石玉霞，曹旭婷，朱凱，耿磊，陳冬生

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蕪湖 241000）

超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1,SOD1）普遍存在于需氧生物體內(nèi)是一種結(jié)合Cu/Zn的酶，該酶的主要功能是催化超氧化物并在過(guò)氧化氫酶的作用下將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為氧氣和水[1]。氧化自由基（reactive oxygen species, ROS）是呼吸作用產(chǎn)生的一類(lèi)超氧自由基且該物質(zhì)的過(guò)度積累會(huì)引發(fā)細(xì)胞的損傷，最終引起生物體的衰老[2]。SOD1 作為生物體內(nèi)抗氧化酶系的重要成員，其通過(guò)與超氧陰離子直接結(jié)合將自由基（ROS）氧化成H2O2，從而維持細(xì)胞內(nèi)適宜的ROS 濃度，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用[2‐3]。

果蠅，又稱(chēng)黑腹果蠅隸屬于昆蟲(chóng)綱雙翅目果蠅科，其發(fā)育方式屬于完全變態(tài)發(fā)育，主要包括四個(gè)時(shí)期，即：卵→幼蟲(chóng)→蛹→成蟲(chóng)。果蠅具有遺傳背景清晰、易培養(yǎng)、繁殖快等優(yōu)點(diǎn)，為衰老的研究提供了便利[4]。此外，果蠅基因高度保守，為人類(lèi)衰老與發(fā)育生物學(xué)研究提供了一個(gè)理想的模型[5‐6]。

衰老是生物體內(nèi)基因和環(huán)境共同決定的一種生理現(xiàn)象，壽命是衡量衰老最直觀、確切的指標(biāo)，同一物種的最長(zhǎng)壽命相差不大[7‐8]。改變果蠅所處條件可以不同程度的延緩或加速衰老的進(jìn)程，例如降低溫度（20 ℃）培養(yǎng)可延長(zhǎng)果蠅壽命，而提高溫度（29℃）會(huì)加速衰老、縮短果蠅壽命[9]。目前關(guān)于衰老的假說(shuō)主要有氧化自由基學(xué)說(shuō)、端粒學(xué)說(shuō)、免疫學(xué)說(shuō)等[10‐11]。本研究主要涉及氧化自由基學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)闡述了細(xì)胞內(nèi)的氧化因子（如ROS）和抗氧化因子（如SOD1）含量不平衡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致前者的積累，進(jìn)而引起各種生物大分子氧化損傷，最終導(dǎo)致個(gè)體的衰老乃至死亡[12‐13]。

已有研究表明，SOD1 基因sod1在真核生物中高度保守[14]，該基因與多種疾病相關(guān)，如肌萎縮側(cè)索硬化、帕金森病、唐氏綜合癥[15‐17]。但目前關(guān)于sod1基因調(diào)控衰老的報(bào)道較少。本研究以果蠅為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)下調(diào)或上調(diào)sod1的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)果蠅的壽命，測(cè)量其攀爬能力，以揭示sod1與衰老及運(yùn)動(dòng)能力之間的相關(guān)性，希望為人類(lèi)衰老機(jī)制的研究提供有價(jià)值的分子資料。

材料與方法

1 果蠅品系

購(gòu)自Bloomington Drosophila Stock Center：野生型W1118(Bloomington 3605)；轉(zhuǎn)基因DNA（定點(diǎn)插入）工具株：{y1 v1P{nos-phiC31int.NLS}X;P{-CaryP}attP40（Bloomington 25709）；gal工具株：tub-gal4(Bloomington 5138)、tub-gal80ts(Blooming‐ton 7019)；購(gòu)自清華果蠅RNAi 品系庫(kù)：sod1-RNAi-THattp2（THU 3207）；實(shí)驗(yàn)室自制轉(zhuǎn)基因果蠅：ATBsod1P4K-GFP-sod1-3’UTR;UAS-attB-sod1-3’UTR。

2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DNA Polymeras、溴化乙錠（EB）、DNA 純化試劑盒、LB 固（液）體培養(yǎng)基、膠回收試劑盒、酚/氯仿、氨芐青霉素、dNTP（10 mmol/L）、RNase A酶、普通DNA 產(chǎn)物純化試劑盒等；體視顯微鏡、離心機(jī)、PCR 擴(kuò)增儀、恒溫水浴鍋、恒溫箱、搖床、紫外分光光度計(jì)、Sutter P97 拉針儀、顯微注射儀、酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡等。

3 果蠅重組載體構(gòu)建

使用Sequence Builder 軟件設(shè)計(jì)ATB-sod1P4KGFP-sod1-3’UTR、UAS-attB-sod1-3’UTR引 物（表1）并由生物公司合成；利用PCR 擴(kuò)增分別獲得目的基因sod1、3’UTR、GFP、sod1-P4K；再利用重疊PCR 獲得基因片段sod1‐3’UTR、GFP-sod1-3’UTR；經(jīng)過(guò)PCR 產(chǎn)物純化、DNA 與載體同時(shí)酶切、連接、菌液PCR、小提質(zhì)粒等步驟獲得以上兩個(gè)重組質(zhì)粒；最后，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及生物公司測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功后方可留種保存或繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 PCR 所用引物Tab. 1 Primers for PCR

將鑒定成功的質(zhì)粒菌液用含有氨芐的LB 液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，再利用大提質(zhì)粒的方法，提取高濃度、高純度的質(zhì)粒。

4 制備轉(zhuǎn)基因果蠅

通過(guò)顯微注射方法將得到的2 個(gè)質(zhì)粒載體，分別注射于工具果蠅（y1 w*P{nos--phiC31int.NLS}X;PBac{y+-attP-3B}VK00040，BDSC: 35568）新產(chǎn)的卵中。注射結(jié)束后的卵置于涂有酵母的平板中，然后將平板放于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)2 d 左右，待卵發(fā)育成蠕蟲(chóng)狀態(tài)，將其轉(zhuǎn)移至攪碎的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。最后，將其成蟲(chóng)與工具果蠅（w;sp/Cyo;bam△86/TM3）雜交，后代眼色為橘黃色的果蠅即為轉(zhuǎn)基因果蠅。

5 免疫組織化學(xué)染色

將ATB-sod1P4k-GFP-sod1-3’UTR轉(zhuǎn) 基 因 果 蠅腸道剖出并經(jīng)過(guò)固定、漂洗、封閉后加入含有GFP抗體的溶液置于4 ℃冰箱搖床搖晃過(guò)夜；第2 d 將組織經(jīng)漂洗后加入被熒光標(biāo)記的二抗溶液避光搖床搖晃3 h；而后對(duì)二抗進(jìn)行漂洗，最后將組織壓片后在熒光顯微鏡下觀察、拍片。

6 果蠅雜交

將tub-gal80ts；tub-gal4果蠅與UAS-sod1-RNAi-THattp2果蠅雜交，后代基因型tub-gal80ts；tubgal4＞UAS-sod1 RNAi即為全身性敲低sod1基因的果蠅；將UAS-attB-sod1-3’UTR轉(zhuǎn)基因果蠅與tubgal4果蠅雜交，后代表型為長(zhǎng)毛的即為全身性過(guò)表達(dá)sod1基因的果蠅。

7 果蠅壽命統(tǒng)計(jì)和爬行能力的檢測(cè)

收集羽化48 h 內(nèi)的果蠅并將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度：29 ℃），之后每2 d 為果蠅更換新的培養(yǎng)基，并記錄在此期間死亡的果蠅只數(shù)和死亡的天數(shù)，直至所有果蠅死亡；在壽命統(tǒng)計(jì)的第10 d、20 d 和30 d 分別進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試，實(shí)驗(yàn)步驟為：首先，在距離果蠅管子底部5 cm 處標(biāo)記刻度線，隨后將20 只果蠅轉(zhuǎn)入空管中并震蕩管壁，使果蠅全部落于管底，最后記錄15 s 內(nèi)爬過(guò) 5 cm 刻度線的果蠅只數(shù)并計(jì)算出其所占百分比；將所得壽命、運(yùn)動(dòng)能力數(shù)據(jù)輸入到軟件Graph prism 8 中，最后生成生存曲線圖、平均壽命柱狀圖及運(yùn)動(dòng)能力曲線圖。

結(jié) 果

1 重組載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因果蠅制備

首先，PCR 擴(kuò)增分別得到目的基因sod1（462 bp）、3’UTR（272 bp）、GFP（714 bp）（圖1A）和sod1基因4 kb 啟動(dòng)子（sod1P4k）（圖1B）。利用重疊PCR 擴(kuò)增得到sod1-3’UTR（734 bp）、GFPsod1-3’UTR（1448 bp）（圖1C）。片段純化后與載體（UAS和ATB）酶切，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化獲得UASsod1-3’UTR和ATB-sod1P4k-GFP-sod1-3’UTR兩 種果蠅轉(zhuǎn)基因載體。重組載體經(jīng)測(cè)序確認(rèn)構(gòu)建成功，經(jīng)顯微注射獲得兩種轉(zhuǎn)基因果蠅品系。

圖1 PCR 擴(kuò)增目的基因。A，PCR 擴(kuò)增sod1 編碼區(qū)、3’非翻譯區(qū)和GFP 編碼區(qū)；B，PCR 擴(kuò)增sod1 4kb 啟動(dòng)子；C，重疊PCR 擴(kuò)增sod1‐3’UTR、GFP‐ sod1‐3’UTRFig. 1 The target gene was amplified by PCR. A, PCR amplification of sod1, 3’UTR, GFP; B, PCR amplification of sod1P4K; C, overlap PCR amplifi‐cation of sod1‐3’UTR、GFP-sod1-3’UTR

2 sod1 表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)

轉(zhuǎn) 基 因 果 蠅ATB-sod1P4k-GFP-sod1-3’UTR細(xì)胞中GFP基因與sod1為融合表達(dá)，取轉(zhuǎn)基因果蠅的腸道，采用GFP 蛋白抗體對(duì)果蠅腸道進(jìn)行免疫熒光染色并拍照。利用GFP 特異性追蹤sod1表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，同時(shí)通過(guò)DAPI 染色定位細(xì)胞核。結(jié)果所示，sod1表達(dá)產(chǎn)物僅在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，在細(xì)胞核中不表達(dá)（圖2）。sod1表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)定位與其在細(xì)胞質(zhì)中承擔(dān)著清除自由基的功能相一致。

圖2 ATB‐sod1P4k‐GFP-sod1-3’UTR 轉(zhuǎn)基因果蠅腸道細(xì)胞中sod1 表達(dá)檢測(cè)。細(xì)胞核：DAPI 染色；細(xì)胞質(zhì)：GFP 抗體染色，箭頭顯示細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)；比例尺，10 μmFigure 2 Detection of sod1 expression in intestinal cells of transgenic fly with the genetype of ATB-sod1P4k-GFP-sod1-3’UTR. Nucleus: DAPI staining;Cytoplasm: GFP staining, the arrows show high expression in the cytoplasm; Scale bar, 10 μm

3 敲低sod1 表達(dá)顯著縮短果蠅的壽命

首先，通過(guò)雜交并低溫（18℃）培養(yǎng)獲得基因型為tub-gal80ts;tub-gal4＞UAS-sod1 RNAi的子代果蠅。gal80ts 是一種溫度敏感型蛋白，低溫下（18℃）與gal4蛋白結(jié)合并抑制其蛋白活性，高溫下（29℃）解除對(duì)gal4的抑制，從而允許gal4結(jié)合UAS位點(diǎn)，啟動(dòng)UAS下游基因的表達(dá)。tub-gal4＞UAS-sod1 RNAi基因型中：tub-gal4為廣譜表達(dá)（tub表示管家基因tubulin啟動(dòng)子），誘導(dǎo)UAS-sod1 RNAi產(chǎn)生全身型干擾sod1的表達(dá)。

然后，將剛羽化后果蠅tub-gal80ts;tub-gal4＞UAS-sod1 RNAi轉(zhuǎn)移至29℃下培養(yǎng)，分雌雄進(jìn)行壽命統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示：在29℃ 培養(yǎng)條件下，雄性親本tub-gal80ts;tub-gal4（對(duì)照組）平均壽命約為39.45 d（n=148），而tub-gal80ts;tub-gal4＞UAS-sod1 RNAi雄性果蠅平均壽命僅約為22.8 d（n=156）（圖3A）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組雄性果蠅平均壽命縮短了42.2%（P＜0.0001）。同樣條件下，雌性親本對(duì)照平均壽命約為39.13 d（n=165），sod1RNAi雌性果蠅平均壽命為33.8 d（n=147）（圖3B），平均壽命縮短了5.33 d（P＜0.01）。結(jié)果表明：敲低sod1顯著縮短果蠅壽命。

圖3 sod1 敲低對(duì)果蠅壽命的影響。A，雄性果蠅生長(zhǎng)曲線（左）和平均壽命統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（右）；B 雌性果蠅生存曲線（左）與平均壽命統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（右）；****，P＜0.0001；**，P＜0.01Fig. 3 The effect of sod1‐knocking down on the lifespan of flies. A, the survival curve of male flies (left) and statistical analysis of mean longevity (left); B, the survival curve of female flies (left) and statistical analysis of mean lon‐gevity (left); ****, P＜0.0001; **, P＜0.01

4 過(guò)表達(dá)sod1 基因顯著延長(zhǎng)果蠅壽命

首先，通過(guò)雜交獲得基因型為tub-gal4＞UASsod1-3’UTR的子代果蠅。然后，將其培養(yǎng)于29℃條件下，分雌雄進(jìn)行壽命統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示：雄性親本tub-gal4果蠅（對(duì)照組）平均壽命約為29.56 d，而sod1基因過(guò)表達(dá)組雄性果蠅平均壽命約為40.26 d（圖4A）。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組果蠅平均壽命延長(zhǎng)了36.2%（P＜0.0001）；同樣，雌性對(duì)照組果蠅平均壽命約為31.71 d，過(guò)表達(dá)組雌性果蠅平均壽命約為37.88 d（圖4B），后者比前者平均壽命延長(zhǎng)了6.17 d（P＜0.0001）。結(jié)果表明：無(wú)論雌雄，過(guò)表達(dá)sod1基因均可顯著延長(zhǎng)果蠅的壽命。

圖4 sod1過(guò)表達(dá)對(duì)果蠅壽命的影響。A，雄性果蠅生長(zhǎng)曲線（左）和平均壽命統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（右）；B 雌性果蠅生存曲線（左）與平均壽命統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（右）；****，P＜0.0001；**，P＜0.01Fig. 4 The effect of sod1 overexpression on the lifespan of flies. A, the survival curve of male flies (left) and statistical analysis of mean longevity (left); B, the survival curve of female flies (left) and statistical analysis of mean lon‐gevity (left); ****, P＜0.0001; **, P＜0.01

5 sod1 調(diào)控果蠅運(yùn)動(dòng)能力

果蠅的運(yùn)動(dòng)能力隨著其衰老程度的增加逐漸衰退[19]，因此運(yùn)動(dòng)能力可以反映其衰老的進(jìn)程。通過(guò)在培養(yǎng)管上設(shè)置標(biāo)志線，統(tǒng)計(jì)一段時(shí)間內(nèi)爬過(guò)刻度線的昆蟲(chóng)數(shù)量來(lái)檢測(cè)sod1敲低及過(guò)表達(dá)對(duì)果蠅運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果顯示：與對(duì)照組果蠅相比（圖5A、5B），敲低組雌、雄果蠅運(yùn)動(dòng)能力均顯著下降（P＜0.05）。反之，過(guò)表達(dá)組雌、雄果蠅運(yùn)動(dòng)能力均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）（圖5C、5D）。結(jié)果表明，sod1基因調(diào)控果蠅運(yùn)動(dòng)能力。

圖5 sod1 敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)果蠅攀爬力的影響。A 和B，sod1 敲低對(duì)雄性（A）和雌性（B）果蠅攀爬力的影響；C 和D，sod1 過(guò)表達(dá)對(duì)雄性（C）和雌性（D）果蠅攀爬力的影響；與tub‐gal80ts; tub‐gal4 組（A 和B）或tub‐gal4 組（C 和D）比較： *，P＜0.05Fig. 5 The effect of knockdown and overexpression of sod1 on the climbing ability of Drosophila. A and B, the effect of knockdown of sod1 on the climbing ability of male (A) and female (B) Drosophila; C and D, the effect of sod1 overexpression on the climbing ability of male (C) and female (D)Drosophila; *, P＜0.05, compared with tub‐gal80ts; tub-gal4 group (A and B) or tub‐gal4 group (C and D)

討 論

SOD 作為生物體內(nèi)抗氧化酶系的重要成員，可以通過(guò)氧化ROS，維持機(jī)體氧化系統(tǒng)和還原系統(tǒng)的平衡[20]，從而保護(hù)機(jī)體。目前共發(fā)現(xiàn)3 種SOD 基因，即sod1和sod3（編碼結(jié)合Cu/Zn 離子的SOD蛋白）和sod2（編碼結(jié)合Mn 離子的SOD 蛋白）。sod1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，sod2定位于線粒體基質(zhì)，sod3分泌至細(xì)胞外發(fā)揮功能[21‐22]。本文通過(guò)構(gòu)建ATB-sod1P4K-GFP-sod1-3’UTR轉(zhuǎn)基因果蠅，以腸道為研究對(duì)象檢測(cè)sod1的亞細(xì)胞定位，免疫熒光染色結(jié)果提示sod1可能僅在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能。

Phillips 等報(bào)道，利用甲基磺酸乙酯誘變果蠅獲得Cu/Zn‐SOD（sod1編碼）缺失突變體，發(fā)現(xiàn)雄性果蠅的平均壽命顯著縮短，并且增強(qiáng)了對(duì)白葉枯的敏感性[23]。Fleming 等報(bào)道，將牛Cu/Zn‐SOD 的cDNA通過(guò)顯微注射制備轉(zhuǎn)基因果蠅，高表達(dá)牛SOD 蛋白果蠅的平均壽命顯著延長(zhǎng)，同時(shí)證明了sod的高度保守特性[24]。黃曉峰等在飼料中添加SOD 酶能顯著延長(zhǎng)雌雄果蠅的平均壽命[11]。本研究利用RNAi 干擾技術(shù)，獲得sod1敲低果蠅品系；同時(shí)利用顯微注射方法制備sod1轉(zhuǎn)基因果蠅。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低sod1可以顯著縮短雄性、雌雄果蠅的壽命且運(yùn)動(dòng)能力均會(huì)發(fā)生明顯的下降，過(guò)表達(dá)sod1可顯著延長(zhǎng)雄性、雌性果蠅壽命并展現(xiàn)出更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。上述結(jié)果與前人sod1突變體結(jié)果相一致，也表明sod的功能無(wú)性別差異。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是敲低sod1或是過(guò)表達(dá)sod1，雄性果蠅壽命變化程度都更加顯著，雌性果蠅則展現(xiàn)出相對(duì)溫和的變化。我們推測(cè)這種不同，可能是由于雌性果蠅體內(nèi)有更多的激素參與了果蠅的衰老，從而減弱了sod1對(duì)果蠅衰老的調(diào)控。