謝曉婷，張 雷*，張 莉*，董 鳳，劉 穎,2，李光華，楊 興

1.大理大學(xué) 病原與媒介生物研究所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點實驗室, 云南 大理 671000；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 二部檢驗科，吉林 長春 130000

胃癌(gastric carcinoma, GC)是全球范圍內(nèi)的主要健康問題之一，2020年全球GC新增病例超過100萬例，其病死率在惡性腫瘤中排第四位[1]。幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori, Hp)感染導(dǎo)致的慢性胃炎和消化性潰瘍，是胃癌發(fā)展的最大危險因素[2]。世界上已經(jīng)有超過一半的人口感染了Hp，在中國約有5.89億人感染Hp[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織2018年統(tǒng)計，81.2萬例新的胃惡性腫瘤病例可歸因于Hp感染，其中胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)占90%[4]。研究表明，Hp感染可導(dǎo)致NF-κB信號通路的激活，引起持續(xù)性的炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，進而促進胃癌的發(fā)生[5]。但是，Hp感染致病的確切機制迄今仍不清楚。已有研究表明果蠅蛋白Ash2的類似物(absent，small or homeotic2-like protein, ASH2L)作為H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的核心成分對于組蛋白H3K4的甲基化起到非常重要的作用[6]，且ASH2L在許多腫瘤細胞系中高表達[7]。本研究利用多種生物信息學(xué)軟件對癌數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行挖掘，以分析ASH2L在多種腫瘤中的表達水平、與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系及其預(yù)后；并在實驗研究中用Hp分別感染GES人胃上皮細胞和兩種人胃腺癌上皮細胞(SGC-7901、AGS)，以分析在人胃上皮細胞中Hp感染因素對ASH2L表達水平的影響，初步探討ASH2L在Hp感染所致胃癌中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及菌株：健康人胃黏膜上皮細胞系GES、中分化人胃腺癌細胞系SGC-7901、低分化人胃腺癌細胞系A(chǔ)GS(中國科學(xué)院昆明細胞庫)；Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC43504)(美國菌種保存中心)。

1.1.2 試劑：DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)；特級胎牛血清(QuaCell公司)；胰蛋白酶、高效RIPA組織/細胞快速裂解液、青霉素及鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)；Hp培養(yǎng)所需混合氣體(85% N2、10% CO2、5% O2)(MESSER公司)；胰蛋白大豆瓊脂(BD公司)；ASH2L Rabbit mAb(Cell Signaling Technology公司)；羊抗兔IGg-HRP(Abcam公司)；FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊生物科技股份有限公司)；BCA蛋白質(zhì)定量/濃度測定試劑盒(美侖生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基于癌數(shù)據(jù)庫的ASH2L生物信息學(xué)分析

1.2.1.1 ASH2L在不同腫瘤組織中的表達差異：TIMER是一個資源全面的腫瘤免疫在線研究工具，包括32種癌類型的10 897個樣本[8]。本研究利用TIMER2.0(http://timer.comp-genomics.org/)工具在線分析ASH2L 在不同腫瘤中的表達差異。

1.2.1.2 ASH2L在胃腺癌組織中的表達及其與胃腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性:UALCAN平臺(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)收錄了TCGA 數(shù)據(jù)庫中3種水平的RNA-Seq和31種癌類型的臨床數(shù)據(jù)[9]，可以分析腫瘤和正常樣本之間以及基于單個癌分期、腫瘤分級或其他臨床病理特征中基因的相對表達。在該平臺的TCGA癌數(shù)據(jù)庫中篩選ASH2L在STAD中的表達情況，分析ASH2L與胃腺癌患者的年齡、性別、種族、病理分級、腫瘤分期之間的關(guān)系。

1.2.1.3 ASH2L的表達對胃癌患者生存的影響:Kaplan-Meier plotter工具(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)可評估乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌等21種腫瘤類型的樣本中基因或蛋白質(zhì)的表達與生存率之間的相關(guān)性。利用該工具從mRNA水平分析ASH2L基因?qū)C患者的總體生存率(overall survival，OS)和后進展生存期(post progression survival，PPS)的影響。

1.2.2 Hp感染人胃上皮細胞系對ASH2L表達的影響

1.2.2.1 人胃上皮細胞和Hp的培養(yǎng)：將1.5×105個/mL的GES、SGC-7901和AGS三種細胞按每孔2 mL鋪入6孔板中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后，分別取其中1孔細胞進行計數(shù)，以確定細胞數(shù)量。幾種細胞培養(yǎng)基的成分均為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。Hp菌株在微需氧條件下(5% O2、10% CO2和85% N2)于37 ℃在含10%新生牛血清的胰蛋白大豆瓊脂平板上培養(yǎng)48 h，按A600=1×CFU/mL測定活菌數(shù)量[10]。

1.2.2.2 Hp感染人胃上皮細胞系：經(jīng)本實驗室前期大量實驗摸索得到的最佳感染條件為感染復(fù)數(shù)(MOI=200)，感染時間=60 min，按MOI為200，將1 mL的菌懸液分別加入上述培養(yǎng)24 h的3種細胞中，放入37 ℃溫箱中感染60 min，收集未感染和感染后的細胞樣品，分別制備總RNA樣品和蛋白質(zhì)樣品，用于檢測ASH2L的表達。

1.2.2.3 Hp感染前后細胞中ASH2L表達量的測定：1)RT-qPCR檢測ASH2L的表達：分別提取Hp未感染組與Hp感染組的GES、SGC-7901和AGS細胞系的總RNA，將總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。ASH2L上游引物：5′-AGAATGGCCGACAGTTGGG-3′，下游引物：5′-CCTTCAAGTTTGCTTGCTTCC-3′；GADPH(內(nèi)參)上游引物： 5′-GGAGCGAGATCC CTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATA CTTCTCATGG-3′。2)Western blot檢測ASH2L的表達：細胞樣品加入裂解液裂解，得到蛋白質(zhì)樣本,將蛋白質(zhì)樣品經(jīng)BCA法測濃度，將得到的免疫印跡條帶經(jīng)ImageJ進行吸光度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基于癌數(shù)據(jù)庫的ASH2L生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 ASH2L在腫瘤組織及正常組織中的差異表達：利用 TIMER2.0工具在線分析 ASH2L在不同腫瘤中的表達差異，結(jié)果表明ASH2L在15種腫瘤中的表達存在差異，與正常胃組織相比，ASH2L在胃腺癌組織中高表達(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with normal gastric tissue

2.1.2 ASH2L在胃腺癌中的表達及其與胃腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系：ASH2L在胃腺癌組織中的表達水平明顯高于正常胃組織(P<0.05)(圖2A)。亞洲人和白種人的ASH2L表達量明顯高于正常水平，且非裔美國人中ASH2L的表達量明顯低于白種人(P<0.05)(圖2B)；在41～60歲和61～80歲年齡組胃腺癌患者中ASH2L的表達量明顯高于正常水平，且21～40歲年齡組胃腺癌患者中的ASH2L明顯高于61～80歲和81～100歲年齡組(P<0.05)(圖2C)；ASH2L的表達量與男女性別無關(guān)(圖2D)，在3個病理分級中ASH2L的表達量均高于健康人(P<0.05)(圖2E)，在腫瘤前3個分期階段ASH2L的表達量均較健康人高(P<0.05)(圖2F)。

A.expression of ASH2L in STAD based on sample types; B.expression of ASH2L in STAD based on patient’s race; C.expression of ASH2L in STAD based on patient’s age; D.expression of ASH2L in STAD based on patient’s gender; E.expression of ASH2L in STAD based on tumor grade; F.expression of ASH2L in STAD based on indivigual cancer

2.1.3 ASH2L的表達水平對胃癌患者OS和PPS的影響：高表達水平的ASH2L在胃癌中預(yù)示更差的總生存期(P=0.17)和更差的后進展生存期(P<0.05)(圖3)。

A.effect of ASH2L gene on the OS of patients with gastric adenocarcinoma；B.effect of ASH2L gene on PPS in patients with gastric adenocarcinoma

2.2 Hp感染前后胃上皮細胞系中ASH2L的表達

與Hp未感染組相比，Hp感染組的GES、SGC-7901、AGS細胞中ASH2L的mRNA表達量顯著上調(diào)(P<0.05)(圖4)。

A.ASH2L mRNA expression in GES cells; B.ASH2L mRNA expression in SGC-7901 cells; C.ASH2L mRNA expression in AGS cells; *P<0.05 compared with cell lines without Hp infection factor

Hp未感染組相比Hp感染組的細胞系中ASH2L蛋白的表達量顯著上調(diào)(P<0.05)(圖5)。

A.expression of ASH2L protein in GES cells; B.expression of ASH2L protein in SGC-7901 cells; C.expression of ASH2L protein in AGS cells; *P<0.05 compared with cell lines without Hp infection factor

3 討論

胃癌是全球第五大常見的癌以及第四大癌死亡原因[1]。除了亞硝酸鹽和咸食等飲食因素外，Hp感染也是誘發(fā)胃癌的主要原因，盡管胃癌的治療技術(shù)也正在迅速發(fā)展，以對抗這種具有挑戰(zhàn)性的疾病[11]，但Hp感染誘發(fā)胃癌的確切機制尚未明確。

本研究通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)在胃腺癌組織中ASH2L呈現(xiàn)高表達的現(xiàn)象，這與目前ASH2L在其他多種腫瘤(如食管癌、子宮內(nèi)膜癌和睪丸癌)中高表達的研究結(jié)果一致[12-13]。目前的研究表明ASH2L的高表達與子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后不良相關(guān)[12]，而低水平的ASH2L與急性髓系白血病總生存率增加相關(guān)[14]，這些研究結(jié)果與本研究中ASH2L的高表達可縮短胃癌患者的總生存期和后進展生存期的結(jié)論一致。因此，ASH2L有可能作為臨床診斷、預(yù)后和治療的靶標(biāo)。

盡管Hp感染誘發(fā)胃癌的具體機制尚未揭示，但是目前一致認(rèn)為NF-κB信號通路的激活是Hp感染致胃潰瘍、胃癌的重要原因。ASH2L作為一種具有甲基轉(zhuǎn)移酶活力的蛋白質(zhì)，對于H3K4的甲基化起到非常重要的作用，阻斷ASH2L會下調(diào)H3K4Me3，從而負(fù)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[15]。過表達ASH2L導(dǎo)致腫瘤增殖，而基因沉默ASH2L則抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此ASH2L被認(rèn)為是一種癌蛋白[7]。在子宮內(nèi)膜癌的研究中表明，ASH2L通過改變組蛋白H3K4me3和H3K27me3的水平，以促進雌激素受體α誘導(dǎo)的靶基因PAX2的激活，進而促進子宮內(nèi)膜癌的進展[12]。而HEK-293、HT29和U2OS等細胞在外界因子的刺激下，P65的多個不同的賴氨酸殘基會被甲基化。在本研究中發(fā)現(xiàn)Hp感染后，胃上皮細胞出現(xiàn)ASH2L表達水平顯著增高。因此，Hp感染可能通過上調(diào)ASH2L的表達量而在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。同時，ASH2L作為一種具有甲基轉(zhuǎn)移酶活力的重要蛋白，是否在P65甲基化中發(fā)揮作用以及在幽門螺旋桿菌感染所誘導(dǎo)的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中是否發(fā)揮著相似的功能值得進一步研究。