MicroRNA)是18～24 kb大小的非編碼RNA，通過(guò)與mRNA的3′UTR結(jié)合來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增值，細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程[5]。研究顯示，miRNA在COPD中參與細(xì)胞通信，氣道上皮重塑和炎癥免疫等過(guò)程[6]。有研究表明，血液中miRNA-320家族表達(dá)下調(diào)，降低生存率，在COPD中miR-34c表達(dá)下調(diào)，負(fù)調(diào)控SERPINE1的表達(dá)[7]。抗胰蛋白酶缺乏癥(alpha-1 antitrypsin defificiency，AATd)可由SERPINA1的雙等位基因突變引起，是COPD發(fā)病的重要遺傳危險(xiǎn)因素，SERPINA1基因突變可增加COPD患病風(fēng)險(xiǎn)，其病理生理作用由表達(dá)、調(diào)控或轉(zhuǎn)錄后修飾的差異決定[8]。研究表明，醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase)NQO1可結(jié)合SERPINA1 3′UTR，NQO1可能與抑制SERPINA1mRNA翻譯的miRNA結(jié)合，促進(jìn)SERPINA1mRNA的翻譯，增強(qiáng)抗胰蛋白酶的表達(dá)(novel RNA-binding activity of NQO1 promotes SERPINA1 mRNA translation)[9]。NQO1對(duì)SERPINA1mRNA翻譯的影響是否由其他microRNA的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)尚不清楚。在TFEB基因轉(zhuǎn)移后，還檢測(cè)到SERPINA1mRNA和單體的顯著減少(autophagy master regulator TFEB inducesclearance of toxic SERPINA1/α-1-antitrypsin polymers)，SERPINA1表達(dá)降低是由于SERPINA1聚合物降解增加，進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB活化及白細(xì)胞介素6減少，激活的NF-κB和白細(xì)胞介素6均能促進(jìn)SERPINA1的轉(zhuǎn)錄。肝臟NF-κB活性降低可促進(jìn)SERPINA1基因表達(dá)及肝臟修復(fù)。miRNA通過(guò)與編碼區(qū)或非編碼區(qū)(非翻譯區(qū)3′UTR和5′UTR)中的靶mRNA序列互補(bǔ)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，這些非編碼RNA的表達(dá)改變已被證明與COPD發(fā)病及預(yù)后相關(guān)[10]。

既往研究顯示，在COPD患者中miRNA存在差異性表達(dá)，部分上調(diào)(miR-1246、miR-1258、miR-556-3p、miR-1468-5p、miR-126-5p和miR-130b-5p)部分下調(diào)(miR-182-3p、miR-497-5p和miR-492)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在3%CSE細(xì)胞中micR-320c-5p、micR-96-3p、micR-210-5p及micR-26-5p表達(dá)均降低(P<0.01)，有研究顯示，miR-210在COPD患者血漿中上調(diào)，可作為COPD的早期診斷標(biāo)志物[12]，本研究結(jié)果與之存在差異，同類研究顯示micR-320b在COPD存活和非存活患者之間存在明顯差異性高表達(dá)，與生存周期呈正相關(guān)，且在白細(xì)胞中表達(dá)，參與免疫調(diào)節(jié)，抑制與COPD相關(guān)的癌癥的發(fā)展[13]，本研究結(jié)果與之相符。

SERPINA1在呼吸系統(tǒng)疾病中的影響表現(xiàn)各異，依賴于其表達(dá)調(diào)控作用。本研究顯示，在3%CSE細(xì)胞中SERPINA1 mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)。SERPINA1基因的SNPrs8004738與中國(guó)人群中患COPD的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而關(guān)于SERPINA1與COPD的相關(guān)研究較少。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，SERPINA1 mRNA可增加體內(nèi)肺臟及肝臟SERPINA1蛋白的含量[14]，與本研究SERPINA1 mRNA在3%CSE細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)結(jié)果相符，進(jìn)一步佐證了SERPINA1 mRNA影響COPD的表達(dá)調(diào)控。

既往研究顯示，在肺囊性纖維化等相關(guān)肺部疾病中microRNAs可以結(jié)合同源序列來(lái)抑制靶向SERPINA1(A1AT編碼基因)mRNA的miRNAs的表達(dá)，為靶向治療提供替代策略[15]，而在COPD中缺乏相關(guān)研究，SERPINA1的表達(dá)上調(diào)與miR-320的表達(dá)下調(diào)是否存在靶向性的關(guān)系尚不明確，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-320-5p后的相對(duì)熒光素酶活性明顯下降，而SERPINA1-3′UTR突變后的熒光素酶活性無(wú)顯著下降(P>0.05)，結(jié)果表明micRNA-320c-5p與SERPINA1的3′UTR序列存在靶向性關(guān)系，負(fù)調(diào)控SERPINA1的表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用RT-qPCR發(fā)現(xiàn)miRNA在3%CSE中低表達(dá)，SERPINA1高表達(dá)，驗(yàn)證了micR-320c-5p可負(fù)調(diào)控SERPINA1的表達(dá)，為進(jìn)一步研究miRNA在COPD中發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提供治療方向。但對(duì)MicR-320c-5p如何調(diào)節(jié)SERPINA1的表達(dá)及是否受相應(yīng)炎癥因子調(diào)節(jié)通路的影響，有待進(jìn)一步的探究，目前仍缺乏COPD中miRNA的綜合性研究，可為COPD的治療策略提供新的治療靶點(diǎn)和方向。