孫肖振，陳冬霞，郭文睿，安玲玉，石鎮(zhèn)銘，劉宇恒，賀陽，文連奎

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

花青素是存在于葡萄、藍莓、紫甘藍等果蔬的水溶性多酚類天然色素[1-3]，基本結構單元為3，5，7－三羥基-2-苯基并吡喃，其3、5、7位上的羥基可以與一個或多個單糖（葡萄糖、半乳糖等）、二糖（蕓香糖等）或三糖等連接[4]，多以糖苷鍵形式存在，故又稱花色苷[5]?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、抗癌、降脂減肥及調節(jié)腸道菌群等功效[6-7]，但由于骨架上多個酚羥基的存在，使花青素易受溫度、光照、pH值、氧氣、抗壞血酸、金屬離子等影響，出現褪色、變色、沉淀等現象，使其穩(wěn)定性和生理活性降低，限制了花青素的應用，因此，提高花青素的穩(wěn)定性尤為重要[8]。

近年來，提高花青素穩(wěn)定性的研究已成為食品領域的研究熱點，主要方法有微膠囊法、糖基?；蚺c生物大分子之間通過相互作用形成復合物[9-13]。在花青素中添加蛋白質、淀粉、膳食纖維、果膠等大分子，通過氫鍵、疏水、金屬配位、π-π堆積、靜電和共價鍵相互作用與大分子結合[14]，形成較穩(wěn)定的結構，可以起到對花青素的保護作用。

大豆不溶性膳食纖維（soybean insoluble dietary fiber，SIDF）含量約占豆渣（大豆榨油和傳統豆制品加工主要副產物）干物質的45%，可占大豆豆渣總膳食纖維的90%。有研究表明膳食纖維能夠與多酚類物質相互作用，提高其穩(wěn)定性[15-16]。本文構建花青素純化物（purified anthocyanins，ACN）與SIDF穩(wěn)定體系并進行評價，以期為花青素穩(wěn)定性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山葡萄（品種為“北冰紅”）：通化市柳河縣山葡萄產業(yè)服務中心；豆渣：山東嘉華保健品公司。

乙酸、乙醇、鹽酸（均為分析純）：北京化工廠；D101大孔樹脂（分析純）：天津市光復精細化研究所；高峰α-淀粉酶（40 000 U/g）、中性蛋白酶（60 000 U/g）、淀粉葡萄糖苷酶（100 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉（均為食品級）：江蘇瑞多生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

數顯恒溫磁力攪拌器（HJ-3B）：博納科技有限公司；紫外可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限責任公司；電子分析天平（CPA-125）：德國Sartourius公司；真空冷凍干燥機（LG0.2）：新陽速凍設備制造有限公司；離心機（KL04-A）：美國Agilent公司；高速冷凍離心機（JXN-26）：美國MARCAREG有限公司；電熱恒溫水浴鍋（H.HS21.6）：上海醫(yī)療器械三廠；pH計（PHS-3D）：上海精科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預處理

1.3.1.1 ACN的制備

參考賀陽[17]的方法制備ACN。山葡萄500 g打漿，用65%乙醇-1%鹽酸提取劑進行提取[提取液：山葡萄液料比 5∶1（mL/g）]，在 55℃下以 100 r/min振蕩30 min后，收集上清液，在45℃～50℃進行減壓濃縮得到花青素粗提物?；ㄇ嗨卮痔嵛锿ㄟ^D101大孔樹脂進行純化，洗脫速率為1.5 BV/h，洗脫劑為75%乙醇-0.01%鹽酸。洗脫后的液體在45℃～50℃進行減壓濃縮后得到花青素純化物。采用pH示差法測定ACN（總花青素含量）≥25%。

1.3.1.2 SIDF的制備

參照Wang等[18]方法制備SIDF。取干豆渣10 g，加入蒸餾水進行稀釋，料液比為1∶50（g/mL），然后進行連續(xù)的酶消化，首先加入1 mL熱穩(wěn)定的α-淀粉酶（0.25 g/mL），在 95℃～100℃條件下水浴 35 min，然后加入3 mL中性蛋白酶（0.125 g/25 mL），60℃水浴振蕩30 min后，加入100 mL乙酸溶液（3 mol/L）調節(jié)pH值至4.5，最后加入4 mL淀粉葡萄糖苷酶（0.25 g/12.5 mL）進行30 min酶解。酶解完成后加入70℃蒸餾水靜置2 h，在3 500 r/min條件下離心20 min，用5倍體積的95%乙醇沉淀12 h后進行真空抽濾，殘留物進行冷凍干燥。選用100目～500目篩網對SIDF進行過篩，獲取不同粒徑的SIDF。

1.3.2 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構建流程

將適量ACN與SIDF按一定質量比，用pH3.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100 mL（最終總花青素含量為12 mg/100 mL），按試驗設計構建ACN-SIDF穩(wěn)定體系，未經穩(wěn)定處理的ACN溶液為對照。以吸光度和沉淀離心率為指標評價體系穩(wěn)定效果。測定溶液沉淀30 min后在最大吸收波長521 nm處吸光度；同時稱量離心管的質量，量取5 mL穩(wěn)定溶液，加入離心管中，常溫下6 000 r/min離心20 min，離心后倒掉上層液體，再將離心管倒置5 min后稱重，按照下列公式測定穩(wěn)定溶液的沉淀離心率。

沉淀離心率/%=（W2-W1）/（W3-W1）×100

式中：W1為離心管質量，g；W2為離心倒置后離心管加沉淀物的質量，g；W3為離心前樣品加離心管的質量，g。

1.3.3 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構建單因素試驗

在pH3.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中加入適量ACN和SIDF，分別以ACN與SIDF質量比（1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50）、SIDF 粒徑（100、200、300、400、500 目）、乳化溫度（20、30、40、50、60 ℃）、乳化時間（10、20、30、40、50 min）為考察因素，最終用 pH3.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100 mL（最終總花青素含量為12 mg/100 mL），每個因素水平試驗時，其他因素以中間水平值為定值，避光恒溫磁力攪拌后，將溶液靜置30 min，測定λ521nm處的吸光度，常溫下6 000 r/min離心20 min后，以吸光度和沉淀離心率為指標來評價體系穩(wěn)定效果。

1.3.4 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構建正交試驗

在單因素基礎上，選取ACN與SIDF質量比、SIDF粒徑、乳化溫度、乳化時間4個因素進行L9（34）正交試驗，以吸光度及沉淀離心率作為指標評價穩(wěn)定效果，計算吸光度和沉淀離心率的權重系數，用于數據分析。

1.3.5 ACN-SIDF穩(wěn)定體系穩(wěn)定性評價

1.3.5.1 熱穩(wěn)定性

將ACN-SIDF穩(wěn)定體系與ACN溶液分別置于玻璃管中用錫紙包裹，在（100±2）℃的水浴中熱處理100 min，每隔20 min從水浴中取出后，立即放入冰水中冷卻，在最大吸收波長處測定吸光度，以花青素保存率（retention rate，R）為指標，評價熱穩(wěn)定效果。根據下列公式計算花青素保存率。

R/%=A1/A×100

式中：A1為熱、光處理后花青素的吸光度；A為熱、光處理前花青素的吸光度。

1.3.5.2 光穩(wěn)定性

將ACN-SIDF穩(wěn)定體系與ACN溶液密封在玻璃瓶中，在室溫（20±2）℃條件下光照（置于室內的窗臺上，每天日照時間不少于 6 h）保存。分別于 0、5、10、15、20、25、30 d后取出樣品。在最大吸收波長處測定花青素的吸光度，根據公式計算花青素保存率。

1.3.6 數據分析與處理

所有測試進行3次平行測定，結果取平行測定的平均值表示，使用SPSS 23版與Origin 2.19版軟件對數據進行統計分析。

2 結果分析

2.1 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構建單因素試驗結果分析

2.1.1 ACN與SIDF質量比對穩(wěn)定體系的影響

ACN與SIDF質量比對穩(wěn)定體系的影響見圖1。

圖1 ACN與SIDF質量比對穩(wěn)定體系的影響Fig.1 Effect of ACN-SIDF mass ratio on the stable system

由圖1可知，ACN與SIDF質量比為1∶30時，穩(wěn)定體系在λ521nm處的吸光度達到最高水平0.872，而離心沉淀率最小0.846%，這可能是由于SIDF分散在溶液中與花青素發(fā)生分子間的交互作用，形成穩(wěn)定的懸浮狀液體。當SIDF比例逐漸升高時，過量的SIDF無法與ACN結合，產生沉淀，使吸光度呈下降趨勢，沉淀離心率呈上升趨勢。由于正交試驗需設置3個不同水平，考慮到綜合評分結果，選擇ACN與SIDF質量比為1∶20、1∶30、1∶40進行正交試驗。

2.1.2 SIDF粒徑對穩(wěn)定體系的影響

SIDF粒徑對穩(wěn)定體系的影響見圖2。

圖2 SIDF粒徑對穩(wěn)定體系的影響Fig.2 Effect of SIDF particle size on the stable system

由圖2可知，SIDF粒徑為200目～400目時，穩(wěn)定體系的吸光度和沉淀離心率較好。當SIDF粒徑為300目時，穩(wěn)定體系在λ521nm處的吸光度達到較高水平，為0.862，而離心沉淀率最小0.815%，300目粒徑的SIDF穩(wěn)定效果最佳，可能是由于超微粉碎使SIDF顆粒細微化，并增大了SIDF的表面積，使更多的極性基團和水結合位點暴露在周圍的水中，進而增加了SIDF與花青素的接觸面積，使它們能緊密結合，從而降低沉淀離心率并增加吸光度[19]。當SIDF粒徑目數逐漸增大，粉體過于細微化，出現疏水作用等排斥力，使得花青素無法與SIDF絡合，并產生沉淀。因此，選擇SIDF粒徑為200、300、400目進行正交試驗。

2.1.3 乳化溫度對穩(wěn)定體系的影響

乳化溫度對穩(wěn)定體系的影響見圖3。

圖3 乳化溫度對穩(wěn)定體系的影響Fig.3 Effect of emulsification temperature on the stable system

由圖3可知，隨著乳化溫度的升高，吸光度呈下降的趨勢，沉淀離心率整體呈逐漸上升的趨勢。當乳化溫度為30℃時，穩(wěn)定體系在λ521nm處的吸光度達到較高水平，為0.869，而離心沉淀率最小0.818%。研究表明，疏水作用是一個吸熱的過程，氫鍵作用是一個放熱的過程，由于溫度的不同，兩種過程相互作用的比例也不同[20]。溫度的變化對多酚與膳食纖維之間的相互作用有一定的影響，當乳化溫度由20℃升高到30℃時，ACN與SIDF之間可能通過疏水相互作用結合，而當乳化溫度逐漸升高，疏水鍵斷裂，同時產生氫鍵相互作用[21]。因此，選擇乳化溫度為20、30、40℃進行正交試驗。

2.1.4 乳化時間對穩(wěn)定體系的影響

乳化時間對穩(wěn)定體系的影響見圖4。

圖4 乳化時間對穩(wěn)定體系的影響Fig.4 Effect of emulsification time on the stable system

由圖4可知，乳化時間為30 min～50 min時，穩(wěn)定體系的吸光度和沉淀離心率結果相對較好。當乳化時間為40 min時，穩(wěn)定體系在λ521nm處的吸光度達到較高水平0.878，而離心沉淀率最小0.782%。當反應時間為20 min～40 min時，溶液的吸光度逐漸增加，沉淀離心率逐漸減小，表明反應時間的延長有利于提高穩(wěn)定體系的互作效應。當反應時間繼續(xù)延長，吸光度與離心沉淀率逐漸趨于平緩，表明反應時間的延長對反應效果影響逐漸減小，使其相互作用效應達到平衡。同時考慮到經濟與穩(wěn)定效果，選擇乳化時間為30、40、50 min進行正交試驗。

2.2 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構建正交試驗結果分析

2.2.1 變異系數法分析

變異系數法是直接利用各項指標所包含的信息，通過計算得到指標的權重，是客觀賦權的方法。通過賦予權重衡量穩(wěn)定體系吸光度和沉淀離心率的相對重要性。

各個指標的變異系數按下列公式計算。

式中：Vi為第i項指標的變異系數；Si為第i項指標的標準差；Xi為第i項指標的算術平均值。

各個指標的權重按下列公式計算。

式中：Wi為第i項指標的權重；Vi為第i項指標的變異系數；為n項指標的和。

通過公式計算可知，吸光度的權重為0.475，沉淀離心率的權重為0.525。

采用SPSS 23版標準差標準化法將各指標標準化，結果見表1。在穩(wěn)定體系指標標準化數值中，吸光度數值越大越好，沉淀離心率數值越小越好，對于指標越小越好的沉淀離心率測定值，標準化后需在數值前加負號。

表1 ACN-SIDF穩(wěn)定體系指標標準化值Table 1 Standardized values of indicators of ACN-SIDF stable system

2.2.2 正交試驗結果

將標準化后的數值與對應的權重相乘，計算各個指標的總合，得到各樣品的綜合評分，計算正交試驗綜合評分。正交試驗因素水平及試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果分析Table 2 Orthogonal experiment results

由表2可知，ACN與SIDF質量比（A）、SIDF粒徑（B）、乳化溫度（C）和乳化時間（D）對花青素穩(wěn)定效果的綜合評分最高組合為A2B1C2D3（綜合評分為0.692）。由正交試驗中極差R可知，各因素對ACN-SIDF穩(wěn)定體系影響程度為C＞B＞A＞D，由K值可知，最優(yōu)組合為A2B2C2D3，但考慮到較小的粒徑能夠提高SIDF的持水能力和比表面積，降低表面張力，并可以將更多的極性基團暴露在周圍的水中，從而與花青素純化物緊密結合，因此將穩(wěn)定體系的最優(yōu)組合調整為A2B2C2D3，即ACN與SIDF質量比1∶30、SIDF粒徑300目、乳化溫度30℃、乳化時間50 min。

穩(wěn)定體系正交試驗結果進行方差分析，結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3方差分析可知，乳化溫度對穩(wěn)定體系有極顯著影響（P＜0.01），ACN 與 SIDF質量比、SIDF粒徑對穩(wěn)定體系影響顯著（P＜0.05）。

2.3 ACN-SIDF穩(wěn)定體系穩(wěn)定性評價結果與分析

2.3.1 熱穩(wěn)定性評價結果與分析

熱處理對花青素保存率的影響見圖5。

圖5 熱處理對花青素保存率的影響Fig.5 Effect of heat treatment on retention rate of anthocyanin

由圖5可知，在100℃加熱100 min后ACN-SIDF穩(wěn)定體系與ACN溶液的花青素保存率分別為72.66%和56.85%，ACN-SIDF穩(wěn)定體系的花青素保存率較ACN溶液提高了15.81%。結果表明，ACN-SIDF穩(wěn)定體系具有較高的熱穩(wěn)定性，分析可能是生物大分子與酚類物質之間存在相互作用，如范德華力、氫鍵、靜電相互作用和疏水作用等。這些相互作用使生物大分子與酚類物質結合，因此提高了酚類物質的熱穩(wěn)定性[22]。也可能是膳食纖維具有網狀結構，能夠吸附多酚類物質，從而保護多酚類物質在加熱條件下的穩(wěn)定性[22]。

2.3.2 光穩(wěn)定性評價結果與分析

光照對花青素保存率的影響見圖6。

圖6 光照對花青素保存率的影響Fig.6 Effect of sunlight on retention rate of anthocyanin

由圖6可知，在日光照射條件下貯藏30 d后，ACN-SIDF穩(wěn)定體系和ACN溶液的花青素保存率分別為71.45%和54.89%。綜合表明，SIDF可以延長花青素在日光條件下的保存時間，相較于ACN溶液，ACNSIDF穩(wěn)定體系的花青素保存率提高了16.56%。環(huán)境條件對花青素穩(wěn)定性具有重要的作用，SIDF對花青素有良好的保護效果。

3 結論

本試驗通過正交試驗，優(yōu)化構建ACN-SIDF穩(wěn)定體系并對其穩(wěn)定性進行了評價，表明構建ACN-SIDF穩(wěn)定體系的最優(yōu)參數為ACN與SIDF質量比1∶30、SIDF粒徑300目、乳化溫度30℃、乳化時間50 min。在100℃水浴中熱處理100 min，ACN-SIDF穩(wěn)定體系花青素保存率為72.66%，較比ACN溶液提高了15.81%。在室溫（20±2）℃、光照30 d條件下，穩(wěn)定體系花青素保存率為71.45%，比ACN溶液提高了16.56%。綜合試驗結果表明，ACN-SIDF穩(wěn)定體系中由于SIDF的加入明顯提高了花青素的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。