林婷，吳在增，康福，溫虹，周冬梅

（福建醫(yī)科大學(xué)腫瘤臨床醫(yī)學(xué)院，福建省腫瘤醫(yī)院，福州 350012）

普魯士藍(lán)反應(yīng)（Perls）是經(jīng)典的組織化學(xué)反應(yīng)，可用于識別3價(jià)鐵離子。血紅蛋白被巨噬細(xì)胞吞噬后經(jīng)溶酶體降解釋放出的3 價(jià)鐵離子與蛋白結(jié)合后形成金黃色的顆粒，稱含鐵血黃素。含鐵血黃素染色是病理診斷技術(shù)中常用到的方法，應(yīng)用Perls 反應(yīng)和復(fù)染液襯染，可以顯示和證明組織內(nèi)3 價(jià)鐵離子的存在及各種出血性病變。在實(shí)際工作中由于缺乏統(tǒng)一的指導(dǎo)意見，不同的實(shí)驗(yàn)室采用不同的復(fù)染液進(jìn)行染色，導(dǎo)致染色結(jié)果參差，不利于診斷。本實(shí)驗(yàn)對3 種常用的復(fù)染液, 核固紅、中性紅和伊紅復(fù)染液在含鐵血黃素染色中的染色情況進(jìn)行對比，分析各自的特點(diǎn)，以期為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供參考。

材料與方法

1 材料

收集福建省腫瘤醫(yī)院病理科標(biāo)本組織，均已明確含鐵血黃素陽性，其中，肝臟組織、肺組織、胃組織、乳腺組織各1 例。含鐵血黃素染色試劑盒購自福州邁新公司，主要包括亞鐵氰化鉀染液，促染劑。核固紅（上海化學(xué)試劑廠），中性紅（上海試劑三廠），硫酸鋁鉀（永大試劑），伊紅（上海國藥）。

2 方法

2.1 試劑配制

根據(jù)病理技術(shù)相關(guān)專業(yè)書籍中的介紹[1]，選用3 種復(fù)染液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括0.1%核固紅、0.5%中性紅、1%伊紅。0.1%核固紅溶液：5 g 硫酸鋁鉀溶于100 mL 蒸餾水中配制5%硫酸鋁鉀水溶液，再加入0.1 g 核固紅，加溫至充分溶解后冷卻至室溫使用。0.5%中性紅：稱取1 g 中性紅粉劑，加入200 mL 蒸餾水中，攪拌至充分溶解，室溫放置備用。1%伊紅：將1 g 伊紅加入到100 mL 的95%乙醇中充分溶解，加入1‐2 滴冰醋酸后室溫保存。

2.2 染色方法

常規(guī)脫水、石蠟包埋的組織塊，每例標(biāo)本切5片，厚度為4μm；常規(guī)脫蠟至水，并用蒸餾水充分沖洗；將亞鐵氰化鉀染液和促染劑等量混合，現(xiàn)配現(xiàn)用；滴加配好的亞鐵氰化鉀和促染劑混合染液，充分覆蓋組織并孵育15 min；蒸餾水沖洗3 遍；分別用0.1%核固紅、0.5%中性紅、1%伊紅孵育切片10 min；核固紅與中性紅染色的切片經(jīng)蒸餾水沖洗后風(fēng)干直接封片，伊紅染色的切片放入梯度酒精脫水（每一級各10 s），二甲苯透明，中性樹膠封片。

結(jié) 果

以不同復(fù)染液染色后觀察切片染色效果，在4種組織中觀察到的染色效果一致：核固紅組細(xì)胞核呈淡紅色，含鐵血黃素呈深藍(lán)色，二者顏色對比較強(qiáng)；中性紅組顏色艷麗，定位細(xì)胞核，普魯士藍(lán)呈藍(lán)灰色，顏色對比好；伊紅組顏色鮮艷，定位細(xì)胞質(zhì)，HE 形態(tài)可見，對比度較弱。圖1 所示為肺組織切片染色效果。

圖1 3 種復(fù)染液在肺組織上的染色效果比較。A，0.1%核固紅溶液；B，0.5%中性紅；C，1%伊紅。比例尺，100 μmFig. 1 Comparison of the staining effects of three counterstaining solutions on lung tissue. A, 0.1% nuclear fast red; B, 0.5% neutral red; C, 1% eosin.Scale bar, 100 μm

討 論

常規(guī)HE 切片在鏡下觀察到棕色色素但尚不能明確其來源時(shí)，可行含鐵血黃素染色進(jìn)行鑒別[2]。含鐵血黃素染色多用于顯示組織中鐵離子的存在，對貧血及出血性疾病的診斷有益，但對腫瘤診療的指導(dǎo)作用不大。近年來隨著對鐵代謝研究的深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)為鐵代謝及鐵死亡與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，檢測鐵的表達(dá)在腫瘤診斷和治療中的作用逐漸顯露。Kim 等[3]提出鐵死亡是腫瘤微環(huán)境中病理性激活的中性粒細(xì)胞的一種獨(dú)特且可靶向的免疫抑制機(jī)制，可以通過藥理學(xué)調(diào)節(jié)來限制腫瘤進(jìn)展。Behrouz Hassannia 等[4]認(rèn)為可通過靶向鐵死亡治療癌癥。陳菲等[5]將普魯士藍(lán)與油紅O套染建立鐵死亡模型以研究鐵死亡中鐵離子與脂質(zhì)的關(guān)系。因此對含鐵血黃素染色的方法進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范，指導(dǎo)病理技師在日常工作及科學(xué)研究中更加高效制出精良的切片，就有了更大的意義。

本研究中，核固紅復(fù)染細(xì)胞核定位清晰，顏色淡紅，與普魯士藍(lán)對比度好。研究選用李莉等[6]推薦的配置方法，用0.5%硫酸鋁鉀水溶液配制0.1%核固紅，切片染色效果好，核固紅用量較少，配制成本較低，硫酸鋁鉀為病理科常用試劑，用于蘇木素染液配制，獲取方便。中性紅復(fù)染使細(xì)胞核呈紅色，顏色亮麗，普魯士藍(lán)呈藍(lán)灰色，對比明顯。中性紅使用蒸餾水配制，操作簡單。伊紅復(fù)染可顯示細(xì)胞質(zhì)、紅細(xì)胞與肌肉，無法顯示細(xì)胞核，與普魯士藍(lán)對比較弱，復(fù)染后需經(jīng)酒精分化，步驟較為繁瑣。綜合比較三種復(fù)染液，推薦使用0.1%核固紅進(jìn)行復(fù)染，染色對比效果更佳。

普魯士藍(lán)反應(yīng)是利用酸化的亞鐵氰化鉀與三價(jià)鐵反應(yīng)生成不溶解的藍(lán)色化合物，反應(yīng)式為 4FeCl3+3K4Fe(CN)6→Fe4［Fe(CN)6］3+12KCl。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意等比例混合亞鐵氰化鉀與鹽酸水溶液，染色過程避免使用金屬鐵制品和容器，使用蒸餾水沖洗，防止自來水中的鐵離子與組織中的鈣鹽結(jié)合產(chǎn)生假陽性結(jié)果。需注意的是，染液的溫度和反應(yīng)的溫度都會影響反應(yīng)的進(jìn)行及染色結(jié)果的觀察?？梢岳梦⒉訜?，縮短鐵氰化鉀與鹽酸的反應(yīng)時(shí)間，加快染色速度，但也有實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為反應(yīng)過程中加熱會導(dǎo)致切片和組織上出現(xiàn)細(xì)小的藍(lán)色沉淀[1]，不利于診斷。因此，染色前準(zhǔn)備中染液的復(fù)溫就顯得格外重要。筆者在日常工作中發(fā)現(xiàn)，核固紅的溶解度較差，配制后置于4℃冰箱保存，使用前若僅置于室溫復(fù)溫則不易上色，延長染色時(shí)間則制片效率降低，且染色效果較差。于是筆者將核固紅染液置于4℃冰箱保存1 周后分別在室溫和37℃溫箱進(jìn)行復(fù)溫比較，發(fā)現(xiàn)同樣復(fù)溫1h 的情況下，37℃溫箱復(fù)溫的染色效果較室溫復(fù)溫染色效果好，顏色較為艷麗，對比度好。推薦在實(shí)驗(yàn)前將核固紅染液置于37℃溫箱復(fù)溫1h，可提高核固紅著色效果。

綜上所述，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，0.1%核固紅染液復(fù)染含鐵血黃素，顏色對比度較好，效果更佳。