蔡猛，張永寧

（1.駐馬店市中心醫(yī)院，河南 駐馬店 463000；2.黃淮學院醫(yī)學院，河南 駐馬店 463000）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是臨床上常見的一種老年慢性疾病，主要表現(xiàn)為關節(jié)軟骨變性及關節(jié)周圍骨質增生［1］。有學者認為，關節(jié)軟骨異常炎癥反應是導致OA軟骨組織病變重要原因之一［2］。細胞焦亡是一種新的炎癥性細胞死亡，能夠誘導炎癥級聯(lián)放大反應，與OA的發(fā)生、發(fā)展密切相關。細胞焦亡中以Caspase－1介導的經典型細胞焦亡在OA中被廣泛性研究［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，在OA大鼠模型中軟骨組織焦亡相關蛋白Caspase－1、IL－1β、IL－18蛋白表達顯著升高，細胞焦亡指數增加，而抑制細胞焦亡能夠改善OA軟骨組織損傷［5］。因此，以OA軟骨細胞焦亡的角度研究藥物作用機制具有重要意義。

三七總皂苷（total saponins of panax notoginseseng，PNS）是三七的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等生物活性［6］。已有研究報道，PNS能夠降低炎癥因子釋放，降低軟骨組織炎癥反應，改善OA軟骨損傷［7-8］。但是目前有關PNS對OA軟骨損傷的具體作用機制尚未完全闡明。本研究將基于TLR4/NLRP3/Caspase－1信號通路傳導機制，擬通過構建OA大鼠模型探究PNS對OA軟骨細胞焦亡的影響及可能的分子作用機制，以期為臨床合理應用提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，4～6周齡，體質量（200 ±15）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（京）2019－0017］，適應性喂養(yǎng)1周，自由飲水，晝夜交替光照，溫度維持在20～25 ℃，相對濕度60%～70%。動物實驗符合3R原則，且通過駐馬店市中心醫(yī)院動物實驗倫理審查（批件號：20201002）。

1.1.2 藥品與主要試劑

三七總皂苷（成都埃法生物科技有限公司，質量分數90%，批號：AF20033002）；塞來昔布（輝瑞制藥有限公司，規(guī)格：200 mg/粒，國藥準字J20140072）；二辛可酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、蘇木素－伊紅（hematoxylin and eosin staining，HE）染色試劑盒、阿爾新藍－核固紅染色試劑盒、原位末端標記（TUNEL）染色檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為P0012S、ST023、C0105S、C0153S、C1091）；番紅O染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：293342）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：SP－9001）；TLR4一抗、NLRP3一抗、Caspase－1一抗、IL－1β一抗、IL－18一抗（美國Cell Signaling Technology公司，批號分別為14358、13158、24232、12703、57058）。

1.1.3 主要儀器

多功能酶標儀（長春樂鏷科技有限公司，型號：LP－5117）；熒光倒置顯微鏡（日本/奧林巴斯Olympus，型號：CKX53）；高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司，型號：H3－18KR）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio－Rad伯樂公司，型號：Gel Doc XR+）；電子壓痛儀（天津諾雷信達科技有限公司，型號：YLS－3E）；足底熱測痛儀（美國IITC公司，型號：HBS－1096A）。

1.2 方法

1.2.1 動物造模、分組及給藥

采用改良的Hulth法［9］構建OA大鼠模型。大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，取左膝關節(jié)為術側，沿左膝關節(jié)內側剪開皮膚，充分暴露膝關節(jié)腔，切斷內側副韌帶、前交叉副韌帶，并摘除半月板，外科縫合線將創(chuàng)口縫合，期間操作避免損傷軟骨組織。術后大鼠腹腔注射青霉素（20萬U/d），連續(xù)3 d，預防感染。關節(jié)炎癥指數 ≥ 4分，可視為造模成功。假手術組（Sham組）大鼠僅行剪開皮膚，暴露關節(jié)腔。SD大鼠隨機分為Sham組，模型組（Model），三七總皂苷低、高劑量組（PNS－L、PNS－H）和陽性對照藥塞來昔布組（Celecoxib），每組各10只。按照大鼠和人體等效劑量換算以及文獻［10］中的干預劑量，PNS－L組和PNS－H組大鼠分別給予50、200 mg/kg PNS灌胃，1次/d，連續(xù)8周。Celecoxib組大鼠給予24 mg/kg Celecoxib灌胃，1次/d，連續(xù)8周。Sham組和Model組大鼠均給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)8周。

1.2.2 軟骨組織病理學染色

①末次給藥結束后，各組大鼠同時處死，觀察膝關節(jié)軟骨組織形態(tài)，并剪取相同部分的軟骨組織，采用4%的多聚甲醛固定組織24 h，室溫條件下將膝關節(jié)標本經EDTA溶液脫鈣處理，期間脫鈣溶液每3 d更換1次，脫鈣時長為1個月，直至軟骨組織足夠柔軟，然后對處理后的組織標本進行石蠟包埋、切片，切片厚度3～5 μm，軟骨組織切片后進行HE染色觀察病理形態(tài)變化，利用Mankin's評分表［11］對大鼠軟骨組織病理損傷進行評分，Mankin's分值越高表示軟骨組織損傷程度越嚴重；②番紅O染色切片制作同HE，之后按照試劑盒檢測說明書進行番紅O染色；③阿爾新藍染色切片制作同HE，之后按照試劑盒說明書進行阿爾新藍染色，鏡下觀察軟骨組織，并拍照。

1.2.3 大鼠壓痛閾值及熱痛閾值測定

給藥8周后，圓筒固定大鼠，利用電子壓痛儀壓向大鼠患處后側足背，當大鼠發(fā)出掙扎或是鳴叫時測定的壓力值即為壓痛閾值；將大鼠放置于透明的玻璃箱內，并將足底熱測儀放置于大鼠患處足底，設置時間為20 s，溫度為30 ℃，之后打開計時器，直至大鼠發(fā)出鳴叫或是抬腿回縮時所用時間即為熱痛閾值。以上測試指標每只大鼠測定3次，取平均值為最終結果。

1.2.4 TUNEL染色檢測軟骨細胞焦亡

組織固定、切片制作過程同HE染色。按照TUNEL染色試劑盒進行染色，通過光學顯微鏡下觀察并計數TUNEL陽性細胞數。其中TUNEL陽性細胞核呈亮綠色，軟骨細胞核呈藍色。每張切片隨機選取6個視野，計算TUNEL陽性細胞率，即軟骨細胞焦亡率。

TUNEL陽性細胞率（%）=TUNEL陽性細胞數/總細胞數×100%

1.2.5 免疫組化法檢測TLR4、NLRP3、Caspase－1陽性細胞表達

按照“1.2.2”取各組大鼠軟骨組織切片，經3%H2O2溶液孵育10 min，85 ℃抗原修復，加10% BSA溶液封閉20 min；加TLR4、NLRP3、Caspase－1抗體（工作液體積稀釋比例為1∶200），4 ℃孵育過夜；加對應辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育30 min；滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液，沖洗切片后進行蘇木素軟骨細胞核染色，于200倍視野下隨機選取6個視野進行觀察，拍照，利用Image J軟件進行免疫組化陽性細胞比率評估TLR4、NLRP3和Caspase－1的表達。

1.2.6 Western blot檢測TLR4/NLRP3/Caspase－1信號通路相關蛋白表達

給藥8周后，立即將大鼠處死，剪取大鼠膝關節(jié)軟骨組織并提取總蛋白，按照1∶5質量與體積比加入細胞裂解液，于4 ℃條件下裂解40 min；BCA法測定各組大鼠軟骨組織蛋白質濃度；蛋白上樣（按照每孔上樣量30 μg計算得出上樣體積）；凝膠電泳；濕轉法轉膜；5%BSA室溫封閉2 h；分別加TLR4抗體（1∶1 000）、NLRP3抗體（1∶1 000）、Caspase－1抗體（1∶1 000）、IL－1β抗體（1∶1 000）、IL－18抗體（1∶1 000）及β－actin抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜；加對應的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫孵育1～2 h；TBST洗滌3次，每次5 min，滴加顯影液，顯影并拍照。

1.2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。所有實驗結果以均數 ± 標準差（±s）表示，多組間比較采用多因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜ 0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠軟骨組織病理學的比較

HE染色、番紅O染色和阿爾新藍染色顯示，Sham組大鼠膝關節(jié)軟骨組織結構完整，層次清晰，軟骨細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，無明顯纖維化。Model組大鼠軟骨組織退變嚴重，表面有嚴重纖維化，軟骨結構完全被破壞，軟骨細胞萎縮，層次雜亂，軟骨細胞外基質降解明顯，呈現(xiàn)典型的OA病理損傷改變。相比于Model組大鼠，PNS各劑量組大鼠和Celecoxib組大鼠軟骨細胞形態(tài)較為正常，膝關節(jié)退變程度減輕，細胞外基質染色較深，軟骨表面纖維化程度減少，OA病理損傷有一定改善。見圖1。

圖1 各組大鼠軟骨組織病理學染色（HE，× 200）

2.2 各組大鼠病理Mankin's評分的比較

與Sham組相比，Model組大鼠Mankin's評分顯著增加（P＜ 0.01）。與Model組相比，PNS各劑量組大鼠Mankin's評分顯著降低（P＜ 0.05或P＜ 0.01）。見表1。

表1 各組大鼠病理損傷程度Mankin's評分比較（ ± s）

表1 各組大鼠病理損傷程度Mankin's評分比較（ ± s）

注：與Sham組相比，**P ＜ 0.01；與Model組相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

組別Sham組Model組PNS－L組PNS－H組Celecoxib組Mankin's評分（分）1.02 ± 0.18 9.87 ± 2.10**7.61 ± 1.52#4.00 ± 1.21##3.45 ± 1.02##n 劑量（mg/kg）10 10 10 10 10－－5 0 200 24

2.3 各組大鼠壓痛閾值及熱痛閾值的比較

與Sham組相比，Model組大鼠壓痛閾值和熱痛閾值均顯著降低（P＜ 0.01）。與Model組相比，PNS各劑量組大鼠壓痛閾值和熱痛閾值均顯著增加（P＜ 0.05或P＜ 0.01）。見表2。

表2 各組大鼠壓痛閾值及熱痛閾值比較（ ± s）

表2 各組大鼠壓痛閾值及熱痛閾值比較（ ± s）

注：與Sham組相比，**P ＜ 0.01；與Model組相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

組別Sham組Model組PNS－L組PNS－H組Celecoxib組熱痛閾值（s）9.81 ± 1.01 5.32 ± 0.65**6.25 ± 1.02#8.32 ± 0.51##9.01 ± 0.76##n 劑量（mg/kg）10 10 10 10 10——5 0 200 24壓痛閾值（g）510.32 ± 18.72 321.71 ± 19.01**417.95 ± 22.32##463.20 ± 20.11##487.57 ± 18.01##

2.4 各組大鼠軟骨細胞焦亡的比較

TUNEL染色顯示，與Sham組相比，Model組大鼠軟骨細胞焦亡率顯著增加（P＜ 0.01）。與Model組相比，PNS各劑量組大鼠軟骨細胞焦亡率顯著降低（P＜0.05或P＜ 0.01）。見表3、圖2。

圖2 各組大鼠軟骨細胞焦亡情況比較（TUNEL，× 200）

表3 各組大鼠軟骨細胞焦亡率比較（ ± s）

表3 各組大鼠軟骨細胞焦亡率比較（ ± s）

注：與Sham組相比，**P ＜ 0.01；與Model組相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

組別Sham組Model組PNS-L組PNS-H組Celecoxib組細胞焦亡率（%）5.24 ± 1.80 30.85 ± 6.31**24.48 ± 5.12#14.77 ± 3.26##12.92 ± 3.61##n 劑量（mg/kg）10 10 10 10 10——5 0 200 24

2.5 各組大鼠軟骨組織TLR4/NLRP3/Caspase－1信號通路相關蛋白的比較

免疫組化檢測顯示，與Sham組相比，Model組大鼠軟骨細胞TLR4、NLRP3、Caspase－1陽性細胞率顯著增加（P＜ 0.01）。與Model組相比，PNS各劑量大鼠軟骨細胞TLR4、NLRP3、Caspase－1陽性細胞率顯著降低（P＜ 0.05或P＜ 0.01）。見圖3。Western blot檢測信號通路相關蛋白表達。結果顯示，與Sham組相比，Model組大鼠軟骨組織TLR4、NLRP3、Caspase－1、IL－1β、IL－18蛋白表達均顯著增加（P＜ 0.01）。與Model組相比，PNS各劑量組大鼠軟骨組織TLR4、NLRP3、Caspase－1、IL－1β、IL－18蛋白表達均顯著降低（P＜ 0.05或P＜0.01）。見圖4。

圖3 免疫組化法檢測各組大鼠軟骨細胞TLR4、NLRP3、Caspase－1 p20陽性細胞表達率

圖4 Western blot檢測各組大鼠軟骨組織TLR4/NLRP3/Caspase－1信號通路相關蛋白表達

3 討論

OA已經成為骨關節(jié)外科常見疾病之一，是導致關節(jié)慢性疼痛的主要原因。預計到2030年，美國及歐洲國家OA的患病率將高達20%［12］。因此，積極探尋有效藥物干預治療OA尤為重要。目前臨床上常用治療OA藥物主要有甾體類及非甾體類抗炎藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥和解熱鎮(zhèn)痛藥等［13］。上述臨床常用治療藥物在緩解OA疼痛癥狀中表現(xiàn)出良好的療效，但是對OA炎癥性退變進程無明顯作用。

中醫(yī)藥在治療OA中具有不良反應少、藥效作用緩和、多靶點等明顯優(yōu)勢［14］。OA可歸于寒濕阻痹證或痹證中營衛(wèi)不和等范疇，瘀血可致痹證，對痹證久者予以活血化瘀藥治之［15］。OA患者不同階段，涉及眾多臟器，如肝、脾、腎等，但血瘀貫穿疾病始終，故活血化瘀治療OA為根本大法［16］。PNS來源于三七的根莖和根部，具有消腫止痛、散瘀止血等功效［17］。研究發(fā)現(xiàn)PNS能夠改善OA軟骨損傷，其機制與抑制組織炎癥反應，降低軟骨細胞凋亡，促進細胞增殖密切相關［10］。本研究通過Hulth法構建OA模型，觀察PNS對OA大鼠軟骨損傷的影響。結果顯示，PNS能夠降低Mankin's評分，增加壓痛閾值和熱痛閾值，改善OA大鼠軟骨損傷，初步表明PNS具有治療OA功效。但是目前有關PNS治療OA的具體分子機制尚不清楚，炎癥和細胞死亡是OA的兩個主要特征［18］。研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡是繼凋亡和炎癥性壞死后的一種新的細胞死亡方式，廣泛參與了多種炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展，如膿毒癥、急性肺損傷及OA等［19-21］。細胞焦亡可分為Caspase－1介導的經典細胞焦亡和Caspase－4/5/11介導的非經典型細胞焦亡。既往研究發(fā)現(xiàn)，在OA大鼠軟骨組織中細胞焦亡指數明顯增加，焦亡相關蛋白Caspase－1、IL－1β和IL－18表達均明顯增加，而采用Caspase－1抑制劑處理后能夠明顯改善OA大鼠軟骨損傷［22］。眾多研究已證實PNS抗炎、抗氧化等作用，并能夠減輕缺氧缺糖/復氧復糖誘導的神經細胞焦亡［23］。基于以上研究筆者推測PNS可能通過抑制細胞焦亡，改善OA軟骨損傷。本研究通過TUNEL染色檢測軟骨細胞焦亡情況。結果顯示，與Sham組相比，Model組大鼠軟骨細胞焦亡指數明顯增加；與Model組相比，PNS各劑量組大鼠軟骨細胞焦亡指數明顯降低。可見，PNS能夠通過降低軟骨細胞焦亡，改善OA軟骨損傷。

Toll受體4（Toll receptor 4，TLR4）是一種模式識別受體，能夠通過識別并結合內源性分子激活先天性免疫應答反應。經配體刺激TLR4，導致核轉錄因子－κB（nuclear transcription factor－κB，NF－κB）激活并磷酸化入核，從而啟動NOD樣蛋白受體3（NOD－like protein receptor 3，NLRP3）炎癥小體活化，激活并促進炎癥因子釋放，對炎癥反應過程發(fā)揮重要作用［24］。NLRP3作為Caspase－1介導細胞焦亡的關鍵調控蛋白。當NLRP3被激活時會促進NLRP3炎癥小體組裝形成復合物，繼而激活Caspase－1，促進炎癥因子IL－1β和IL－18表達，誘導細胞焦亡［25］。既往研究發(fā)現(xiàn)，在OA大鼠軟骨組織中TLR4、NLRP3蛋白表達明顯增加，而抑制TLR4信號傳導能夠明顯降低NLRP3表達，從而降低組織炎癥反應，改善OA損傷［26-27］。因此，以TLR4/NLRP3/Caspase－1信號通路為傳導途徑的細胞焦亡機制研究可能是OA疾病發(fā)生和發(fā)展中的又一重要機制。本研究利用免疫組化和Western blot檢測TLR4/NLRP3/Caspase－1信號通路相關蛋白表達。結果顯示，與Sham組相比，Model組大鼠軟骨細胞TLR4陽性細胞率、NLRP3陽性細胞率、Caspase－1陽性細胞率以及TLR4、NLRP3和Caspase－1蛋白表達均顯著增加。與Model組相比，PNS能夠抑制上述蛋白表達，表明PNS能夠通過抑制TLR4/NLRP3/Caspase－1信號通路活化，降低OA軟骨細胞焦亡。IL－1β和IL－18已被證實可以增強軟骨分解代謝，并能夠通過降低蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白表達，促進軟骨細胞外基質降解，并最終到OA疾病進展。本研究結果顯示，PNS能夠下調OA大鼠軟骨組織IL－1β和IL－18蛋白表達，改善OA軟骨損傷。

綜上所述，本研究通過探究PNS對OA大鼠軟骨細胞焦亡的影響及其作用機制。結果顯示，PNS能夠抑制OA大鼠軟骨細胞焦亡，改善骨關節(jié)損傷，其機制可能與抑制TLR4/NLRP3/Caspase－1信號通路相關。但是本研究仍存在一定的局限性，如未能闡明PNS與TLR4/NLRP3/Caspase－1信號傳導的直接/間接關系。為此，本研究后續(xù)擬通過培養(yǎng)原代軟骨細胞，利用過表達和基因沉默等實驗技術進一步闡明PNS對TLR4/NLRP3/Caspase－1信號通路介導軟骨細胞焦亡的作用。