劉瑞，趙羽涵，顧欣怡，王艷霞，靳學(xué)慧，吳偉懷，張亞玲

黑龍江省和海南省稻瘟病菌中家族的分布及變異分析

劉瑞1，趙羽涵1，顧欣怡1，王艷霞1，靳學(xué)慧1，吳偉懷2，張亞玲1

1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/黑龍江省植物抗性研究中心，黑龍江大慶 163319；2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?571101

【目的】通過(guò)檢測(cè)黑龍江省和海南省不同稻瘟病菌（）菌株群體中家族的分布情況和變異特征，了解其變異類(lèi)型的致病表型，為區(qū)域內(nèi)抗病種質(zhì)的篩選與選育提供參考?！痉椒ā客ㄟ^(guò)參考NCBI中公布的家族序列分別對(duì)啟動(dòng)子區(qū)和CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物共6對(duì)，對(duì)2020年采自黑龍江省和海南省不同地區(qū)的397個(gè)稻瘟病菌單孢菌株提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)電泳檢測(cè)結(jié)果，分別選取囊括不同地區(qū)的代表菌株對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI中相應(yīng)的堿基與氨基酸序列進(jìn)行比較分析，并利用水稻抗性單基因系，對(duì)不同變異類(lèi)型的稻瘟病菌菌株進(jìn)行無(wú)毒功能驗(yàn)證。【結(jié)果】在PCR電泳檢測(cè)結(jié)果中，黑龍江省稻瘟病菌菌株攜帶所有待測(cè)基因，分布廣泛且檢出頻率較高；而海南省稻瘟病菌菌株中僅攜帶和，并以低頻率集中存在。無(wú)毒基因組成分析結(jié)果顯示，黑龍江稻區(qū)的稻瘟病菌菌株復(fù)雜多樣，攜帶的基因型種類(lèi)較海南菌株豐富。PCR產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)結(jié)果顯示，家族以點(diǎn)突變、插入和缺失為主要變異類(lèi)型劃分為19種,且不同稻瘟病菌群體來(lái)源的菌株，其變異類(lèi)型具有特異性。檢測(cè)出10種變異類(lèi)型，其中（1—5）為黑龍江省稻瘟病菌菌株獨(dú)有的變異類(lèi)型，（6—10）為海南省稻瘟病菌菌株獨(dú)有。對(duì)這10種變異類(lèi)型經(jīng)功能驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，無(wú)毒功能均已喪失。檢測(cè)出8種變異類(lèi)型，其中（1—4）為黑龍江省稻瘟病菌菌株獨(dú)有，（5—8）為海南省稻瘟病菌菌株獨(dú)有。經(jīng)功能驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，無(wú)毒功能均已喪失。在黑龍江省僅檢測(cè)出1種變異類(lèi)型。【結(jié)論】黑龍江和海南稻瘟病菌群體中家族均為突變后的等位基因型存在，經(jīng)致病性鑒定后，檢測(cè)出的所有突變類(lèi)型均不能被相對(duì)應(yīng)抗性基因和Pi-ta所識(shí)別，表現(xiàn)為感病。因此，抗性基因和Pi-ta在黑龍江省和海南省對(duì)稻瘟病的抗病育種與利用過(guò)程中可聚合其他抗性基因應(yīng)用來(lái)保證品種抗病性。同時(shí)，不同地理來(lái)源的稻瘟病菌菌株群體中家族的分布和變異類(lèi)型具有特異性。

稻瘟病菌；家族；變異；無(wú)毒基因；黑龍江?。缓Ｄ鲜?/p>

0 引言

【研究意義】由稻瘟病菌（無(wú)性態(tài)：）侵染引起的稻瘟病是對(duì)水稻生產(chǎn)造成巨大威脅的三大病害之一[1-2]。選育和種植抗性品種被證明是控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)境無(wú)害的途徑。水稻與稻瘟病菌之間符合經(jīng)典的“基因?qū)颉毕到y(tǒng)[3]，它解釋了病原菌中的無(wú)毒基因（）與水稻中特定的抗性基因（）相對(duì)應(yīng)，以及品種中缺失某抗性基因如何使該品種成為感病品種[4]。但由于稻瘟病菌生理小種的復(fù)雜多變及無(wú)毒基因的頻繁變異，不同稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生新的無(wú)毒基因型，最終導(dǎo)致水稻品種抗性“喪失”[5]。我國(guó)地貌紛繁，生態(tài)環(huán)境多樣，致使不同稻瘟病菌菌群中無(wú)毒基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，遺傳變異類(lèi)型多樣[6]。因此，監(jiān)測(cè)不同地域稻瘟病菌群體中無(wú)毒基因的分布及變異情況，了解無(wú)毒基因變異對(duì)病原物無(wú)毒功能喪失的機(jī)制，對(duì)研究不同稻區(qū)稻瘟病菌菌群的遺傳多樣性和區(qū)域內(nèi)指導(dǎo)抗病育種方向，并實(shí)現(xiàn)抗病持久化具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已鑒定的無(wú)毒基因有40多個(gè)，已被克隆的無(wú)毒基因有12個(gè)，分別為、[7-16]。Orbach等[7]通過(guò)PFLP標(biāo)記克隆了無(wú)毒基因，定位在稻瘟病菌第3號(hào)染色體近端粒處，該基因編碼一個(gè)含223個(gè)氨基酸的分泌蛋白，含典型鋅金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)。由于端粒具有不穩(wěn)定性，常發(fā)生點(diǎn)突變、插入和缺失等變異來(lái)逃脫的識(shí)別，使水稻抗性喪失。Jia等[17]通過(guò)蛋白質(zhì)印跡證明是首個(gè)編碼蛋白與相應(yīng)抗病基因產(chǎn)物直接互作的無(wú)毒基因。Khang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，是一個(gè)基因家族，包括、和，其中為原來(lái)的基因。研究還發(fā)現(xiàn)，分別與和具有92%和71%的DNA序列同一性。和具有與相對(duì)應(yīng)的無(wú)毒功能，且兩基因均存在于種群和種群中，而僅存在于種群中。一些菌株中的和位于端粒附近，兩側(cè)是反向重復(fù)DNA元件，兩基因的頻繁缺失和擴(kuò)增可能是重復(fù)DNA元件發(fā)生重組所引起的。在水稻稻瘟病抗性基因克隆方面，迄今為止已報(bào)道了40個(gè)抗瘟基因并完成了分子克隆[19]，與Pi-ta均定位于水稻12號(hào)染色體的著絲粒區(qū)域。目前雖已成功克隆，但與Pi-ta仍然不能在F2代中有效分離，因此猜測(cè)兩基因可能緊密連鎖或等位基因[19]。Bryan等[20]發(fā)現(xiàn)，對(duì)識(shí)別特異性的差異取決于Pi-ta蛋白之間的單個(gè)氨基酸差異。研究還表明等位基因也出現(xiàn)在含有Pi-ta的水稻品種中，實(shí)際上就是Pi-ta為至少加上一個(gè)緊密連鎖的其他抗性基因。甘玉姿等[21]在菲律賓稻瘟病菌中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的等位基因，命名為，研究還發(fā)現(xiàn)和不具有無(wú)毒功能。余歡等[22]在國(guó)內(nèi)草類(lèi)寄主梨孢菌中發(fā)現(xiàn)，具有豐富的變異性，在基因上游存在大量序列缺失現(xiàn)象，基因下游存在缺失、部分缺失和多位點(diǎn)現(xiàn)象。【本研究切入點(diǎn)】水稻在中國(guó)種植范圍廣，南起海南島，北至黑龍江，分別以種植秈稻和粳稻為主。黑龍江省地處東北早熟單季稻稻作區(qū)，屬于寒溫帶與溫帶大陸性季風(fēng)氣候；海南省地處華南雙季稻稻作區(qū)，屬于熱帶季風(fēng)海洋性。受種植區(qū)內(nèi)生態(tài)、地勢(shì)等因素影響，區(qū)域內(nèi)稻瘟病菌的無(wú)毒基因可能會(huì)存在差異。筆者實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道了黑龍江省和海南省基因家族在稻瘟病菌中的分布及變異情況[23]，但目前針對(duì)南北不同地域差異的稻瘟病菌群體中家族的分布變異情況的研究鮮有報(bào)道。因此，為探究南北不同稻瘟病菌菌群中家族的分布及變異機(jī)制，對(duì)采自黑龍江省和海南省不同水稻產(chǎn)區(qū)的稻瘟病菌進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)黑龍江省和海南省稻瘟病菌中家族進(jìn)行PCR檢測(cè)、基因序列測(cè)序以及對(duì)基因的不同變異類(lèi)型進(jìn)行功能驗(yàn)證，明確這兩個(gè)稻區(qū)內(nèi)稻瘟病菌家族的分布差異及變異特性，為區(qū)域內(nèi)抗病種質(zhì)的篩選與選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

稻瘟病菌供試群體均為2020年于黑龍江省7市14縣和海南省5市6縣采集的稻瘟病穗頸瘟標(biāo)樣經(jīng)分離獲得的397個(gè)單孢菌株，采集地點(diǎn)及編號(hào)如表1。

表1 黑龍江省和海南省稻瘟病菌菌株

a：黑龍江省菌株數(shù)Number of strains in Heilongjiang Province；b：海南省菌株數(shù)Number of strains in Hainan Province

1.2 稻瘟病菌基因組DNA的提取

將供試的稻瘟病菌單孢菌株置于PDA平板培養(yǎng)基上活化處理，取5塊菌碟放入滅菌的150 mL液體酵母培養(yǎng)基內(nèi)，置于立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱搖菌一周，用真空泵抽濾菌絲后分裝于離心管中。使用CTAB[24]法提取菌絲DNA。采用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)提取的DNA濃度和純度，以確保其質(zhì)量，并將DNA原液用TE稀釋成50 ng·μL-1備用，置于-20℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)

于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）上查找稻瘟病菌家族的基因序列，利用Primer premier 5設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，啟動(dòng)子區(qū)序列引物參考Khang等[18]，編碼序列（CDS）區(qū)序列引物參考孟峰等[25]，編碼序列（CDS）區(qū)序列引物參考Shi等[26]。6對(duì)引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。

表2 用于擴(kuò)增無(wú)毒基因的引物

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：dNTPs 1.6 μL，10×Buffer 2 μL，正、反引物各0.3 μL，模板DNA 1 μL，rTaq酶0.1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，50—60℃退火45 s，72℃延伸30—90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存，待檢測(cè)。

電泳檢測(cè)：PCR產(chǎn)物在電泳液為0.5×TBE和瓊脂糖配置好的1%瓊脂糖凝膠中電泳20 min，150 V。在電泳成像儀下利用Image Lab系統(tǒng)中的條帶檢測(cè)功能讀取并記錄電泳條帶，根據(jù)電泳圖譜，運(yùn)用二進(jìn)制方法，將有條帶的記為“1”，沒(méi)有帶的記為“0”。將數(shù)據(jù)制成Microsoft Excel文件，并對(duì)文件中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算各稻區(qū)稻瘟病菌中無(wú)毒基因家族的檢出頻率。

1.5 無(wú)毒基因的基因序列分析

從無(wú)毒基因引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中挑選不同帶型不同水稻產(chǎn)區(qū)的部分菌株，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN軟件對(duì)堿基及核苷酸的序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定變異類(lèi)型。

1.6 稻瘟病菌菌株致病性測(cè)定

水稻品種：含有、Pi-ta抗性基因的水稻單基因系IRBLta-K1和IRBLta2-Pi，為國(guó)際水稻研究所選育；感病對(duì)照品種：麗江新團(tuán)黑谷（LTH）。

菌株活化及產(chǎn)孢培養(yǎng)：在PDA平板培養(yǎng)基上將供試的稻瘟病菌單孢菌株活化處理，5 d后接種到米糠培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基表面時(shí)，用涂布棒和無(wú)菌水刮洗掉氣生菌絲，置于恒溫恒濕環(huán)境中，用藍(lán)紫光燈照射3 d，進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。

水稻種植：挑選籽粒飽滿(mǎn)的水稻種子用1.25‰的多菌靈溶液室溫下浸泡24 h，用清水沖洗干凈后置于濾紙保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，于30℃的恒溫培養(yǎng)箱催芽。將發(fā)芽后的種子播種于固定在塑料水培盒（尺寸：225 mm×155 mm×55 mm）內(nèi)的定植籃（上端內(nèi)徑34 mm，下端內(nèi)徑28 mm，高45 mm）中，每個(gè)定植籃內(nèi)播種10粒，自來(lái)水培養(yǎng)3 d后，營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液采用經(jīng)典的霍格蘭（Hoagland）配方，每4 d換一次營(yíng)養(yǎng)液，待水稻3葉1心時(shí)進(jìn)行人工噴霧接種。

接種調(diào)查：待米糠培養(yǎng)基表面產(chǎn)生灰色霉層后，每個(gè)培養(yǎng)皿用5 mL無(wú)菌水洗下孢子，用雙層紗布過(guò)濾，制成孢子懸浮液，在40倍顯微鏡下每視野孢子量大于40個(gè)，加入1%的吐溫20，搖勻后均勻地噴灑在秧苗上，將其移入25℃的遮光保濕棚內(nèi)培養(yǎng)24 h后返回室溫自然培養(yǎng)，每組處理重復(fù)2次，接種5 d后調(diào)查植株發(fā)病情況，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參考靳學(xué)慧[27]。

2 結(jié)果

2.1 AVR-Pita基因家族在黑龍江省和海南省稻瘟病菌中的分布

利用基因家族啟動(dòng)子區(qū)和CDS區(qū)序列引物對(duì)397個(gè)稻瘟病菌菌株DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖1），電泳結(jié)果顯示，基因家族共出現(xiàn)3種帶型不同的條帶：有帶、無(wú)帶和低帶，用“+”“-”和“1”表示。在黑龍江省186個(gè)菌株中擴(kuò)增出特異性片段，檢出頻率為86.51%；在海南省90個(gè)菌株中均擴(kuò)增出特異性片段，檢出頻率為49.45%，其中東方感城、澄邁金江檢出頻率為0。在黑龍江省178個(gè)菌株中擴(kuò)增出特異性片段，檢出頻率為82.79%；在海南省89個(gè)菌株中均擴(kuò)增出特異性片段，檢出頻率為48.90%，其中東方感城、澄邁金江檢出頻率為0。僅在黑龍江省186個(gè)菌株中擴(kuò)增出特異性片段，檢出頻率為86.51%；而海南省菌株中均未增出特異性片段，檢出頻率為0。

A：AVR-Pita1啟動(dòng)子區(qū)的部分?jǐn)U增結(jié)果Partial amplification results of AVR-Pita1 promoter region；B：AVR-Pita1 CDS區(qū)的部分?jǐn)U增結(jié)果Partial amplification of AVR-Pita1 CDS region；C：AVR-Pita2啟動(dòng)子區(qū)的部分?jǐn)U增結(jié)果Partial amplification results of AVR-Pita2 promoter region；D：AVR-Pita2 CDS區(qū)的部分?jǐn)U增結(jié)果Partial amplification of AVR-Pita2 CDS region；E：AVR-Pita3啟動(dòng)子區(qū)的部分?jǐn)U增結(jié)果Partial amplification results of AVR-Pita3 promoter region；F：AVR-Pita3 CDS區(qū)的部分?jǐn)U增結(jié)果Partial amplification of AVR-Pita3 CDS region；M：DNA marker DL2000；1：低帶Low band；+：存在Existence；-：缺失Missing

2.2 AVR-Pita基因家族在黑龍江省和海南省稻瘟病菌中的基因型

基因家族廣泛分布于所有被調(diào)查的稻瘟病菌菌株中，單個(gè)基因的存在和不同組合的分析如表3所示。397個(gè)菌株中共檢測(cè)到7種不同基因型，分別為、、+、+、+和++。黑龍江省菌株含有全部組合類(lèi)型，其中攜帶家族的3個(gè)無(wú)毒基因的菌株數(shù)量最多，為155株，占72.09%且均以組合形式存在。而海南菌株僅有2種類(lèi)型，和+，其中不攜帶待測(cè)家族基因的菌株數(shù)量最多，為92株，占50.55%；攜帶+基因型的菌株數(shù)量為90株，占49.45%，單個(gè)家族基因不單獨(dú)存在。由此可見(jiàn)，黑龍江菌株攜帶的基因型種類(lèi)較海南菌株豐富。

表3 參試菌株攜帶無(wú)毒基因型的檢測(cè)結(jié)果

：不含待測(cè)基因的基因型，其中，f表示不存在Genotypes that do not contain the gene to be tested, where, f stands for free

2.3 AVR-Pita基因家族的序列及致病表型分析

2.3.1的序列及致病表型分析 分別于兩省各選取20個(gè)囊括所有地區(qū)，并在啟動(dòng)子區(qū)和CDS區(qū)均擴(kuò)增出特異性片段菌株的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，用于測(cè)序的40個(gè)菌株表現(xiàn)出10種序列類(lèi)型（表4），第1類(lèi)同余歡等[22]發(fā)現(xiàn)的變異類(lèi)型一致（），與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，在啟動(dòng)子區(qū)-1 004 bp至CDS區(qū)+246 bp處存在1 250 bp基因序列的缺失；其余9類(lèi)的差異主要體現(xiàn)在堿基的替換與插入，即-413（A/G）、-376（G/A）、-246（T/C）、-116（C/A）、-52（A/C）、18-20GTT（Insert）、207（C/T）、245（G/A）、247（A/G）、263（A/G）、312（T/G）、407（A/G）、520（A/G）、575（G/A）/（T/A）、580（C/T）和583（C/G），其中575位點(diǎn)處A堿基突變了2種類(lèi)型，將這9種變異類(lèi)型分別命名為、、、、、、、和。

的9類(lèi)堿基序列中，-（2，3）、-（6，7，8）和-（9，10）變異類(lèi)型在CDS區(qū)變異位點(diǎn)一致，因此從中選取、和的氨基酸序列參與序列比對(duì)。將5類(lèi)堿基序列所翻譯的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖2），結(jié)果顯示，207（C/T）處為同義突變，其余堿基突變均使氨基酸發(fā)生錯(cuò)義。在6（L/Insert）、82（S/N）、83（N/D）、88（K/R）、104（N/K）、174（I/V）和192（C/Y）處發(fā)生氨基酸錯(cuò)義翻譯；在6（L/Insert）、82（S/N）、83（N/D）、88（K/R）、104（N/K）、136（E/G）、174（I/V）和192（C/Y）處發(fā)生氨基酸錯(cuò)義翻譯；在6（L/Insert）、82（S/N）、83（N/D）、88（K/R）、104（N/K）、136（E/G）和174（I/V）處發(fā)生氨基酸錯(cuò)義翻譯；在類(lèi)型的基礎(chǔ)上增加一處，即194（R/W）；在6（L/Insert）、192（F/Y）和195（H/D）處發(fā)生氨基酸錯(cuò)義翻譯。

表4 部分菌株AVR-Pita1堿基序列比對(duì)結(jié)果

-代表在該點(diǎn)的堿基與標(biāo)準(zhǔn)序列相同- represents that the base at this position is the same as the standard sequence

圖2 AVR-Pita1氨基酸序列比對(duì)分析

對(duì)無(wú)毒基因型的10種突變類(lèi)型的菌株接種水稻單基因系K1（）進(jìn)行功能驗(yàn)證，以麗江新團(tuán)黑谷（LTH）為對(duì)照。結(jié)果顯示（圖3），-（1—10）均不能被識(shí)別而表現(xiàn)為有毒性（V），無(wú)毒功能喪失。

2.3.2的序列及致病表型分析 分別于兩省各選取20個(gè)囊括所有地區(qū)，并在啟動(dòng)子區(qū)和CDS區(qū)均擴(kuò)增出特異性片段菌株的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，用于測(cè)序的40個(gè)菌株表現(xiàn)出8種序列類(lèi)型（圖4），均與標(biāo)準(zhǔn)序列有多處差異，主要體現(xiàn)在單堿基的替換、插入與缺失，其中，-115、506和575位點(diǎn)處單堿基各突變了2種類(lèi)型，即-115（C/T）/（A/T）、506（G/A）/（T/A）和575（G/A）/（T/A）。第1類(lèi)、第2類(lèi)和第4類(lèi)各與標(biāo)準(zhǔn)序列相比均有89處差異，將這3類(lèi)分別命名為、和；第3類(lèi)和第7類(lèi)各與標(biāo)準(zhǔn)序列相比均有88處差異，將這2類(lèi)分別命名為和；第5類(lèi)、第6類(lèi)和第8類(lèi)各與標(biāo)準(zhǔn)序列相比分別有86、85和87處差異，將這3類(lèi)分別命名為、和。

圖3 AVR-Pita1變異菌株的致病型

圖4 部分菌株AVR-Pita2堿基序列比對(duì)結(jié)果

將的8類(lèi)堿基序列所翻譯的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖5），結(jié)果顯示，8種變異類(lèi)型均與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列有多處差異，均為堿基突變使氨基酸發(fā)生錯(cuò)義。其中，88、169和192位點(diǎn)處各錯(cuò)義突變了2種類(lèi)型，即88（K/E）/（R/E）、169（G/Q）/（V/Q）和192（C/Y）/（F/Y）。（1，2，4，7）均與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)有33處差異；（3，8）均與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)有32處差異；和與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)分別有31和30處差異。所有變異位點(diǎn)處均發(fā)生氨基酸錯(cuò)義翻譯。

對(duì)無(wú)毒基因型的8種突變類(lèi)型的菌株接種水稻單基因系PiNo.4（Pi-ta）進(jìn)行功能驗(yàn)證，以麗江新團(tuán)黑谷（LTH）為對(duì)照。結(jié)果顯示（圖6），-（1—8）均不能被Pi-ta識(shí)別而表現(xiàn)為有毒（V），無(wú)毒功能喪失。

圖5 AVR-Pita2氨基酸序列比對(duì)分析

圖6 AVR-Pita2變異菌株的致病型

2.3.3序列分析 因海南菌株中未擴(kuò)增出目的片段，故于黑龍江菌株中選取20個(gè)囊括所有地區(qū)，并在啟動(dòng)子區(qū)和CDS區(qū)均擴(kuò)增出特異性片段菌株的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，用于測(cè)序的20個(gè)菌株僅表現(xiàn)出1種序列類(lèi)型（表5），與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)有多處差異，主要體現(xiàn)在單堿基的替換，即55（G/A）、103（C/T）、122（T/C）、135（A/G）、148（C/A）、183（C/A）、267（A/C）、307（A/G）、315（T/C）、319—321（CGT/AAG）、333（C/A）、479（G/A）、484（A/G）和508（G/A）。

將堿基序列所翻譯的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖7），結(jié)果顯示，135（A/G）和315（T/C）處為同義突變，其余堿基突變均使氨基酸發(fā)生錯(cuò)義，即19（V/I）、35（P/S）、41（V/A）、50（Q/K）、61（D/E）、89（L/F）、103（K/E）、107（R/K）、111（D/E）、160（R/Q）、162（K/E）和170（A/T）。

2.3.4基因家族變異類(lèi)型占比 在測(cè)序結(jié)果中，基因家族序列類(lèi)型可劃分為19種變異類(lèi)型，其在黑龍江省和海南省占比如圖8所示。-（1—5）僅在黑龍江省存在，占比較均勻，分別為30.00%、25.00%、5.00%、25.00%和15.00%；反之-（6—10）僅在海南省存在，其中-占比最大，為50.00%，其余基因型占比分別為15.00%、10.00%、5.00%和20.00%。-（1—4）僅在黑龍江省存在，其中占比最大，為70.00%，其余基因型占比分別為10.00%、5.00%和15.00%；反之-（5—8）僅在海南省存在，其中占比最大，為55.00%，其余基因型占比分別為20.00%、15.00%和10.00%。僅在黑龍江菌株中檢測(cè)到，且所有測(cè)序菌株均有同一種變異類(lèi)型。以上結(jié)果說(shuō)明南北不同稻瘟病菌菌株群體中家族具有顯著差異，并均含有其特異性變異類(lèi)型，即不同地理及品種來(lái)源的菌株存在另一地區(qū)不存在的變異類(lèi)型，并且不同菌群來(lái)源的菌株具有豐富的遺傳多樣性。

表5 部分菌株AVR-Pita3堿基序列比對(duì)結(jié)果

圖7 AVR-Pita3氨基酸序列比對(duì)分析

圖8 AVR-Pita基因家族變異類(lèi)型比例分析

3 討論

3.1 黑龍江省和海南省稻瘟病菌無(wú)毒基因型的分布

黑龍江省和海南省分別是中國(guó)粳/秈稻的主產(chǎn)稻區(qū)，由于我國(guó)生態(tài)環(huán)境的差異，稻瘟病菌極易通過(guò)熟悉的抗性條件衍生出不同的致病型，同時(shí)，抗病品種的大面積單一化種植也會(huì)對(duì)稻瘟病菌造成選擇壓力，促使其發(fā)生變異導(dǎo)致品種抗性“喪失”[28]，進(jìn)而使水稻大幅減產(chǎn)甚至絕收。Valent等[29]研究表明，水稻品種的持久抗性與所處稻區(qū)的稻瘟病菌無(wú)毒基因的變化相關(guān)。因此，及時(shí)檢測(cè)不同稻瘟病菌群體中無(wú)毒基因的分布和無(wú)毒基因型的組成情況，可為不同稻區(qū)合理進(jìn)行抗病基因應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

本試驗(yàn)中檢測(cè)到大部分黑龍江省水稻種植區(qū)內(nèi)，稻瘟病菌菌株中攜帶所有待測(cè)基因，且出現(xiàn)頻率較高，表明家族在該地區(qū)廣泛存在；而少數(shù)海南省水稻種植區(qū)內(nèi)，稻瘟病菌菌株中攜帶和，出現(xiàn)頻率較低，且所有海南菌株中均不攜帶，由于本文供試的海南菌株均采自稻瘟病發(fā)生較重且具有代表性的地區(qū)，因此，推測(cè)海南菌株中不存在或含有較少的，表明該家族在海南地區(qū)以低頻率集中存在并具有地域差異性。這些結(jié)果表明，黑龍江和海南省粳/秈稻不同稻瘟病菌群體中所檢測(cè)的家族分布差異較大，與廖靜靜等[30]對(duì)云南省粳/秈型稻瘟病菌中主要無(wú)毒基因分布的研究結(jié)果相吻合，表明粳/秈型稻瘟病菌無(wú)毒基因的分布是稻瘟病菌對(duì)水稻亞種適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果。對(duì)每個(gè)菌株的無(wú)毒基因組成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同稻瘟病菌群體中同一無(wú)毒基因型的出現(xiàn)頻率存在差異，與房文文等的研究結(jié)果一致[31-32]。所有供試菌株可劃分為7種無(wú)毒基因型，黑龍江菌株含有全部組合類(lèi)型；而海南菌株僅含有2種類(lèi)型，說(shuō)明黑龍江稻區(qū)的稻瘟病菌菌株中攜帶的基因組合種類(lèi)較為豐富，而海南稻區(qū)較為單一。稻瘟病菌群體無(wú)毒基因分布形成明顯區(qū)域特征的原因可能是由于各地區(qū)均有其獨(dú)具的生態(tài)條件，長(zhǎng)期以來(lái)經(jīng)自然選擇的結(jié)果，使不同地區(qū)稻瘟病菌群體產(chǎn)生了獨(dú)特的無(wú)毒基因結(jié)構(gòu)。

周江鴻等[33]研究表明，我國(guó)稻瘟病菌群體對(duì)攜帶抗性基因的品種表現(xiàn)為中等至強(qiáng)毒力水平，因此推測(cè)家族存在高變異性，易失去無(wú)毒功能。與本研究結(jié)果一致，黑龍江和海南稻瘟病菌群體中家族均為突變后的等位基因型存在，經(jīng)致病型鑒定后，檢測(cè)出的所有突變類(lèi)型均不能被相對(duì)應(yīng)抗性基因和Pi-ta所識(shí)別，表現(xiàn)為感病。高清等對(duì)粳型水稻中抗瘟基因分布和抗病性的研究結(jié)果表明，抗性基因在黑龍江省水稻品種中總體應(yīng)用較廣，聚合其他抗性基因的抗病率較高，認(rèn)為抗性基因在黑龍江省水稻抗病育種中具有較高貢獻(xiàn)[34-35]。孟峰等研究表明，黑龍江省各稻區(qū)稻瘟病菌中變異類(lèi)型相對(duì)穩(wěn)定，認(rèn)為在黑龍江省水稻抗病育種中，需要聚合其他抗性基因才能提高抗病率[25,36]，與本文研究結(jié)果一致，抗性基因和Pi-ta在黑龍江省水稻的抗病育種與利用過(guò)程中需要聚合其他抗性基因應(yīng)用來(lái)保證品種抗病性。董麗英等[37]研究表明，云南省秈稻中和Pi-ta的抗性頻率均高于80%，兩抗性基因可作為抗原在該地區(qū)應(yīng)用；曹雪琦[38]研究表明，福建省秈稻中Pi-ta的抗性頻率低于30%，攜帶該基因的水稻品種在福建省應(yīng)慎重推廣；周瑚等[39]研究表明，湖南省秈稻中和出現(xiàn)頻率低，且和Pi-ta的抗性頻率均在40%左右，攜帶兩單基因的水稻品種在湖南省應(yīng)慎重推廣。本研究中，海南省稻瘟病菌菌株中和出現(xiàn)頻率低，因此抗性基因和Pi-ta在海南省對(duì)稻瘟病的抗病育種應(yīng)用中同樣需要慎重考慮，可聚合其他抗性基因應(yīng)用來(lái)保證品種抗病性。

3.2 黑龍江省和海南省稻瘟病菌無(wú)毒基因型的進(jìn)化

對(duì)遺傳變異進(jìn)行評(píng)估是了解基因進(jìn)化和稻瘟病菌與水稻共同進(jìn)化的主要分子機(jī)制。由于家族基因位于不穩(wěn)定的端粒處，并在稻瘟病菌1、3—7號(hào)等染色體上均有發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致該基因具有高度的可變性和多態(tài)性，進(jìn)而導(dǎo)致更高水平的遺傳多樣性。家族的變異可發(fā)生在基因的CDS區(qū)、5′端及端粒區(qū)[40]，任何通過(guò)點(diǎn)突變、插入與缺失等細(xì)微的變異都可以影響整個(gè)分泌蛋白的結(jié)構(gòu)，對(duì)無(wú)毒功能造成影響，最終達(dá)到改變其致病性的目的。因此，了解不同菌株群體中無(wú)毒基因的變異機(jī)制對(duì)掌握其不同遺傳多樣性和對(duì)區(qū)域內(nèi)抗性品種的選育是至關(guān)重要的。

通過(guò)挑選不同群體中家族的PCR產(chǎn)物測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，家族在不同群體中有著豐富的遺傳多樣性和特異性。Sirisathaworn等[41]報(bào)道了基因突變是影響稻瘟病菌群體遺傳多樣性的唯一因素，隨后作者對(duì)泰國(guó)稻瘟病菌中3個(gè)的編碼序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)均呈現(xiàn)較低水平的遺傳變異，即泰國(guó)稻瘟病菌具有低水平的遺傳多樣性。Kasetsomboon等[42]報(bào)道了編碼區(qū)存在15個(gè)單倍型，且具有高度的遺傳多樣性。本研究結(jié)果同樣證實(shí)了以上觀(guān)點(diǎn)，家族具有豐富的多態(tài)性位點(diǎn)和遺傳多樣性，該家族在啟動(dòng)子區(qū)和CDS區(qū)存在多處點(diǎn)突變、插入和缺失現(xiàn)象，共鑒定出19種變異類(lèi)型，其中有18種無(wú)毒功能喪失，另外1種是的突變類(lèi)型，由于缺乏水稻抗性基因，因此還需要后續(xù)工作進(jìn)一步驗(yàn)證此類(lèi)型是否會(huì)引起無(wú)毒功能發(fā)生改變。轉(zhuǎn)座子在啟動(dòng)子區(qū)或CDS區(qū)插入可導(dǎo)致新的毒力等位基因。Zhou等[43]在毒性野生型菌株B2中發(fā)現(xiàn)區(qū)域有轉(zhuǎn)座子Pot3插入，導(dǎo)致菌株恢復(fù)毒性，但本研究所有供測(cè)菌株均未檢測(cè)到轉(zhuǎn)座子Pot3插入情況，與孟峰等[25]的研究結(jié)果一致。Dai等[44]報(bào)道了存在片段缺失和移碼突變現(xiàn)象，共鑒定出27種變異類(lèi)型。Chuma等[45]發(fā)現(xiàn)和在染色體上的位置及序列經(jīng)常改變，但卻能在7號(hào)染色體上以穩(wěn)定形式存在，但本研究中，在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生單堿基替換，與前人研究不符，可能是由于稻瘟病菌與水稻協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，水稻不斷進(jìn)化產(chǎn)生新的抗性基因，病原菌的無(wú)毒基因?yàn)榱颂颖芸剐曰蚪o予的選擇壓力，自身發(fā)生變異來(lái)克服小種抗性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，不同地域來(lái)源的稻瘟病菌菌株群體遺傳結(jié)構(gòu)存在差異，與肖丹鳳[46]對(duì)不同稻作區(qū)稻瘟病菌遺傳分析的研究結(jié)果一致。Huang等[47]報(bào)道了中國(guó)不同群體的稻瘟病菌呈現(xiàn)出互相接近的遺傳多樣性，并且在地理位置上沒(méi)有差異。但本研究中，黑龍江和海南稻作區(qū)內(nèi)稻瘟病菌菌株群體之間的變異類(lèi)型具有區(qū)域特征，即兩稻區(qū)均含有其特異性等位基因型，與Zhang等[48]研究結(jié)果一致，中國(guó)南方和北方水稻產(chǎn)區(qū)支持兩個(gè)截然不同的病原體群體，更加充分驗(yàn)證了不同稻區(qū)的稻瘟病菌群體間具有豐富的遺傳多樣性。這種特異性的存在，再一次證實(shí)了不同稻瘟病菌群體間的遺傳特性與其所處的生態(tài)環(huán)境和耕作栽培等具有密切的相關(guān)性。

4 結(jié)論

家族在南北不同稻瘟病菌群體中均有分布且分布差異較大，并均含有其特異性變異類(lèi)型。黑龍江菌株含有全部待測(cè)基因并均以高頻率廣泛存在；而海南菌株均以低頻率集中并僅存在和，且黑龍江菌株較海南菌株無(wú)毒基因型組成種類(lèi)豐富。同時(shí)家族在不同群體中均含有豐富的多態(tài)性和區(qū)域特征，兩群體中家族均為突變后的等位基因型存在，共有19種變異類(lèi)型，經(jīng)致病性鑒定后，有18種失去無(wú)毒功能。檢測(cè)出的所有突變類(lèi)型均不能被相對(duì)應(yīng)抗性基因和Pi-ta所識(shí)別，表現(xiàn)為感病?？剐曰蚝?i>Pi-ta在黑龍江省和海南省對(duì)稻瘟病的抗病育種與利用過(guò)程中可聚合其他抗性基因應(yīng)用來(lái)保證品種抗病性。因此，不同群體中稻瘟病菌復(fù)雜多樣，應(yīng)繼續(xù)監(jiān)測(cè)稻瘟病菌的變化情況，持續(xù)探究其在不同群體中的變異規(guī)律，及時(shí)掌握區(qū)域內(nèi)田間稻瘟病菌動(dòng)態(tài)，不僅對(duì)研究不同稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性具有重要意義，同時(shí)還可為區(qū)域內(nèi)抗病種質(zhì)的篩選與選育提供參考。

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Distribution and Variation Analysis offamily infrom Heilongjiang Province and Hainan Province

1College of Agronomy, Heilongjiang Bayi Agricultural University/Heilongjiang Plant Resistance Research Center, Daqing 163319, Heilongjiang;2Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101

【Objective】By detecting the distribution and variation characteristics of thefamily in differentstrains from Heilongjiang Province and Hainan Province, the pathogenic phenotypes of the variation types were understood, which provided a reference for the screening and breeding of disease-resistant germplasm in the region.【Method】Six pairs of specific primers were designed for the promoter region and CDS region by referring to thefamily sequence published in NCBI. DNA was extracted from 397 single spore strains ofcollected from different regions of Heilongjiang Province and Hainan Province in 2020, and PCR amplification was performed. By electrophoresis test results, representative strains from different regions were selected to sequence the amplified fragments. The sequencing results were compared with the corresponding base and amino acid sequences in NCBI, and the avirulence function of different variation types ofstrains was verified by using rice resistant single gene lines.【Result】In the PCR electrophoresis results, thestrains in Heilongjiang Province carried all the genes to be tested, which were widely distributed and had a high detection frequency. However, onlyandwere carried bystrains in Hainan Province, and concentrated in low frequency. The results of avirulence gene composition analysis showed that the strains ofin Heilongjiang were complex and diverse, and the genotypes were more abundant than those in Hainan. The sequencing results of PCR products showed that thefamily was divided into 19 types with point mutation, insertion and deletion as the main variation types, and the variation types of strains from differentpopulations were specific. Ten variation types were detected in, among which- (1-5) was a unique variation type ofstrains in Heilongjiang Province, and- (6-10) was a unique variation type ofstrains in Hainan Province. After functional verification of these ten variation types, it was found that the avirulence functions were lost. Eight variation types were detected in, among which- (1-4) was a unique variation type ofstrains in Heilongjiang Province, and- (5-8) was a unique variation type ofstrains in Hainan Province. After functional verification, it was found that the avirulence functions were lost. Only one variation type ()was detectedin【Conclusion】Thefamily in Heilongjiang and Hainan populations were mutated alleles. After pathogenicity identification, all mutation types could not be identified by the corresponding resistance genesandPi-ta. Therefore, the resistance genesandPi-tacan be used to polymerize other resistance genes to ensure the disease resistance of varieties in the process of disease resistance breeding and utilization of rice blast in Heilongjiang Province and Hainan Province. At the same time, the distribution and variation types offamily instrains from different geographical sources are specific.

;family; mutation; avirulence gene; Heilongjiang province; Hainan province

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.03.006

2022-09-28；

2022-11-01

國(guó)家自然科學(xué)基金（U20A2025）、黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)項(xiàng)目（HKKYZD190205）、黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)科研啟動(dòng)項(xiàng)目（XDB201802，XDB201605）

劉瑞，E-mail：2271031165@qq.com。通信作者張亞玲，E-mail：byndzyl@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）