張藝馨，蔡善君*，李智立，于偉泓，張 華

1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 眼科，貴州 遵義 563003； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生物物理及結(jié)構(gòu)生物學(xué)系，北京 100005； 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 3.北京協(xié)和醫(yī)院 眼科；4.繼續(xù)教育學(xué)院，北京 100730

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)的進(jìn)行性并發(fā)癥，會(huì)導(dǎo)致患者視力障礙甚至是失明。DR可根據(jù)疾病嚴(yán)重程度分為：以視網(wǎng)膜血管異常為特征的非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)、以視網(wǎng)膜新生血管異常為特征的增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)和以黃斑附近視網(wǎng)膜增厚為特征的糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema, DME)。目前，由于DR患者早期無(wú)明顯癥狀，常在晚期被診斷，且臨床治療手段如激光光凝、玻璃體內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和類固醇藥物、玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)等主要適用于晚期病變[1]。遺憾的是，這些臨床治療手段只能延緩病情進(jìn)展而無(wú)法達(dá)到治愈，因此迫切需要新的診斷和治療思路。

免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)是人血漿中含量豐富的糖蛋白之一，其由可變區(qū)[F(ab)2]和片段結(jié)晶區(qū)(Fc)組成。研究發(fā)現(xiàn)，IgG的Fc區(qū)域的Asn297上都只有一個(gè)保守的N-糖基化修飾位點(diǎn)，連接1個(gè)二天線復(fù)合型聚糖，其核心結(jié)構(gòu)由4個(gè)N-乙酰葡糖胺和3個(gè)甘露糖構(gòu)成。不同的糖殘基，如半乳糖、唾液酸和巖藻糖和平分型N-乙酰葡糖胺可以附著在這個(gè)核心上。IgG糖基化修飾受到糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶基因的調(diào)控，其共價(jià)連接的聚糖影響其穩(wěn)定性、半衰期、轉(zhuǎn)運(yùn)、溶解性和與其他蛋白質(zhì)的相互作用并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[2]。IgG糖基化修飾的變化與疾病狀態(tài)、治療、感染、接種疫苗以及遺傳和環(huán)境因素有關(guān)[3]。由于DR是以慢性炎性為特征的多因素疾病，IgG糖基化修飾的改變可能與DR發(fā)生發(fā)展相關(guān)，這從分子層面為DR的發(fā)病機(jī)制研究提供了新思路。

1 DR免疫炎性反應(yīng)的相關(guān)發(fā)病機(jī)制

隨著DM的進(jìn)展，視網(wǎng)膜內(nèi)出現(xiàn)炎性反應(yīng)，包括免疫細(xì)胞激活和炎性因子釋放，從而引起血管擴(kuò)張和液體滲漏。視網(wǎng)膜內(nèi)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用增強(qiáng)，出現(xiàn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附的白細(xì)胞淤滯現(xiàn)象[4]，這一過(guò)程導(dǎo)致毛細(xì)血管阻塞無(wú)灌注，炎性細(xì)胞因子和超氧化物產(chǎn)生損傷周?chē)M織[5]。在DR后期，激活的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞會(huì)通過(guò)受損的血-視網(wǎng)膜屏障滲到入到視網(wǎng)膜，加重炎性反應(yīng)和組織損傷。此外，在PDR患者的黃斑前膜中檢測(cè)到浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)，其玻璃體樣本中也含有大量巨噬細(xì)胞，提示激活的免疫細(xì)胞參與了PDR新生血管膜的形成[6]。

在DR患者血清中，循環(huán)濾泡輔助性T細(xì)胞(circulating follicular helper T cells, cTfh)的比例升高，IL-6、IL-21、IL-10和CXCL13等炎性因子分泌增加，這些變化更有效地誘導(dǎo)B細(xì)胞分化成為記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞，促進(jìn)IgG和IgA的分泌[7]，表明在DR的發(fā)展進(jìn)程中存在著免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生。

2 IgG N-糖基化修飾與DR相關(guān)研究

為研究DR患者IgG糖基化修飾的變化，對(duì)DM患者和DR患者IgG N-聚糖圖譜進(jìn)行分析，并篩選出與DR相關(guān)的聚糖生物標(biāo)志物。其實(shí)驗(yàn)和分析包括4個(gè)主要部分：首先從2 mL血漿中分離和純化IgG蛋白，用N-糖苷酶F將N-聚糖釋放并進(jìn)行熒光標(biāo)記，采用超高效液相色譜技術(shù)對(duì)N-聚糖進(jìn)行定性和定量分析，最后對(duì)直接測(cè)得的糖基峰 (glycan peaks, GPs)和其衍生結(jié)構(gòu)(glycan traits, IGPs)進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)IgG糖基峰(GP15、GP20)和2個(gè)衍生結(jié)構(gòu)(IGP32、IGP54)與DR顯著相關(guān)，其中GP15、GP20和IGP54與DR的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，而IGP32與DR的發(fā)生呈正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)在后續(xù)的相似人群中也得到了驗(yàn)證[8]。與之相似的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在直接測(cè)量的糖基峰中，GP4、GP6、GP17和GP19在DR組水平較高，而GP15、GP16、GP18和GP21在對(duì)照組水平較高；在校正其他協(xié)變量后，10種唾液酸化修飾的聚糖在兩組間具有顯著差異。由此得出，唾液酸化修飾的IgG與DR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。

3 IgG N-糖基化修飾類型以及在DR中的作用機(jī)制

3.1 DR中半乳糖基化修飾的作用

在DR中IgG半乳糖基化修飾水平下降，這提示機(jī)體處于促炎狀態(tài)。

研究表明，半乳糖基化修飾反映了IgG的抗炎狀態(tài)，低半乳糖基化修飾使IgG在糖鏈末端暴露于乙酰氨基葡萄糖，不易被吞噬細(xì)胞清除，不僅導(dǎo)致抗體與FcγRIIIa結(jié)合力降低，激活抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)[10]，而且還影響IgG的熱穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)聚集傾向以及與FcRn的結(jié)合，這些引起補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，并通過(guò)替代途徑誘發(fā)炎性反應(yīng)[11]。其中，F(xiàn)c段N-聚糖的α1-6分支鏈上的末端半乳糖基化修飾可促進(jìn)IgG與血清補(bǔ)體C1q 結(jié)合，激活補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)[12]。并且去半乳糖化的IgG1能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放活性氧(reactive oxygen species, ROS)[13]，當(dāng)超過(guò)機(jī)體抗氧化能力時(shí)，引起視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞軸突變性、毛細(xì)血管細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致DR的發(fā)生發(fā)展。

另外，IgG半乳糖基化修飾降低也可能是編碼β1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1的基因B4GALT1表達(dá)水平降低，導(dǎo)致N-糖鏈的末端半乳糖基化水平下降。而這些由低半乳糖基化修飾的IgG引起的炎性反應(yīng)可能會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜造成損傷，進(jìn)而影響患者視力。

3.2 DR中巖藻糖基化修飾的作用

在DR中IgG巖藻糖基化修飾水平下降，這可能引起體內(nèi)ADCC增強(qiáng)。核心巖藻糖基化修飾水平對(duì)免疫球蛋白的功能有至關(guān)重要的影響，被認(rèn)為是ADCC的“安全開(kāi)關(guān)”，F(xiàn)c區(qū)核心巖藻糖的缺失特異性增強(qiáng)了IgG與FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b) Asn162聚糖的相互作用，顯著增強(qiáng)了ADCC[14]。與高度巖藻糖基化的IgG1相比，高度去巖藻糖基化修飾的IgG1表現(xiàn)出更高的ADCC，兩者在抗原結(jié)合方面卻沒(méi)有任何差異[15]。由此表明，低巖藻糖基化修飾的IgG1使ADCC增強(qiáng)，并進(jìn)一步加重了免疫反應(yīng)，造成視網(wǎng)膜的損傷。

3.3 DR中唾液酸化修飾的作用

在DR中發(fā)現(xiàn)IgG唾液酸化修飾降低，這可能與體內(nèi)促炎反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。IgG Fc唾液酸化修飾可通過(guò)增強(qiáng)其與FcγRIIb的親和力來(lái)增強(qiáng)其抗炎活性，并可通過(guò)減少其與FcγRIIIa的結(jié)合來(lái)降低ADCC作用，發(fā)揮抗炎功能[16]。在激活的B細(xì)胞中，γ-干擾素受體可以通過(guò)JAK1/2信號(hào)通路下調(diào)B細(xì)胞中α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1的表達(dá)，從而降低了IgG的Fc唾液酸化，加重了炎性反應(yīng)，該過(guò)程可能在初次免疫后發(fā)生，并在較長(zhǎng)一段時(shí)間在體內(nèi)保持穩(wěn)定[17]。此外，因高血糖的刺激，DR患者體內(nèi)IL-6、IL-17等炎性因子著升高[18]，而這些炎性因子又可以誘導(dǎo)IL-17受體依賴的INF-γTfh1細(xì)胞，IL-6/IL-23依賴的IL-17A+Tfh17細(xì)胞和Tfh細(xì)胞與Foxp3+濾泡樣調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖。Tfh細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)B細(xì)胞下調(diào)α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1的表達(dá)，從而影響IgG Fc唾液酸化[19]。此外，對(duì)于2型DM患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者IgG的二天線α2,6-唾液酸化增加，而三天線α2,3-唾液酸化減少[20]，編碼β-半乳糖苷α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的ST6GAL1的SNP位點(diǎn)與疾病易感性有關(guān)[21]，ST6GAL1在炎性反應(yīng)中也發(fā)揮作用，可以合理推測(cè)，該基因在DR的IgG糖基化中也起到一定的作用。

3.4 DR中平分型N-乙酰葡糖胺修飾的作用

在DR中IgG的平分型N-乙酰葡糖胺修飾增加。IgG上較高水平的平分型N-乙酰葡糖胺修飾可增加與FcγRIII的結(jié)合力來(lái)增強(qiáng)ADCC，并提高 IgG 的促炎作用[22]。平分型N-乙酰葡糖胺修飾可以抑制N-聚糖末端表位生物合成，如末端巖藻糖基化、末端唾液酸化，這些末端聚糖的缺失又可增強(qiáng)ADCC[23]。然而，目前尚不確定ADCC的增強(qiáng)是直接由平分型N-乙酰葡糖胺修飾水平的變化引起還是由其他糖基化修飾水平的變化引起的。此外，平分型N-乙酰葡糖胺可以增加甘露糖結(jié)合凝集素的免疫球蛋白親和力，其通過(guò)靶細(xì)胞的調(diào)理啟動(dòng)凝集素補(bǔ)體途徑級(jí)聯(lián)反應(yīng)[24]。

綜上，在DR中IgG N-糖基化修飾變化為：半乳糖基化、巖藻糖基化和唾液酸化降低，而平分型N-乙酰葡糖胺修飾增加。這些糖基化修飾的改變加強(qiáng)了IgG的ADCC和CDC，從而加重炎性反應(yīng)和組織損傷，造成視網(wǎng)膜的病理改變。

4 問(wèn)題與展望

目前，針對(duì)DR的IgG糖基化修飾的相關(guān)研究一般基于患者血清進(jìn)行，對(duì)房水、玻璃體等特異性眼內(nèi)容物標(biāo)本缺少相關(guān)研究。另外，DR中IgG糖基化的生物學(xué)機(jī)制值得在動(dòng)物或細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究。

目前對(duì)于DR的相關(guān)研究都集中于聚糖水平，缺少I(mǎi)gG亞類和Fc連接位點(diǎn)的信息。隨著質(zhì)譜檢測(cè)等技術(shù)的發(fā)展，糖基化修飾的研究分析方法取得了很大的進(jìn)展[25]。根據(jù)最終的分析對(duì)象不同，IgG N-糖基化修飾的研究大致可以分為以下三個(gè)水平：聚糖、糖肽和糖蛋白。三種水平的研究都存在其弊端。在聚糖水平分析中，需先將聚糖從IgG上酶解釋放，再通過(guò)衍生化提高其穩(wěn)定性和檢測(cè)的靈敏度，但是該過(guò)程會(huì)一定程度上破壞聚糖結(jié)構(gòu)，造成結(jié)果的偏差。在糖肽水平分析中，如何建立更有效方法對(duì)糖肽分離與富集，且準(zhǔn)確識(shí)別IgG的連接聚糖異構(gòu)體是目前需要解決的問(wèn)題。而對(duì)于糖蛋白質(zhì)水平分析，由于蛋白質(zhì)分子量大且聚糖的占比較少，信號(hào)較低，不利于分析聚糖結(jié)構(gòu)，目前很難展開(kāi)大規(guī)模研究，相關(guān)的臨床研究也較少。實(shí)際上，基于質(zhì)譜技術(shù)的糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析仍具有挑戰(zhàn)性。未來(lái)，方法學(xué)的進(jìn)步將繼續(xù)給這一領(lǐng)域帶來(lái)革命性的變化，并加速在糖蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的探索。

IgG糖基化模式和DR進(jìn)展之間的確切關(guān)系仍不清楚。將糖蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)和代謝組學(xué)的研究相結(jié)合，可能會(huì)更全面地了解DR過(guò)程中的致病機(jī)制。隨著相關(guān)研究的熱度增加，深入探索IgG N-糖基化修飾與DR的關(guān)系對(duì)從全新的角度探索發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物、革新診斷思路和治療方法具有重要意義。