陳志能 黃立卉 黃穎露 方楊冰 黃瑩瑩 楊 婷 李沁如 徐啟鍵 夏 荃※

（1.嶺南中藥飲片有限公司，廣東 佛山 528200；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)人文學(xué)院，北京 100029；3.茂名市中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 茂名 525000；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

陳皮為蕓香科植物橘（CitrusreticulataBlanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，為中醫(yī)常用的理氣藥，性溫，味辛、苦，具有理氣化痰、健脾燥濕的功效[1]。陳皮的炮制歷史悠久，炮制品種眾多，除陳皮外，還有麩炒陳皮、蒸陳皮等多個(gè)炮制品種，通過(guò)炮制可起到增強(qiáng)療效、緩和燥性等作用。在《全國(guó)中藥炮制規(guī)范》[2]及地方炮制規(guī)范中，還收載有陳皮炭這一炮制品種。陳皮炭這一炮制品種在多地的炮制規(guī)范中均有收載，但關(guān)于該炮制品的炮制作用，各炮制規(guī)范中的記載有所不同。陳皮炭的炮制作用在全國(guó)中藥炮制規(guī)范中并未明確，在北京、四川、寧夏等地炮制規(guī)范的記載中，普遍認(rèn)為陳皮炭具有止血、化痰的功效，常用于痰中帶血等癥的治療[3-5]。但在《施今墨臨床經(jīng)驗(yàn)集》[6]《侍師襄診漫筆（續(xù)5）》[7]等臨床治療經(jīng)驗(yàn)中，認(rèn)為陳皮炭亦具有較好的收斂止瀉功效，故常用于腹瀉、痢疾等病癥的治療。目前國(guó)內(nèi)外已圍繞陳皮開(kāi)展了系列研究，但是陳皮炭的相關(guān)研究較少，且多圍繞炒炭前后化學(xué)成分的含量變化和炮制工藝展開(kāi)[8]，針對(duì)陳皮炭止瀉作用的研究則更少，有必要對(duì)此進(jìn)行深入研究。

炒炭法是中藥炮制的常用方法之一，炒炭后，藥物的收斂作用增強(qiáng)，可用于腹瀉、出血等多種病癥。明代陳嘉謨?cè)凇侗静菝审堋穂9]中提到“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過(guò)則氣味反失”，說(shuō)明了炮制適度的重要性，傳統(tǒng)炮制理論中要求的“炒炭存性”是炮制適度的典型體現(xiàn)。炒炭存性指藥物在炒炭時(shí)，外部雖然炭化，但內(nèi)部不應(yīng)炭化，以保存其固有藥性。只有準(zhǔn)確掌握炮制程度，才能使飲片在臨床應(yīng)用中發(fā)揮最佳療效。因此本研究以陳皮炭為研究對(duì)象，探究不同炒制程度陳皮炭對(duì)腹瀉大鼠的治療作用及對(duì)血清五羥色胺（5-HT）的影響，為陳皮炭的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)雄性SD 大鼠36 只，體質(zhì)量210～250 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0034，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（粵）2019-0202；大鼠飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫19～22 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，光照周期保持24 h 晝夜節(jié)律，正常自由飲水、進(jìn)食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物（紅）陳皮絲（佛山市南海北沙藥材加工廠提供，產(chǎn)品批號(hào)：190311），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院夏荃教授鑒定為蕓香科植物橘（Citrusreticulata Blanco）的干燥成熟果皮。

1.1.3 主要試劑及儀器蓖麻油（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S24344）；蘇木素染色液、伊紅染色液（Solarbio 科技有限公司）；大鼠五羥色胺ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：MM-044R1）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海寶予德科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：K3Plu6）；光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS，型號(hào)：BX53）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 陳皮炭的炮制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)炭的制備參照《全國(guó)中藥炮制規(guī)范》[2]進(jìn)行炮制，取適量陳皮置熱鍋內(nèi)，用武火炒至表面焦黑色，內(nèi)部焦褐色時(shí)，噴淋少許清水，熄滅火星，取出，晾干，即得。

1.2.1.2 輕炭的制備取適量陳皮置熱鍋內(nèi)，用武火炒至表面焦褐色，內(nèi)部焦黃色時(shí)，噴淋少許清水，熄滅火星，取出，晾干，即得。

1.2.1.3 重炭的制備取適量陳皮置熱鍋內(nèi)，用武火炒至表面焦黑色、內(nèi)部焦黑色時(shí)，噴淋少許清水，熄滅火星，取出，晾干，即得。

1.2.2 陳皮炭水煎液的制備分別稱取適量輕炭、標(biāo)準(zhǔn)炭、重炭，加入10 倍量水浸泡30 min，微沸煎煮30 min，濾過(guò)，濾渣加入10 倍量水煎煮30 min，濾過(guò)，合并2 次濾液，減壓濃縮至含生藥量為0.1 g/mL，置4 ℃冰箱存放。

1.2.3 分組與造模將36 只SD 大鼠隨機(jī)分為6 組，每組6 只，即空白組、模型組、蒙脫石組（1 g·kg-1）、陳皮炭輕炭組（1 g·kg-1）、陳皮炭重炭組（1 g·kg-1）、陳皮炭標(biāo)準(zhǔn)炭組（1 g·kg-1）。空白組給予同體積的生理鹽水，其他試驗(yàn)組均以蓖麻油1 mL·100 g-1灌胃造模[10]。1 h 后，空白組和模型組給予生理鹽水，其他組給予相應(yīng)藥物，灌胃劑量均為1 mL·100 g-1。

1.2.4 大鼠稀便指數(shù)的測(cè)量灌胃給藥后單鼠單籠，鼠籠底部鋪置報(bào)紙，每1 h 換紙1 次，連續(xù)觀察6 h，記錄大鼠的腹瀉潛伏期、稀便率、稀便等級(jí)等指標(biāo)數(shù)據(jù)，并計(jì)算腹瀉指數(shù)[11]作為評(píng)價(jià)大鼠腹瀉情況的指標(biāo)。糞便顆粒計(jì)數(shù)以每?；蛎慷眩ú荒芊智辶?shù)者）記為1 次，干便與稀便的區(qū)分以濾紙上有無(wú)污跡為標(biāo)準(zhǔn)。腹瀉指數(shù)計(jì)算方法見(jiàn)表1，稀便級(jí)的測(cè)量方法見(jiàn)表2、表3。

表1 腹瀉指數(shù)計(jì)算方法

表2 稀便級(jí)數(shù)表

表3 污跡直徑的測(cè)量方法

1.2.5 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察取大鼠結(jié)腸組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行石蠟包埋、切片，并用蘇木素-伊紅（HE）染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠結(jié)腸病理學(xué)特征。

1.2.6 血清5-HT 水平的測(cè)定大鼠腹主動(dòng)脈采血，離心半徑10 cm、4500 r/min 離心15 min，取上清液，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定血清中5-HT水平。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況空白組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常，未出現(xiàn)異常表現(xiàn)。蓖麻油造模后，模型組大鼠出現(xiàn)明顯腹瀉表現(xiàn)，大便變軟，出現(xiàn)稀便，大鼠肛周被稀便污染，部分大便呈稀糊狀且?jiàn)A有黏液，說(shuō)明模型建立成功。給藥后，各治療組腹瀉逐漸好轉(zhuǎn)，水樣便減少，大便逐漸成形。

2.2 陳皮炭對(duì)大鼠腹瀉指數(shù)的影響模型組與空白組相比，腹瀉指數(shù)顯著增加（P ＜0.01），說(shuō)明造模成功。與模型組相比，蒙脫石組腹瀉指數(shù)降低（P ＜0.05），陳皮炭標(biāo)準(zhǔn)炭組腹瀉指數(shù)顯著降低（P ＜0.01）。結(jié)果顯示，3 種程度陳皮炭中，標(biāo)準(zhǔn)炭止瀉效果最優(yōu)，重炭次之，輕炭效果較差。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠稀便指數(shù)結(jié)果 （）

表4 各組大鼠稀便指數(shù)結(jié)果 （）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

2.3 大鼠結(jié)腸組織HE 染色結(jié)果低倍光鏡下觀察空白組及模型組結(jié)腸HE 染色結(jié)果（×100）?？瞻捉M黏膜上皮完整，未見(jiàn)明顯炎性浸潤(rùn)，腺體整體清晰，黏膜下層未見(jiàn)充血、水腫等炎癥反應(yīng)，肌層清晰可見(jiàn)。與空白組相比，模型組黏膜上皮出現(xiàn)壞死脫落，黏膜固有層可見(jiàn)大片炎癥細(xì)胞排列紊亂簇集浸潤(rùn)，腸壁變薄。證明腹瀉模型造模成功。

與模型組相比，各治療組黏膜各層結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞排列較為整齊，腸黏膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、潰瘍等現(xiàn)象均有不同程度好轉(zhuǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠結(jié)腸組織病理切片（×100）

2.4 腹瀉大鼠體內(nèi)血清5-HT 含量變化與空白組相比，模型組血清5-HT 含量顯著上升（P ＜0.01），與模型組相比，蒙脫石組、陳皮炭標(biāo)準(zhǔn)炭組腹瀉大鼠治療后體內(nèi)血清5-HT 含量顯著下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；陳皮炭重炭組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 3 種不同炭化程度的陳皮炭對(duì)腹瀉大鼠體內(nèi)血清5-HT 含量變化的影響（，ng/L）

表5 3 種不同炭化程度的陳皮炭對(duì)腹瀉大鼠體內(nèi)血清5-HT 含量變化的影響（，ng/L）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.05。

3 討論

炭藥作為常見(jiàn)中藥炮制品種之一，從古至今被廣泛應(yīng)用于臨床。中藥制炭可以改變藥物固有性能，增強(qiáng)收斂止血、固澀止瀉之功[12]。目前，有關(guān)炭藥的研究多集中在“炭藥止血”上[13]，而針對(duì)“炭藥止瀉”的研究較少。陳皮炭作為中藥常用的炭藥，在收斂止瀉上具有良好的功效和廣泛的醫(yī)用價(jià)值，但目前相關(guān)研究較少。因此，對(duì)不同炒制程度陳皮炭的止瀉作用進(jìn)行研究，不僅有利于擴(kuò)大陳皮炭的臨床應(yīng)用范圍，還能夠?yàn)椤俺刺看嫘浴钡目茖W(xué)內(nèi)涵提供新的思路。

本實(shí)驗(yàn)以陳皮為研究對(duì)象，清炒得3 種程度陳皮炭，通過(guò)造模大鼠腹瀉模型，比較不同炒制程度陳皮炭的止瀉效果，為陳皮炭治療腹瀉提供初步依據(jù)。結(jié)果顯示，3 種程度陳皮炭中，正常炒制程度的陳皮炭能明顯降低腹瀉指數(shù)，止瀉效果最優(yōu)；而炒制不及或炒制太過(guò)的陳皮炭的腹瀉指數(shù)則與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

腹瀉常由腸道黏膜損傷及各種炎性介質(zhì)的釋放引起，陳皮炭抗腹瀉的作用機(jī)制可能與修復(fù)腸黏膜、抑制炎癥介質(zhì)的合成與釋放有關(guān)。通過(guò)觀察病理切片可知，模型組結(jié)腸淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)腸黏膜、黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落等炎癥現(xiàn)象，治療后黏膜各層結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞排列較為整齊，炎性現(xiàn)象均有不同程度好轉(zhuǎn)，提示陳皮炭可有效改善大鼠腸黏膜炎癥損傷，促進(jìn)黏膜修復(fù)，具有一定的損傷修復(fù)作用。

目前，陳皮炭的止瀉機(jī)制并不明確，研究[14]表明，5-HT 是胃腸道極為重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，腹脹、泄瀉等癥狀都可引起5-HT 釋放，5-HT 升高能引起內(nèi)臟感覺(jué)過(guò)敏，導(dǎo)致胃腸運(yùn)動(dòng)的收縮[15]。故本研究從大鼠血清中5-HT 的含量變化研究陳皮炭的止瀉機(jī)制。結(jié)果顯示，除陳皮炭輕炭組外，各治療組腹瀉大鼠治療后血清5-HT 含量與模型組相比增多出現(xiàn)明顯下降。陳皮炭標(biāo)準(zhǔn)炭組血清5-HT 含量最低，優(yōu)于其他治療組。提示陳皮炭的止瀉作用可能與降低血清中5-HT 含量有關(guān)。

綜上所述，陳皮炭對(duì)蓖麻油引起的腹瀉具有抑制作用，其中標(biāo)準(zhǔn)炮制程度的陳皮炭效果最好，說(shuō)明炒制不及或太過(guò)均會(huì)降低止瀉效果。陳皮炭可改善大鼠腸黏膜炎癥損傷，具有一定的損傷修復(fù)作用。陳皮炭止瀉的作用機(jī)制之一可能是通過(guò)降低血清中5-HT 含量來(lái)減弱腸道蠕動(dòng)。本試驗(yàn)主要對(duì)陳皮炭抗腹瀉作用作初步研究，為陳皮炭治療腹瀉提供初步依據(jù)，關(guān)于陳皮炭是如何改善腸黏膜的炎癥損傷，降低血清5-HT 水平，發(fā)揮抗腹瀉作用，是否存在其他作用機(jī)制及途徑，仍有待進(jìn)一步深入研究。