邢淑榮，劉爽，張悅，邱琦，徐紅丹，，3?

（1.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校，江蘇 無錫 214028）

據世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計［1］，全球抑郁癥患者超過3.5億。截至2017年，中國超過5 400萬人患有抑郁癥，其中女性發(fā)病率為65%，多發(fā)生于絕經期，嚴重損害其身心健康［2］。雌激素撤退被認為是導致女性抑郁癥發(fā)病的主要內因。因此，雌激素替代療法（estrogen replacement therapy， ERT）是臨床主要的治療方案，但因其應用有嚴格的時間窗限制，只能在圍絕經期或絕經早期應用，并保持一定的雌激素水平才會對認知功能起到保護作用。而在女性絕經期，雌激素分泌急劇下降，ERT將不能發(fā)揮治療作用［3-4］。中醫(yī)學認為，腎陰虛而心火上炎是更年期抑郁癥的主要發(fā)病機制，治療更年期抑郁癥的關鍵在于補腎［5］。引火湯出自陳士鐸《辨證錄》，原方組成為熟地黃、巴戟天、麥冬、茯苓、五味子，具有滋補腎陰、引火歸元的功效［6］。本課題組前期對引火湯治療更年期抑郁癥的研究發(fā)現(xiàn)，引火湯可顯著改善雙側卵巢摘除（bilateral ovariectomies， OVX）小鼠術后1周的體質量、睡眠，修飾攻擊樣行為，并有神經細胞保護作用［7-8］。然而，引火湯是否存在與ERT相同的治療窗口期限制，仍是需要研究的科學問題。本研究采用雙側卵巢摘除（OVX）聯(lián)合慢性不可預知性溫和應激刺激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）的方法模擬雌激素剝奪性抑郁癥，觀察引火湯對長期和短期OVX小鼠抑郁焦慮樣行為的治療作用，并與雌二醇（E2）做對比。

1 材料

1.1 實驗動物

16周齡雌性ICR品系小鼠80只，體質量20～25 g，購自于黑龍江中醫(yī)藥大學GLP實驗中心，合格證號：SCXK（黑）2013－0004。將小鼠飼養(yǎng)于清潔級動物室，給予適宜溫、濕度（22～24 ℃，50%～60%），自然光源，12 h明暗交替，自由給水進食。為使小鼠適應環(huán)境，在實驗開始之前適應性飼養(yǎng)1周，本研究經黑龍江中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，批準號：2018121103。

1.2 實驗試劑

引火湯由熟地黃、巴戟天、茯苓、麥冬及北五味子組成（購于北京同仁堂哈爾濱連鎖藥店）；補佳樂（戊酸雌二醇片，批號：214A劑，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）；青霉素鈉粉（批號：15040312－2，哈藥集團制藥總廠）。

2 方法

2.1 實驗分組

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為長期和短期OVX小鼠，再各分為4組，分別為假手術組（Sham組）、模型組（OVX組）、陽性藥組（E2組）和引火湯組（YHT組），每組各10只，短期OVX 4組小鼠在術后第1周開始給予慢性不可預知性溫和應激刺激（CUMS）并同時給藥，為期3周。長期OVX4組小鼠在術后第8周開始CUMS和給藥，為期3周。

2.2 雙側卵巢摘除術

將小鼠用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉后進行OVX手術。小鼠置俯臥位，在背部大腿根部內側斜上0.5 cm處剪毛、消毒皮膚，剪開皮膚并鈍性撕開肌層，尋找并結扎子宮，止血后剝離菜花狀卵巢并將其摘除，依次縫合肌層及皮膚切口，涂少許青霉素鈉粉防感染。同法摘取另一側卵巢。Sham組暴露卵巢后，摘取同體積的脂肪，回納卵巢。

2.3 陰道涂片

OVX術后，通過陰道涂片觀察脫落細胞組成及形態(tài)來判斷OVX手術是否成功。具體方法為OVX術后第5～8天，每日上午9∶00取各組小鼠陰道分泌物涂于載玻片上，晾干后進行HE染色。

2.4 慢性不可預知性溫和應激刺激（CUMS）

長期和短期OVX各組小鼠在實驗計劃時間內進行CUMS刺激。CUMS方法為，每天在下列7種軀體刺激中隨機選取一種對小鼠進行刺激，包括斷食24 h、斷水24 h、潮濕墊料、傾斜鼠籠、搖晃鼠籠、黑白顛倒和超聲刺激20 min，同種刺激1周內不重復出現(xiàn)，連續(xù)3周。

2.5 給藥劑量及方法

長期和短期OVX小鼠CUMS刺激同時給藥，陽性藥組（E2組）給予戊酸雌二醇片，給藥量為0.13 mg/kg，濃度為0.013 mg/mL；引火湯組（YHT組）給藥量為23.4 mg/kg，濃度2.34 g/mL。每日灌胃體積為0.1 mL/10 g體質量，假手術組（Sham 組）和 引火湯組（OVX 組）給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥3周。

引火湯組方：熟地黃15 g，麥冬10 g，茯苓5 g和五味子5 g。8倍水浸泡生藥2 h，水煎1 h，收集濾液，藥渣加入等量水繼續(xù)煎煮1 h，過濾后合并兩次煎煮所得濾液，在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至2.34 g/mL，置4 ℃冰箱備用。

2.6 行為學檢測方法

長期和短期OVX各組小鼠均在給藥3周后進行行為學測試。

2.6.1 強迫游泳實驗（forced swimming test， FST）

將小鼠被迫放在直徑10 cm容器中，水溫20～25 ℃。水面高度以小鼠后爪不著地且頭部剛好露出水面為準。每只小鼠測試完后換水，排除排泄物對受試小鼠的影響。實驗環(huán)境保持安靜，記錄各組小鼠入水6 min后出現(xiàn)4 min的不動時間。

2.6.2 懸尾實驗（tail suspension test， TST）

將小鼠置于獨立操作箱內，用膠帶將其尾部距末端約1 cm 處固定于箱內支架上，頭部朝下距離地面20 cm，使小鼠周圍無攀爬的地方。每只小鼠測試完清理糞便，保持環(huán)境安靜。記錄各組小鼠懸尾狀態(tài)6 min 后出現(xiàn) 4 min的不動時間。

2.6.3 高架十字迷宮實驗（elevetated plus maze，EPM）

EPM設備由兩只相對開放臂和閉合臂，以及交叉區(qū)的中央平臺組成，距離地面高50 cm。將小鼠放置中央平臺，背對操作者面向開放臂。每只小鼠測試完畢，95%酒精擦拭 EPM 設備，保持環(huán)境安靜。記錄各組小鼠5 min內開放臂停留時間百分比（OAT）和開放臂進入次數百分比（OAE）。

2.7 數據分析及圖像處理

HE染色圖采用Image－pro－Plus（IPP）6.0軟件進行分析。采用SPSS19.0軟件進行數據的統(tǒng)計分析，數據以均數 ± 標準差（±s）表示。符合正態(tài)分布且總體方差齊的數據采用單因素方差分析（ANOVA），組間均數兩兩比較應用最小顯著性差異法（LSD）檢驗，應用SNK進行統(tǒng)計后校正；方差不齊的數據采用 Tamhane's T2 法進行組間比較。P＜ 0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 陰道涂片檢查結果

正常小鼠陰道細胞種類及特點隨著性周期的變化呈現(xiàn)出動情前期、動情期、動情后期和動情間期的周期性變化。陰道涂片結果顯示，OVX組小鼠陰道細胞周期性變化消失，持續(xù)處于動情間期，特點為大量的白細胞伴有少量的上皮細胞。Sham組小鼠陰道細胞則出現(xiàn)典型的周期性變化。結果見圖1，其中圖1A可見上皮細胞完整；圖1B可見大量角化細胞且密集成片分布；圖1C可見大量白細胞伴隨角化細胞；圖1D可見白細胞伴少數有核上皮細胞。

圖1 小鼠不同時期陰道涂片（HE染色，×400）

3.2 各組小鼠不同時期FST、TST水平比較

與Sham組比較，短期OVX組小鼠在FST、TST實驗中的不動時間均顯著增加（P＜ 0.001），說明OVX導致的雌激素剝奪狀態(tài)可誘發(fā)明顯的抑郁樣狀態(tài)。與短期OVX組比較，YHT組、E2組小鼠在FST、TST測試中不動時間均顯著減少（P＜ 0.001）。與Sham組比較，長期OVX組小鼠在FST、TST實驗中的不動時間均顯著增加（P＜ 0.001）；與OVX組比較，長期YHT組在FST、TST測試中的不動時間均顯著減少（P＜ 0.01）；與E2組比較，差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組小鼠不同時期FST、TST情況比較（ ± s，%）

表1 各組小鼠不同時期FST、TST情況比較（ ± s，%）

注：與Sham組比較，***P ＜ 0.001， 與OVX組比較，##P ＜ 0.01， ###P ＜ 0.001。

組別短期長期TST 74．37 ± 15.26 141.81 ± 18.89***124.64 ± 23.64 67.35 ± 15.43##Sham組OVX組E2組YHT組FST 23.02 ± 7.47 159.42 ± 50.37***69.86 ± 7.65###65.32 ± 7.96###TST 59.67 ± 11.54 131.05 ± 19.00***55.23 ± 7.42###46.75 ± 17.08###FST 70.97 ± 9.81 160.32 ± 40.04***140.62 ± 20.12 74.67 ± 30.89##

3.3 各組小鼠不同時期OAT、OAE情況比較

高架十字迷宮（EPM）實驗顯示，與Sham組比較，短期OVX組小鼠在EPM實驗的開放臂停留時間百分比（OAT）、開放臂進入次數百分比（OAE）均顯著減少（P＜ 0.01），說明OVX導致的雌激素剝奪狀態(tài)可誘發(fā)明顯的抑郁樣狀態(tài)。與OVX組比較，短期YHT組、E2組小鼠OAT和OAE均顯著增加（P＜ 0.01）。與Sham組比較，長期OVX組小鼠的開放臂停留時間百分比、開放臂進入次數百分比均顯著減少（P＜ 0.01）；與OVX組比較，長期YHT組小鼠OAT和OAE均顯著增加（P＜ 0.01）；與E2組比較，差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 引火湯對長短期OVX小鼠在EPM實驗中各指標的影響（ ± s，%）

表2 引火湯對長短期OVX小鼠在EPM實驗中各指標的影響（ ± s，%）

注：與Sham組比較，**P ＜ 0.01；與OVX組比較，##P ＜ 0.01。

短期長期組別OAE 51.32 ± 6.82 31.83 ± 4.16**31.67 ± 7.38 44.74 ± 4.95##Sham組OVX組E2組YHT組OAT 24.74 ± 4.41 12.14 ± 3.03**25.18 ± 6.57##22.23 ± 4.01##OAE 52.00 ± 6.05 35.87 ± 6.05**51.74 ± 7.80##52.87 ± 7.53##OAT 26.04 ± 5.27 12.63 ± 3.56**14.88 ± 2.18 22.45 ± 5.04##

4 討論

目前關于更年期抑郁癥的神經生物學的發(fā)病機制尚不明確，但大量研究表明，E2撤退是更年期抑郁癥發(fā)作的重要原因。因此，ERT是臨床治療抑郁癥最常用的方法［9］。但是，長期補充外源性雌激素會有患子宮內膜癌、卵巢癌等生殖系統(tǒng)疾病，甚至胰腺炎、非小細胞肺癌、腦卒中等非生殖系統(tǒng)疾病的風險［10-13］。而且，ERT存在“關鍵窗口期”的限制，BRINTON［14］提出，在圍絕經期使用雌激素，有利于防止和延緩認知功能的下降；相反，在絕經期，使用雌激素會加劇神經退行性改變。膽堿能神經元既表達雌二醇受體（ER），又表達多個神經營養(yǎng)因子及其受體。雌激素可通過ER與神經營養(yǎng)因子相互調節(jié)對神經元起營養(yǎng)支持作用［4］。據報道，海馬膽堿能受損是導致甚至加劇認知功能損傷的重要原因［15］。WINK等［16］認為，隨著年齡的增長，海馬的完整性會受損，圍絕經期女性的膽堿能輸入相對完整，海馬對膽堿輸入的反應也更敏感，而絕經期女性海馬中膽堿能的輸入受損，可能是造成上述結果的原因。

引火湯方中熟地黃填精補髓，滋腎水之涸；巴戟天補腎助陽，引火歸元；北五味子能收降浮火，補養(yǎng)腎陰［17］。陳士鐸認為，人之神志活動寓于心腎相交，即“心氣通于腎，而夜能安；腎氣通于心，而日亦安也”［6］?？梢?，引火湯治療更年期抑郁癥具有獨特優(yōu)勢，且在改善認知障礙、情志失衡等精神癥狀方面效果居佳。

本研究采用OVX聯(lián)合CUMS方法復制更年期抑郁癥模型，HE染色顯示OVX小鼠陰道大量白細胞脫落伴有少量的上皮細胞，其細胞周期性變化消失持續(xù)處于動情間期，表明OVX手術造模成功。強迫游泳及懸尾實驗可通過動物的行為絕望水平評估實驗動物的抑郁樣行為，高架十字迷宮通過動物對新環(huán)境的探究和對高懸開放臂的恐懼形成矛盾沖突的狀態(tài)，來反映動物焦慮樣行為。本研究經強迫游泳、懸尾、高架十字迷宮等行為學檢測得出，E2可改善短期OVX小鼠的抑郁樣行為，對長期OVX小鼠的抑郁焦慮樣行為無改善作用，該結果與雌激素的使用存在“關鍵窗口期” 的觀點不謀而合。而引火湯對長期和短期OVX小鼠的抑郁樣行為都有改善作用，由此可知，引火湯對OVX小鼠可持續(xù)發(fā)揮抗焦慮抑郁樣作用，并且不受“關鍵窗口期”的限制。

綜上所述，引火湯與ERT療法比較，不受“關鍵窗口期”的限制，可持續(xù)發(fā)揮抗焦慮抑郁樣作用。筆者將對引火湯改善長期OVX小鼠的抑郁行為的具體作用機制進行深入研究，為引火湯治療絕經期抑郁癥提供有效的實驗依據。