紀(jì)燕英，高錦添，王德玉

（中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科，廣州 510000）

肺腺癌是較常見的一類肺癌，起源于氣管、支氣管黏膜或腺體最常見肺部疾病的一類惡性腫瘤，有一定的遺傳易感性[1‐2]。其高死亡率可歸因于晚期診斷。早期肺腺癌預(yù)后較好，但患者無特殊癥狀，難以及時發(fā)現(xiàn)并引起重視。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高肺腺癌患者生存率的關(guān)鍵，因此探尋高效的肺腺癌檢查診斷方式，提升肺腺癌早期確診率仍是臨床研究的重要課題。

矮小同源盒基因2（dwarf homeobox gene,SHOX2）和RAS 相關(guān)區(qū)域家族1A（RAS related region family 1A, RASSF1A）啟動子的異常甲基化已被驗證為診斷早期肺腺癌的一對有價值的生物標(biāo)志物[25]。既往國內(nèi)外報告多使用肺結(jié)節(jié)穿刺標(biāo)本及支氣管肺泡灌洗液作為研究對象，結(jié)果均提示侵襲性病變中的SHOX2 和RASSF1A 啟動子甲基化程度均明顯高于非侵襲性病變[15,20]。另一方面，胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的SHOX2、RASSF1A 臨床數(shù)據(jù)卻非常有限。相比肺活檢穿刺術(shù)和支氣管肺泡灌洗術(shù)，胸水標(biāo)本采集顯然創(chuàng)傷性更小、安全性更高、可重復(fù)操作。因此，本研究擬將可疑肺腺癌患者作為干預(yù)對象，比較良性病變和肺腺癌間可疑惡性胸水的胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本SHOX2、RASSF1A 基因甲基化結(jié)果差異，并且聯(lián)合細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果，旨在探析兩項指標(biāo)在肺腺癌病情預(yù)測診斷中的應(yīng)用，以期為肺腺癌臨床檢查診斷方式的選擇提供參考依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料與標(biāo)本

選擇2022 年1 月—2022 年12 月，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院送檢的80 例胸水標(biāo)本作為研究對象，按胸部CT、X 線、磁共振或病理學(xué)檢查結(jié)果的不同分為觀察組（40 例，可疑肺腺癌）和對照組（40 例，良性病變）。觀察組，男:女=24:16，年齡29～83歲，平均66.4 歲；對照組，男:女=32:8，年齡21～91歲，平均60.6 歲，病癥類型肺結(jié)核:肺炎:占位腫物=4:18:20。

2 肺腺癌篩查標(biāo)準(zhǔn)

符合《肺癌篩查與管理中國專家共識》[7]中肺腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，有胸痛、咳嗽、咯血等癥狀，胸部CT、X 線、磁共振及病理學(xué)檢查提示肺腺癌。

3 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②既往或目前胸部CT、X 線、磁共振或病理學(xué)檢查（細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)）提示肺癌；③基本資料齊全。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有全身免疫性疾病、精神疾病；②存在嚴(yán)重感染性、傳染性疾??；③合并其他呼吸道疾?。ㄈ缱儺愋韵?、支氣管狹窄等）。

4 方法

4.1 試驗設(shè)備、試劑

BD CytoRich 樣本保存液，碧迪公司；CK7、TTF‐1、NapsinA、WT1、P40、CK5/6 即用型抗體，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；全自動免疫組化染色系統(tǒng)，美國羅氏，型號BenchMark ULTRA；醫(yī)用離心機(jī)，珠海順皓生物科技有限公司，型號H1650‐W；全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng),上海宏石醫(yī)療科技有限公司,型號SLAN‐96S；LifeECO 基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司,型號TC‐96/G/H(b)C；熒光計，杭州奧盛儀器有限公司，型號Fluo‐100B；細(xì)胞保存液，上海透景生命科技股份有限公司；核酸抽取或純化試劑盒，上海透景生命科技股份有限公司；人SHOX2、RASSF1A 基因甲基化DNA 試劑盒測試劑盒（PCR 熒光法），上海透景生命科技股份有限公司

4.2 指標(biāo)檢測

采集胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本：收集50 ～100 mL 胸水，其中20 mL 胸水加入細(xì)胞保存液，剩余胸水離心處理（10 min，2000 r/min）并去除上清液后加入20 mL BD 樣本保存液；如果不能立即檢測，樣本保存于2‐8°冰箱；

細(xì)胞學(xué)染色：去上清液后的細(xì)胞沉渣進(jìn)行液基細(xì)胞染色檢測操作及細(xì)胞蠟塊的制作，并進(jìn)行巴氏、HE 染色，必要時加做免疫組織化學(xué)染色協(xié)診；

液基細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞蠟塊及免疫組化病理診斷：有兩名經(jīng)驗豐富的高年資病理醫(yī)生診斷。

甲基化DNA 提?。弘x心處理（10 min，2000 r/min）并去除上清液，每份樣本均可見芝麻大小沉淀物，細(xì)胞沉淀物采用DNA 提取試劑（離心柱形），離心、洗滌處理（嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作），收集DNA。

亞硫酸鹽修飾：取20 μL DNA 樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)化、洗滌及DNA 修復(fù)處理（嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作），修飾后DNA 立即用于檢測；

甲 基 化 檢 測： 用 人SHOX2、RASSF1A 基因甲基化DNA 試劑盒測試分析修飾后DNA。修飾后基因測序引物為SHOX2 上游5’‐GGT‐GTTGTGTCGTATAGGGAGT‐3’、 下 游5’‐TC‐CGCCTCCTACCTTCTAAC‐3’；RASSF1A 上游5’‐GAGGGAAGGAAGGGTAAGG‐3’、 下 游5’‐GAGGGAAGGAAGGGTAAGG‐3’。進(jìn)行實時熒光定量PCR 檢測，PCR 反應(yīng)體系：PCR 反應(yīng)液15（n+2）μL 與DNA 聚合酶0.3（n+2）μL（n 代表樣本數(shù)量）混勻后取15 μL 及5 μL DNA 樣本加入反應(yīng)管，顛倒混勻、瞬時離心；擴(kuò)增程序：第1 階段95 ℃ 10 min，1 個循環(huán)，第2 階段95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，5 個循環(huán)，第3 階段95 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；信號收集。

陽性判讀值：FAM 熒光信號的擴(kuò)增曲線為光滑的“S”形，且Ct 值＜35，提示RASSF1A 基因甲基化陽性；VIC（或HEX）熒光信號的擴(kuò)增曲線為光滑的“S”形，且Ct 值＜32，提示SHOX2 基因甲基化陽性；用△Ct 法計算SHOX2、RASSF1A 甲基化表達(dá)水平，△Ct 值越低，基因甲基化水平越高。

5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用%表示組間行χ2檢驗；計量資料符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；Logistic 回歸分析SHOX2、RASSF1A 甲基化與肺腺癌病情的關(guān)系；繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌病情診斷中的應(yīng)用。P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組細(xì)胞學(xué)病理診斷結(jié)果

觀察組中可疑惡性胸水液基巴氏染色及細(xì)胞蠟塊HE 染色片中找到腺癌細(xì)胞或核異質(zhì)細(xì)胞，結(jié)合細(xì)胞蠟塊免疫組織化學(xué)染色napsinA (+)、TTF‐1 (+)、CK7 (+)、WT1 (‐)，證實為肺腺癌（圖1）。

圖1 肺腺癌胸水液基巴氏、細(xì)胞蠟塊HE 染色與免疫組織化學(xué)表型。A；液基巴氏染色；B，細(xì)胞蠟塊HE 染色；C，napsinA ；D，TTF‐1 ；E，CK7 ；F，WT1；箭頭，腺癌細(xì)胞；比例尺，50 μmFig. 1 Liquid based Pap staining of lung adenocarcinoma pleural fluid, HE staining of cell wax block and immunohistochemical phenotype. A, liquid based Pap staining; B, cell wax block HE staining; C, napsin A ; D, TTF‐1 ; E, CK7 ; F, WT1; arrows, adenocarcinoma cells; scale bar, 50 μm

對照組中良性胸水液基巴氏染色及細(xì)胞蠟塊HE 染色中未見確切癌細(xì)胞，結(jié)合細(xì)胞蠟塊免疫組織化學(xué)染色napsin A(‐)、TTF‐1(‐)、CK5/6 (散在+)、P40(‐)，證實胸水為良性病變（圖2）。

圖2 良性胸水液基巴氏、細(xì)胞蠟塊HE 染色與免疫組織化學(xué)表型。A，液基巴氏染色；B，細(xì)胞蠟塊HE 染色；C，napsinA；D，TTF‐1；E，CK5/6；F，P40；比例尺，50 μmFigure 2 Liquid based Pap staining of benign pleural fluid, HE staining of cell wax block and immunohistochemical phenotype. A, liquid based Pap staining; B, cell wax block HE staining; C, NapsinA; D, TTF‐1; E, CK5/6; F, P40; scale bar, 50 μm

2 比較兩組的SHOX2、RASSF1A 基因甲基化檢測情況

觀察組的SHOX2、RASSF1A 基因甲基化檢測值低于對照組（表1）。

表1 比較兩組的SHOX2、RASSF1A 基因甲基化檢測值Tab. 1 Comparison of SHOX2 and RASSF1A gene methylation detection values between two groups

3 肺腺癌的多因素Logistic 回歸分析

視臨床或病理學(xué)檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，觀察組診斷為肺腺癌，患者的性別、年齡，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 觀察組SHOX2、RASSF1A 表達(dá)水平的比較Tab. 2 Comparison of the expression levels of SHOX2 and RASSF1A in the observation group

以SHOX2、RASSF1A 甲基化表達(dá)水平為自變量，連續(xù)變量；將觀察組甲基化結(jié)果作為因變量，進(jìn)行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，SHOX2、RASSF1A甲基化高表達(dá)是肺腺癌危險因素（表3）。

表3 SHOX2、RASSF1A 甲基化與肺腺癌病情的Logistic 回歸分析Tab. 3 Logistic regression analysis of SHOX2, RASSF1A methylation and lung adenocarcinoma status

4 SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌病情診斷中的效能分析

以肺腺癌病情診斷結(jié)果為自變量，以SHOX2、RASSF1A 甲基化表達(dá)水平為因變量，繪制ROC 曲線（圖3）。分析結(jié)果顯示，SHOX2、RASSF1A甲基化聯(lián)合預(yù)測肺腺癌病情結(jié)果的AUC（0.821，95%CI:0.727～0.915）最大，敏感度、特異性分別為87.5%、97.5%（表4）。

圖3 SHOX2、RASSF1A 和兩者組合甲基化與肺腺癌病情診斷價值的Roc 曲線Fig.3 Roc curve of SHOX2, RASSF1A, and their combination methylation in the diagno‐sis of lung adenocarcinoma

表4 SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌病情診斷中的效能分析Tab. 4 Effectiveness analysis of SHOX2 and RASSF1A methylation in the diagnosis of lung adenocarcinoma

5 比較兩組的甲基化結(jié)果與細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果

以SHOX2、RASSF1A 基因甲基化，其中一項或兩項陽性可判斷總甲基化為陽性，細(xì)胞學(xué)則以有無腫瘤細(xì)胞為診斷結(jié)果，設(shè)定其見腫瘤細(xì)胞為陽性，未見腫瘤細(xì)胞為陰性；計算兩組總甲基化結(jié)果與細(xì)胞學(xué)診斷符合率；結(jié)果顯示，觀察組中細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果與總甲基化結(jié)果的符合率（80%），對照組中細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果與總甲基化結(jié)果的診斷符合率（72.5%）（表5）。

表5 兩組總甲基化結(jié)果與細(xì)胞學(xué)診斷符合率Tab. 5 Compliance rate between total methylation results and cytological diagnosis in two groups

討 論

目前肺腺癌的具體病因尚未明確，早發(fā)現(xiàn)是提高存活率的基礎(chǔ)，低劑量胸部計算機(jī)斷層掃描（LDCT）篩查可早期發(fā)現(xiàn)肺癌，但LDCT 特異性較差，影像學(xué)檢測到的肺小結(jié)節(jié)中，多為良性結(jié)節(jié)，鑒于病理學(xué)是診斷肺腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，影像學(xué)結(jié)果往往易滯后、誤診；而開發(fā)高效、高敏感性、高特異性的檢測方法以提高肺腺癌的診斷率及準(zhǔn)確率是非常有必要的。DNA 甲基化是一種相對穩(wěn)定的表觀遺傳改變，經(jīng)常發(fā)生在腫瘤發(fā)生的早期階段。較早期的研究已發(fā)現(xiàn)肺癌患者血漿中DNA 甲基化甲程度明顯高于良性肺結(jié)節(jié)患者[14]，但高甲基化也常常會發(fā)生在其他多種腫瘤如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌和結(jié)腸直腸癌的血漿中[24]，因此肺穿刺活檢標(biāo)本、支氣管肺泡灌洗液、胸水標(biāo)本的基因甲基化檢查更有助于肺癌的診斷。胸水標(biāo)本取樣不僅操作簡單、患者接受度高，基層醫(yī)院也可以進(jìn)行，更重要的是還可以作為肺腺癌患者治療后隨訪復(fù)查的連續(xù)性檢查手段。本研究數(shù)據(jù)顯示，觀察組可疑肺腺癌患者胸水SHOX2、RASSF1A 基因甲基化程度高于對照組，是肺腺癌的危險因素，與既往肺穿刺活檢和支氣管肺泡灌洗液結(jié)果基本一致[17,20]，說明可疑肺腺癌患者胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本SHOX2、RASSF1A 基因甲基化檢查也可為肺腺癌的臨床診斷及病情預(yù)測提供重要參考。

既往多個研究顯示SHOX2、RASSF1A基因甲基化肺癌診斷中特異性均高于90%，甚至接近100%，但在不同肺癌病理類型中敏感性有差異，其中肺腺癌敏感性較小細(xì)胞肺癌、肺鱗癌低，只有68.8～69.6%（支氣管肺泡灌洗液）和77.78%（肺穿刺石蠟標(biāo)本）[23,24,26]。本研究利用胸水標(biāo)本檢測，在病情預(yù)測診斷方面，SHOX2、RASSF1A 基因甲基化表達(dá)水平變化可能與肺腺癌的病情發(fā)展有密切聯(lián)系；高敏感度及特異性原因可能與檢測標(biāo)本取材方式以及細(xì)胞完整度有關(guān)。肺泡灌洗液在沖刷過程中可能令異型細(xì)胞破壞，導(dǎo)致離心后DNA 含量降低；而肺穿刺活檢小標(biāo)本受更多因素影響，如病灶的大小和位置、操作者技術(shù)水平、患者配合度等等。另一方面，本研究觀察組總甲基化結(jié)果與細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果符合率80%，高于國內(nèi)文獻(xiàn)66.67%[27]，原因可能是肺腺癌異質(zhì)性較大，統(tǒng)計結(jié)果容易受樣本細(xì)胞含量影響。胸腔積液穿刺術(shù)屬于基礎(chǔ)操作，能得到更均質(zhì)化的細(xì)胞標(biāo)本，這一系列可側(cè)面提示胸水SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測作為有效補充手段可行性較高。

對于細(xì)胞學(xué)結(jié)果與總甲基化結(jié)果不相符的患者，臨床也應(yīng)高度重視；如果是細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果為陰性而總甲基化結(jié)果為陽性的患者，則需要提前預(yù)警和密切隨訪，尤其是病情較為復(fù)雜或不明顯的情況，可考慮穿刺活檢進(jìn)行組織病理學(xué)檢查以免漏診或誤診；細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果為陽性而總甲基化結(jié)果為陰性的患者，可多次行甲基化檢查，以排除假陰性可能。

盡管靶向治療和免疫治療方面已取得進(jìn)展，但化療仍為肺癌治療最有效的方法。有研究表示，大多數(shù)化療藥物對基因甲基化有促進(jìn)作用，RASSF1A 基因是具有預(yù)測化療價值的的一項有利指標(biāo)[21]；在肺腺癌中，SHOX2 基因高表達(dá)或低甲基化提示患者易復(fù)發(fā)、分化程度低、預(yù)后差[22]。 SHOX2、RASSF1A兩基因聯(lián)合檢測，可以幫助臨床更精準(zhǔn)及時地了解療效，更早發(fā)現(xiàn)疾病預(yù)后發(fā)展情況，盡早調(diào)整治療方案。

本研究當(dāng)前存在一定的局限性。首先，研究樣本數(shù)量相對較小，研究結(jié)論存在一定誤差，還需更多患者的研究數(shù)據(jù)來驗證、優(yōu)化結(jié)果；其次，未對不同類型的肺腺癌患者進(jìn)一步分組對比，且尚未證實胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本SHOX2、RASSF1A 甲基化在不同類型肺腺癌預(yù)測診斷中的廣泛效力；最后，本研究未對患者疾病進(jìn)行后續(xù)跟蹤隨訪。

綜上所述，SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌胸水中呈高表達(dá)，可為肺腺癌的臨床診斷及病情預(yù)測提供重要參考，也作為細(xì)胞學(xué)病理診斷上的補充，提高早期肺腺癌診斷的準(zhǔn)確率。SHOX2、RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測可作為一項快捷、有效的新興無創(chuàng)傷性輔助檢測指標(biāo)，可在各級醫(yī)院中廣泛使用。