高 雅，王 琛，李 瀟，張曉黎，韓艷秋，吳興壯

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與加工研究所，沈陽 110161）

山楂果實(shí)中有機(jī)酸特別是檸檬酸含量很高[1]，很大程度影響加工成品的市場(chǎng)消費(fèi)。為使山楂果汁達(dá)到合適的糖酸比例，在加工過程中會(huì)添加大量的糖來改善口感，但這樣會(huì)導(dǎo)致市場(chǎng)上的山楂果汁含糖量較高，與目前流行的低糖消費(fèi)理念大相徑庭[2]。目前，果汁或果酒采用的降酸方法有化學(xué)降酸法、物理降酸法和生物降酸法，但化學(xué)降酸法對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)有較大影響，物理降酸法易導(dǎo)致產(chǎn)品穩(wěn)定性變差，而生物降酸優(yōu)勢(shì)則非常突出[3]。以植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、檸檬明串珠菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌7種乳酸菌為研究對(duì)象，比較菌株在檸檬酸培養(yǎng)基中的生長曲線及其在山楂果漿中的生長情況和降酸效果，篩選出可代謝檸檬酸的乳酸菌，從而實(shí)現(xiàn)山楂汁的有效降酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：購置于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LNJ005 由研究單位自行分離保存；發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）BNCC194390、短 乳 桿 菌（Lactobacillus brevis）BNCC337373、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）BNCC134415、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）BNCC194779、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）BNCC186447、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）BNCC189793：購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，菌種分別編號(hào)為G1-G7。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD 型單人單面工作凈化臺(tái)：上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；CJ50-3疊加式培養(yǎng)箱：上海程捷儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；756型紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；5975C 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）：安捷倫科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的制備

液體MRS 培養(yǎng)基配置：葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.4%，牛肉膏0.5%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸三銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸錳0.005%，硫酸鎂0.02%，吐溫-80取1 mL，121 ℃滅菌20 min。

檸檬酸液體培養(yǎng)基配置：在MRS 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加20%檸檬酸。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 基礎(chǔ)理化指標(biāo)測(cè)定方法 pH 值用pHS-3C 雷磁pH計(jì)測(cè)定；總酸（以檸檬酸計(jì)）采用酸堿滴定法測(cè)定，參考GB/T 15038—1994；檸檬酸參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.157—2016 食品中有機(jī)酸的測(cè)定（高效液相色譜法）；含量計(jì)算采用歸一化法。

1.4.2 山楂果漿制備方法 取市售無霉?fàn)€變質(zhì)、成熟度基本一致的新鮮山楂，洗滌去核后按1∶1 加水，加熱軟化，隨后打漿。冷卻后加入果膠酶(1 mL/L)，再置于53 ℃水浴中浸提，經(jīng)壓榨過濾制得山楂果漿。

1.4.3 試驗(yàn)菌株生長曲線的測(cè)定 將7 株試驗(yàn)菌株在液體MRS中活化培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)OD600值為1.00，以2%（v/v）接種量將對(duì)數(shù)生長期的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，再以2%的接種量接入檸檬酸培養(yǎng)基中。27 ℃下每隔2 h 測(cè)定OD600值，并繪制菌株生長曲線，從而對(duì)菌株進(jìn)行篩選。

1.4.4 試驗(yàn)菌株在山楂果漿中的生長情況 將7 株試驗(yàn)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以4%（v/v）的接種量接入山楂果漿中，接種后每隔24 h 取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，分析不同試驗(yàn)菌株在山楂果漿中的生長能力。

1.4.5 試驗(yàn)菌株在山楂果漿中的降酸效果 將7 株試驗(yàn)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以4%（v/v）的接種量接入山楂果漿中，接種后發(fā)酵12 d 取樣，測(cè)定其pH 值及總酸、檸檬酸含量，分析菌株對(duì)山楂果漿的降酸能力。降酸能力以檸檬酸的減少率來計(jì)算。

1.4.6 降酸工藝優(yōu)化研究 取50 mL 山楂汁裝入錐形瓶中，并根據(jù)之前的篩選結(jié)果，選取具有較好降酸效果的菌株，再通過單因素分析來確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)長、菌株接種數(shù)量下降酸率的變化情況。選擇3種指標(biāo)的優(yōu)勢(shì)范圍，進(jìn)行三因素三水平的降酸率分析。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)菌株的生長曲線

在檸檬酸液體培養(yǎng)基中開展菌株篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)共有7種菌株能與檸檬酸發(fā)生反應(yīng)。繪制7種菌株的生長曲線，如圖1所示。

圖1 各菌株生長曲線Figure 1 Growth curves of each strain

從圖1中可以看出，菌株在24～28 h 的擴(kuò)增數(shù)據(jù)較快，G7菌株在28～40 h擴(kuò)增數(shù)據(jù)較快，調(diào)整期約為8 h，之后進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，最后趨于穩(wěn)定。G1 與G5菌株在液體培養(yǎng)基中菌數(shù)較多，而G3 和G4 最少，且生長能力弱、生長緩慢。因此，得出植物乳桿菌G1和檸檬明串株菌G5 生長能力較強(qiáng)，可作為降檸檬酸的菌株。

2.2 試驗(yàn)菌株在山楂果漿中的生長情況

將7個(gè)菌株應(yīng)用于山楂果汁中，可顯著改善其發(fā)酵性能，促進(jìn)其發(fā)酵過程。乳酸菌發(fā)酵的活菌數(shù)變化情況如圖2所示。

圖2 乳酸菌發(fā)酵的活菌數(shù)變化Figure 2 Changes in the number of viable bacteria of lactobacillus fermentation

在山楂汁的發(fā)酵環(huán)境中表現(xiàn)出了足夠快的代謝速度和增殖速度，并保持了良好的生長勢(shì)頭。在培養(yǎng)初始狀態(tài)下，G5菌株的活菌數(shù)略高于其他菌株的活菌數(shù)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，7 種菌株的活菌數(shù)呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，并逐漸接近，到達(dá)12 h 后，活菌數(shù)則呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，表明在一定時(shí)間內(nèi)，菌株數(shù)量不再增加，但是G5 菌株的數(shù)量始終高于其他菌株，由此可以得出G5 菌株在山楂汁的發(fā)酵環(huán)境中表現(xiàn)出了足夠快的代謝速度和增殖速度。

2.3 試驗(yàn)菌株在山楂果漿中的降酸效果

測(cè)定試驗(yàn)菌株發(fā)酵后在山楂果漿中的酸性指標(biāo)，見表1。

表1 試驗(yàn)菌株發(fā)酵后在山楂果漿中的酸性指標(biāo)Table 1 Acid index of test strains in hawthorn pulp after fermentation

由表1 可以看出，菌株發(fā)酵后，山楂果漿的總酸含量變化并不明顯，而pH值均高于對(duì)照組，表明發(fā)酵過程中微生物促使新的有機(jī)酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。通常情況下，乳酸菌發(fā)酵代謝會(huì)產(chǎn)生乳酸，這就說明乳酸對(duì)降酸有一定的影響。各菌株在山楂果漿中的降酸率如圖3所示。

圖3 試驗(yàn)菌株在山楂果漿中的降酸效果Figure 3 The acid lowering effect of the test strains in the hawthorn fruit pulp

由圖3 可知，植物乳桿菌和檸檬明串株菌的降酸率依然最好，可能因?yàn)檫@兩種菌在山楂果漿中具有生長優(yōu)勢(shì)，對(duì)山楂果漿中的檸檬酸具有較好的轉(zhuǎn)化作用。

2.4 菌數(shù)降酸率響應(yīng)面試驗(yàn)

選取菌株G5檸檬明串株菌進(jìn)行降酸響應(yīng)面試驗(yàn)研究，通過單因素試驗(yàn)，分別選取發(fā)酵溫度（A），發(fā)酵時(shí)間（B），菌株接種量（C），并以降酸率（Y）為響應(yīng)值。通過Box-Behnken法進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，各因素水平見表2。

表2 菌數(shù)降酸率響應(yīng)面因素及水平Table 2 Factors and levels of acid reduction rate response surface of bacteria number

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果見表3，回歸方程方差分析見表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 3 Response surface test design table and results

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of the regression equations

通過Design-Expert 8.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了計(jì)算和分析，得出的三元二次回歸方程如下：降酸率=74.890 00+0.392 50×A-1.355 00×B-1.027 50×C-0.222 50×A×B-1.872 50×A×C-1.622 50×B×C-8.388 75×A2-5.268 75×B2-2.858 75×C2。

對(duì)于菌種降酸工藝優(yōu)化模型的P＜0.05，此回歸模型顯著，失擬項(xiàng)（P=0.136 1＞0.05）不顯著，決定系數(shù)為R2=0.998 7，RAdj2=0.997 1，表明該模型與試驗(yàn)擬合較好，可適用于分析乳酸菌種降酸工藝優(yōu)化。從表4 可以看出，菌種接種量（A），P＜0.05 對(duì)曲面的影響效果顯著；發(fā)酵時(shí)間（B），發(fā)酵溫度（C），交互項(xiàng)AC、BC（P＜0.000 1），對(duì)曲面的影響效果極顯著；二次項(xiàng)A2B2C2（P＜0.000 1）極顯著。從表中F 值可以得出各個(gè)因素對(duì)降酸率的影響次序?yàn)椋壕N接種量（A）＜發(fā)酵溫度（C）＜發(fā)酵時(shí)間（B）。

2.4.2 響應(yīng)面分析 各因素交互作用對(duì)降酸率的影響響應(yīng)面分析如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對(duì)降酸率的影響響應(yīng)面分析圖Figure 4 Response surface analysis diagram of the interaction of various factors on acid reduction rate

由圖4 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度、菌種接種量與發(fā)酵溫度的逐漸增加，降酸率呈現(xiàn)先上升再平緩下降的拋物線；菌種接種量與發(fā)酵時(shí)間的增加，使降酸率迅速下降，證明了這些交互作用的因素對(duì)降酸率影響較大，這與表4顯示結(jié)果相呼應(yīng)。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析，當(dāng)菌種接種量為4.9%，發(fā)酵時(shí)間59 h，發(fā)酵溫度28.2 ℃，此時(shí)降酸率可達(dá)75.117%。為了使試驗(yàn)操作更簡單易行，將最佳條件修正為：菌種接種量為5%，發(fā)酵時(shí)間60 h，發(fā)酵溫度28 ℃。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得此時(shí)降酸率可達(dá)75.11%，由此可證明該響應(yīng)面模型合理可靠。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過比較7 種菌株在檸檬酸培養(yǎng)基中的生長曲線及其在山楂果漿中的生長情況和降酸效果，篩選出了最適合降低山楂汁中檸檬酸的乳酸菌。之后對(duì)檸檬明串珠菌G5 的降酸情況進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，結(jié)果表明：發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵時(shí)間為60 h、菌株接種數(shù)量為5%的情況下，山楂汁降酸率均值達(dá)到75.11%。利用此項(xiàng)乳酸菌發(fā)酵工藝生產(chǎn)山楂汁，可以使山楂汁酸度降低，口味柔和。