撒世娟 伍涵宇 溫媛 陳雪娜 鄭蕊 姚新靈

（1. 寧夏大學(xué)寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2. 寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)及利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

氣孔是植物吸收CO2、釋放H2O 的門(mén)戶，大氣CO2上升誘導(dǎo)氣孔密度降低［1-3］，并對(duì)光合作用產(chǎn)生影響。研究結(jié)果顯示，CO2富集誘導(dǎo)氣孔導(dǎo)度降低達(dá)22%。氣孔導(dǎo)度降低可能是植物對(duì)高CO2濃度的主動(dòng)適應(yīng)過(guò)程［4］，該適應(yīng)過(guò)程與葉綠體如何聯(lián)系尚屬未知。

隨著光合作用相關(guān)蛋白識(shí)別及功能注釋的不斷深入，氣孔運(yùn)動(dòng)與葉綠體間的聯(lián)系逐漸顯現(xiàn)，其中包括共同影響葉綠體和氣孔動(dòng)態(tài)的環(huán)境因素如光照、高溫，還有葉綠素a/b 結(jié)合蛋白LHCB（light-harvesting chlorophyll a/b binding proteins）和碳固定代謝參與蛋白等，這些線索為揭示氣孔動(dòng)態(tài)與葉綠體間的代謝聯(lián)系提供了基本依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，高溫導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度降低的同時(shí)，葉綠體熒光參數(shù)也隨之降低，葉綠體和氣孔哪個(gè)首先受到環(huán)境因素的影響有待確定［5］。早期研究發(fā)現(xiàn)，保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)葉綠素酶基因，使保衛(wèi)細(xì)胞葉綠素缺乏，繼而導(dǎo)致氣孔形態(tài)瘦小［6］，意味著葉綠體光系統(tǒng)參與了氣孔的形態(tài)發(fā)生。

葉綠體光系統(tǒng)I（PSI）是光驅(qū)動(dòng)的氧化還原復(fù)合體［7］，其反應(yīng)中心核心組成蛋白包括PSAN（photosystem I reaction center subunit PSI-N）、PSAD-2（photosystem I reaction center subunit II-2）、PSBC（photosystem I iron-sulfur center protein）、CB5-E（cytochrome b5） 和AVP1（Arabidopsisvacuolar proton-pumping pyrophosphatase 1）。PSI 組 裝 蛋 白ycf4（cytochrome f4）等構(gòu)成了調(diào)控PSI 積累的網(wǎng)絡(luò)，質(zhì)體 藍(lán) 素 DRT112（DNA-damage-repair/toleration） 參與PSI 與細(xì)胞色素間電子傳遞。PSI 葉綠素a/b 結(jié)合蛋白2（light-harvesting chlorophyll a/b binding proteins 2, LHCA2）介導(dǎo)LHCII-PSII 磷酸化及其遷移，促進(jìn)PSI-PSII-LHCII 和PSI-LHCII 超復(fù)合體形成［8-10］。

葉綠體PSII 反應(yīng)中心蛋白質(zhì)PSBA（PSII protein D1）、PSBB（PSII CP47 reaction center protein）、PSBC（PSII CP43 reaction center protein）和修復(fù)蛋白PSB27-H1（PSII repair protein PSB27-H1） 等 與葉綠素結(jié)合產(chǎn)生光誘導(dǎo)的光化學(xué)反應(yīng)，PSBA 和PSB27-H1 等也參與PSII 損傷修復(fù)［10-12］。光系統(tǒng)II穩(wěn)定/組裝因子HCF136（photosystem II stability/assembly factor HCF136）、高葉綠素?zé)晒獗硇虷CF173（high chlorophyll fluorescence phenotype 173）和PSII亞 基PSBQ2（oxygen-evolving enhancer protein 3-2）參與PSII 組成亞基和細(xì)胞色素559 的組裝［13-14］，細(xì)胞 色 素b559 亞 基α（PSII cytochrome b559, PSBE）是PSII 反應(yīng)中心電子傳遞鏈組分的核心組分［15］，PETC（cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit）擔(dān)負(fù)PSII 和PSI 間線性和環(huán)形電子傳遞［10,16-18］，在光系統(tǒng)上游，原葉綠素酸酯還原酶B（protochlorophyllide reductase B, PORB）催化原葉綠素酸酯還原產(chǎn)生葉綠素酸酯［19］，cis-八氫番茄紅素去飽和酶PDS3（cis-phytoene desaturase）等代謝八氫番茄紅素形成ζ-胡蘿卜素［20］，ATP 合成酶亞基δ（ATP synthase δ subunit, ATPD）等組成了光合磷酸化ATP 合成酶［21-22］，單脫水抗壞血酸還原酶4（monodehydroascorbate reductase, MDAR4）參與H2O2解毒抗壞血酸合成［23-24］。

在碳固定下游，3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPB（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、1- 磷酸葡萄糖腺苷轉(zhuǎn)移酶APL3（glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 3）、二磷酸果糖醛縮酶FBA3（fructose-bisphosphate aldolase 3）、6- 磷 酸葡萄糖異構(gòu)酶PGI1（glucose-6-phosphate isomerase 1）、蘋(píng)果酸異丙酯脫氫酶IMD2（isopropylmalate dehydrogenase 2）、NADP 依賴的蘋(píng)果酸酶4（NADPdependent malic enzyme 4, NADP-ME4）和磷酸丙酮酸激酶1（pyruvate phosphate dikinase 1, PPDK1）調(diào)控三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循環(huán)CO2固定［25］。谷氨酸合成酶GLU1（glutamate synthase 1）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTF8（glutathione S-transferase F8）代謝還原谷氨酸與疏水親電配體的接合［26-28］。

表皮模式因子2（EPIDERMAL PATTERNING FACTOR2,EPF-2）和Stomagen分別正向和反向調(diào)控葉片氣孔密度, 繼而影響光合作用［29-32］。氣孔形成后，葉肉細(xì)胞蔗糖和蘋(píng)果酸積累、保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體儲(chǔ)存淀粉降解均參與氣孔運(yùn)動(dòng)［33-34］。盡管葉綠體如何介導(dǎo)氣孔發(fā)育有待確定，但可以確定氣孔發(fā)育和運(yùn)動(dòng)與葉綠體內(nèi)相關(guān)代謝密切關(guān)聯(lián)。

研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素結(jié)合蛋白 CP24（chlorophyllbinding protein 24）正向響應(yīng)光照，反向調(diào)控葉綠素積累［35］，葉綠素a/b 結(jié)合蛋白LHCB 6（light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins 6）過(guò)量積累，則氣孔對(duì)赤霉素（abscisic acid, ABA）更為敏感［36］，葉綠素b 缺失突變體的氣孔功能異常，而遮陰條件下LHCB 6 積累增加，氣孔功能隨即恢復(fù)［37］，葉綠體LHCB 成員與氣孔動(dòng)態(tài)如何關(guān)聯(lián)有待確定。

本研究通過(guò)體內(nèi)調(diào)控本氏煙草表皮模式因子2（Nicotiana benthamiana EPIDERMAL PATTERNING FACTOR2，NtEPF2）基因表達(dá)，獲得不同氣孔密度轉(zhuǎn)化株系，測(cè)定不同氣孔密度葉片蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，揭示隨氣孔密度變化葉綠體組分特異表達(dá)蛋白質(zhì)及其表達(dá)變化，明確葉綠體組分蛋白質(zhì)對(duì)氣孔動(dòng)態(tài)的響應(yīng)，結(jié)果對(duì)深入研究氣孔動(dòng)態(tài)具有重要作用，對(duì)高效碳固定分子育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

重組根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101-epf2-和GV3101-epf2+由本實(shí)驗(yàn)室保存，其中分別含有35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的正義和反義StEPF2（DMG400027541）cDNA 重組載體pC-epf2-和pCepf2+，StEPF2 為馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）表皮模式因子編碼基因StEPF2（DMG400027541）。

供試材料本氏煙草（Nicotiana benthamiana）室內(nèi)培養(yǎng)采用旁氏培養(yǎng)基質(zhì)，試管苗及基質(zhì)培養(yǎng)苗培養(yǎng)條件為（24±2）℃，14 h 光照，10 h 黑暗，光照強(qiáng)度為100 μmol/（m2·s），相對(duì)濕度60%-80%，土壤含水量70%±5%。

1.2 方法

1.2.1StEPF2-體內(nèi)轉(zhuǎn)化及表達(dá)陽(yáng)性株系篩選 采用撒世娟等［38］的方法，完成正義和反義StEPF2 在本氏煙草體內(nèi)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化株系培苗培養(yǎng)生長(zhǎng)第30 天時(shí)，采集其頂端幼葉，分別提取gDNA 和總RNA，用于轉(zhuǎn)化陽(yáng)性株系選擇。轉(zhuǎn)化陽(yáng)性株系PCR 選擇用表1 所示的引物EP，按照上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的GUS 試劑盒說(shuō)明書(shū)，完成PCR 陽(yáng)性株系GUS 染色篩選。

按照大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒說(shuō)明，分別用表1 所示的StEPF2 特異引物EP+和EP-完成StEPF2 mRNA 積累RT-PCR 半定量測(cè)定，用比較Ct 值法計(jì)算StEPF2 相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及序列Table 1 Primers and sequences used in the study

1.2.2 陽(yáng)性株系表型測(cè)定 基質(zhì)培養(yǎng)苗齡達(dá)到30 d時(shí)，選擇并標(biāo)記相同位置葉片及葉片相同位置，用15%的硝化纖維素丙酮液均勻涂抹標(biāo)記位置葉片背面，靜止15 min 后用鑷子剝離涂抹位置葉片表皮，置于載玻片蒸餾水滴中，用鑷子展平葉片表皮，用紙吸干多余水分，在展平葉片表皮加10%染色碘液，靜止1 min 后加洗脫蒸餾水，用紙吸干多余水分和碘液，加蓋玻片封閉，排除氣泡和浮色晾干制片并標(biāo)記，顯微鏡下觀察并拍照，以每平方毫米（mm-2）葉片面積為單位計(jì)數(shù)氣孔數(shù)，計(jì)數(shù)設(shè)置3 次，每次計(jì)數(shù)重復(fù)3 次。葉綠素相對(duì)含量和光合參數(shù)測(cè)定按照撒世娟等［38］的方法。

1.2.3 葉片樣品iTRAQ 氣孔密度增加、減少和對(duì)照株系葉片樣品總蛋白提取、質(zhì)檢、定量、去鹽，蛋白質(zhì)酶水解、iTRAQ 標(biāo)記均按照Spanos 等［39］的方法進(jìn)行，水解產(chǎn)物標(biāo)記后樣品等量混合酸化后，用Thermo DINOEX Ultimate 3000 BioRS 色譜儀（Thermo Fisher，USA）分離肽段，用QSTAR XL 質(zhì)譜儀（Applied Biosystems，USA）采集同位素標(biāo)簽豐度等數(shù)據(jù)，計(jì)算同一多肽不同同位素標(biāo)簽豐度比值，以此作為同一多肽的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)及分析 參考Vaudel 等［40］的方法，完成原始數(shù)據(jù)處理和Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，設(shè)定相對(duì)表達(dá)量t檢驗(yàn)顯著為閾值，選擇上下調(diào)及檢出DEPs，在STRING 平 臺(tái)（https://www.string-db.org/） 選 擇多序列檢索工具，用所選擇DEGs 的氨基酸序列，mapping 擬南芥基因組，設(shè)定mapping 一致性大于60%為閾值，選擇氣孔密度增加和減少DEPs。

在GO（GENE ONTOLOGY） 界 面（http://geneontology.org/），用mapping ID 在線完成GO 富集分析；在Panther 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pantherdb.org/tools/）平臺(tái)，分別選擇和下載包含葉綠體的GO 歸類ID 及其包含的全部DEPs ID 和功能注釋，用于其后的葉綠體組分DEGs 比較。

2 結(jié)果

2.1 葉綠素積累模式響應(yīng)氣孔密度變化

篩選得到StEPF2 抑制和過(guò)量表達(dá)株系各2 株，葉片StEPF2 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果如圖1-A 所示，StEPF2 過(guò)量和抑制表達(dá)株系葉片StEPF2基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量，分別極顯著高于和低于對(duì)照，表明研究實(shí)現(xiàn)了StEPF2 體內(nèi)過(guò)量和抑制表達(dá)，獲得了StEPF2 過(guò)量株系ntepf-p1 和ntepf-p2 及抑制株系ntepf-m1 和ntepf-m2。如圖1-F-H 所示，葉片氣孔密度區(qū)別明顯。如圖1-B-D 所示，ntepf-p1 和ntepf-p2 株系葉片氣孔密度、氣孔導(dǎo)度及凈光合速率分別低于對(duì)照株系，ntepf-m1 和ntepf-m2 株系葉片氣孔密度、氣孔導(dǎo)度及凈光合速率分別比對(duì)照提高了約40%、200%和67%，結(jié)果表明，StEPF2 過(guò)量和抑制分別降低和增加了氣孔密度，氣孔密度正向改變氣孔導(dǎo)度和凈光合速率。

圖1 株系 ntepf-m 和ntepf-p 氣孔密度、葉綠素積累、光合測(cè)定和氣孔觀察結(jié)果Fig. 1 Assay on stomatal density, chlorophyll accumulation and photosynthesis as well as stomata observation for ntepf-m and ntepf-p lines

葉綠素含量測(cè)定結(jié)果如圖1-E 所示，高氣孔密度株系上、中、下葉片葉綠素含量均值高于對(duì)照均值43%，且保持了與對(duì)照下部葉片同樣的高水平，對(duì)照株系葉片葉綠素含量自上而下呈現(xiàn)增加的常規(guī)模式。低氣孔密度株系葉片葉綠素含量與對(duì)照株系的常規(guī)模式完全相反，即上、中、下葉片葉綠素含量呈現(xiàn)遞減模式。

以上結(jié)果表明，氣孔密度增加不僅加速了葉片葉綠素形成，而且保持了不同葉齡葉片葉綠素高水平積累。氣孔密度降低加速了幼葉葉綠素積累，但隨葉齡增加而逐漸減少，與對(duì)照株系葉綠素積累自上而下增加的模式比較，氣孔密度降低株系上、中、下葉片葉綠素積累呈現(xiàn)倒置模式。

2.2 氣孔密度增加產(chǎn)生的葉綠體響應(yīng)

依據(jù)設(shè)定的DEPs 相對(duì)定量閾值，選擇iTRAQ識(shí)別DEPs 的結(jié)果顯示，響應(yīng)氣孔密度降低顯著上下調(diào)的DEPs 為381 個(gè)，氣孔密度增加顯著改變了357 個(gè)DEPs 的積累量（P<0.05）。以DEPs 序列映射擬南芥基因組，選擇序列相似性大于60%的DEPs進(jìn)行GO 歸類富集，結(jié)果如表2 所示，ntepf-m 中識(shí)別了更多分子功能GO ID，更多細(xì)胞組分的變化發(fā)生于ntepf-p 中。

表2 與擬南芥同源物相似性大于60% DEPs 的GO 富集結(jié)果Table 2 GO enrichment with DEPs sharing ＞60%similarity with orthologs in Arabidopsis

計(jì)算本研究識(shí)別的GO ID 所含DEPs 個(gè)數(shù)（upload）與擬南芥基因組注釋記載中GO ID 所含DEPs 總數(shù)（REFLIST）間的比值（U/R, upload/REFLIST），用于比較隨氣孔密度變化的GO歸類變化。從GO 富集中選擇葉綠體、類囊體和光系統(tǒng)GO ID，比較獲得氣孔密度增加和降低共同GO ID（圖2）。

圖2 氣孔密度上、下調(diào)葉片DEPs GO 富集中共同出現(xiàn)的葉綠體GO IDsFig. 2 Chloroplast common GO IDs in GO enrichment of DEPs identified from the leaves of up- or downstomatal density

氣孔密度增加和降低共同GO ID 共計(jì)13 個(gè)，U/R 比值比較發(fā)現(xiàn)，共同GO ID 中的ntepf-m 株系U/R比值均顯著高于ntepf-p 株系，其中，ntepf-m 株系GO:0009543 和GO:0031978 兩 個(gè)GO ID 的U/R 比 值均為0.36，即氣孔密度增加調(diào)控了這兩個(gè)GO ID 包含DEPs 的表達(dá)，調(diào)控DEPs 數(shù)量達(dá)到各自GO ID 包含全部DEPs 的36%，而氣孔密度降低僅調(diào)控了全部DEPs 的13%。表明氣孔密度增加牽動(dòng)了更多的DEPs 表達(dá)變化，即氣孔密度增加對(duì)葉綠體組分等產(chǎn)生更明顯影響。

比較識(shí)別了如表3 所示的ntepf-m 株系特異GO ID，10 個(gè)GO ID 中的7 個(gè)分別來(lái)自光系統(tǒng)I 和光系統(tǒng)II，且U/R 比值平均數(shù)0.34，表明氣孔密度增加特異調(diào)控了光系統(tǒng)近1/3 組分的表達(dá)。比較結(jié)果未見(jiàn)ntepf-p 株系特異GO ID，表明氣孔密度降低并未誘導(dǎo)葉綠體特異DEPs 表達(dá)變化，相對(duì)而言，氣孔密度增加誘導(dǎo)了更多葉綠體特異DEPs 表達(dá)變化，這與ntepf-m 和ntepf-p 株系兩者共同GO ID 中DEPs表達(dá)變化趨勢(shì)一致。

表3 氣孔密度增加特異DEPs GO 富集Table 3 GO enrichment with stomatal density rising specific DEPs

2.3 氣孔密度增加正向調(diào)控PSI電子傳遞

下載各GO ID 所含DEPs，刪除重復(fù)項(xiàng)及未審核（unreviewed）DEPs 后，選擇得到如圖3 所示的22 個(gè)共表達(dá)DEPs，其中隨氣孔密度增加表達(dá)量降低的DEPs 有15 個(gè)（圖3-A, B），表達(dá)量隨之增加的DEPs 有7 個(gè)（圖3-C）。

圖3 氣孔密度上、下調(diào)葉片共表達(dá)DEPs 積累變化Fig. 3 Accumulation variation of co-expreesion DEPs resulting from the leaves of up- or down-stomatal density

7 個(gè)DEPs 表達(dá)量隨氣孔密度正向變化，且其在高氣孔密度下的積累量較低氣孔密度高2.2-10.6倍，另外15 個(gè)DEPs 的積累量與氣孔密度呈反向變化，即低氣孔密度下的積累量較高氣孔密度高2.0-24.6 倍。

高氣孔密度下顯著升高的7 個(gè)DEPs 中，IMD2、NADP-ME4 和PPDK1 參與CO2固定的三羧酸循環(huán)（TCA）。光系統(tǒng)I 反應(yīng)中心蛋白N（PSAN）、細(xì)胞色素b5（CB5-E）、質(zhì)子泵（AVP1）是光系統(tǒng)電子傳遞鏈的核心組分。這些蛋白質(zhì)顯著增加結(jié)果表明，氣孔密度增加正向調(diào)控TCA 和PSI 電子傳遞。

氣孔密度降低上調(diào)了15 個(gè)共表達(dá)DEPs，光系統(tǒng)II 穩(wěn)定/組裝因子HCF136、高葉綠素?zé)晒獗硇虷CF173 和光系統(tǒng)II 亞基Q-2（PSBQ2）參與PSII 組成亞基D1、D2 和細(xì)胞色素559 的組裝，質(zhì)體藍(lán)素（DRT112）參與PSI P700 與細(xì)胞色素b6-f 間電子傳遞，3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPB）參與TCA 中1,3二磷酸甘油酸還原，八氫番茄紅素去飽和酶3（PDS3）代謝八氫番茄紅素形成ζ-胡蘿卜素。

這些DEPs 積累隨氣孔密度降低上調(diào)表達(dá)的結(jié)果表明，氣孔密度降低產(chǎn)生了PSII 組成亞基組裝、PSI 電子傳遞和TCA 的改變，胡蘿卜素合成增加預(yù)示著氣孔密度降低增強(qiáng)了光保護(hù)反應(yīng)。

2.4 氣孔密度增加促進(jìn)PSII-PSI復(fù)合體形成

氣孔密度增加條件下，識(shí)別了如圖4 所示的15個(gè)DEPs，其中如圖4-A 所示的PSI 葉綠素a/b 結(jié)合蛋白2（LHCA2）和細(xì)胞色素b559 亞基α（PSBE）積累分別上調(diào)了（1.77±0.22）和（1.62±0.20）倍。LHCA2 介導(dǎo)LHCII-PSII 磷酸化及其遷移，促進(jìn)PSIPSII-LHCII 和PSI-LHCII 超復(fù)合體形成，電子傳遞鏈組分PSBE 是PSII 反應(yīng)中心的核心組分之一，兩者積累上調(diào)的結(jié)果表明，氣孔密度增加，加速了PSIIPSI 復(fù)合體形成和其電子傳遞。

圖4 氣孔密度增加特異響應(yīng)DEPs 積累變化Fig. 4 Accumulation variation of specific DEPs in response to rising stomatal density

氣孔密度增加條件下，識(shí)別了如圖4-B 所示的7 個(gè)DEPs 表達(dá)特異下調(diào)表達(dá)，其中PSI 反應(yīng)中心亞基II-2（PSAD-2）減少了約18%，PSI 鐵硫中心蛋白（PSBC）減少了約81%。PSI 是光驅(qū)動(dòng)的電子傳遞氧化還原復(fù)合體，這些PSI 基本組分積累隨氣孔密度增加而降低的結(jié)果表明，氣孔密度增加，改變PSII 和PSI 間電子傳遞模式。

氣孔密度增加條件下，識(shí)別了如圖4-C 所示的4 個(gè)特異下調(diào)表達(dá)PSII 組成蛋白質(zhì)，PSII 反應(yīng)中心組 成 蛋 白PSBA、PSBB（CP47） 和PSBC（CP43）積累分別減少了約58%、56%和81%，三者下調(diào)表達(dá)的結(jié)果表明，氣孔密度增加，改變了PSII 組分及其與葉綠素結(jié)合模式。PSB27-H1 積累下調(diào)也意味著PSII 光系統(tǒng)損傷修復(fù)的改變。

結(jié)合圖1-B、D 和E 結(jié)果表明，氣孔密度增加，改變了PSII 反應(yīng)中心蛋白質(zhì)結(jié)合及光系統(tǒng)損傷修復(fù)模式，加速了PSII-PSI 復(fù)合體形成和其電子傳遞，保持了不同葉齡葉片葉綠素高水平積累，凈光合速率隨之增強(qiáng)。

氣孔密度增加增強(qiáng)了PSII 和PSI 間的電子傳遞、光損傷修復(fù)水平降低的結(jié)論，與本文結(jié)果2.3 中氣孔密度增加，增強(qiáng)了電子傳遞、降低光損傷修復(fù)的結(jié)論一致。

2.5 氣孔密度降低倒置了葉綠素積累模式

氣孔密度降低條件下，識(shí)別了如圖5 所示的特異表達(dá)蛋白質(zhì)。如圖5-A 所示，PORB 和ATPD 分別是對(duì)照的（11.85±2.56）和（4.29±1.22）倍，PORB 催化原葉綠素酸酯還原產(chǎn)生葉綠素酸酯，ATPD 是光合磷酸化中F1F0 復(fù)合體組分，兩者顯著上調(diào)表達(dá)的結(jié)果表明，氣孔密度降低增加了葉綠素積累和光合磷酸化ATP 合成。

氣孔密度降低誘導(dǎo)了5 個(gè)蛋白質(zhì)特異下調(diào)表達(dá)，其表達(dá)倍數(shù)如圖5-B 所示，1-磷酸葡萄糖腺苷轉(zhuǎn)移酶3（APL3）、二磷酸果糖醛縮酶3（FBA3）、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶1（PGI1）積累隨氣孔密度減少分別降低了約33%、53%和59%，即氣孔密度降低，碳固定下游代謝酶的積累僅是對(duì)照的約一半。

圖5 氣孔密度降低特異響應(yīng)DEPs 積累變化Fig. 5 Accumulation variation of specific DEPs in responses to lowering stomatal density

結(jié)合圖1-B、D 和E 結(jié)果，考慮到用于iTRAQ的樣品是頂端幼葉，以上結(jié)果表明，氣孔密度降低，增加了幼葉葉綠素積累和光合磷酸化ATP 合成，但碳固定下游代謝活性顯著降低，隨葉齡增加葉綠素積累遞增，株系上、中、下葉片葉綠素積累呈現(xiàn)倒置模式。

3 討論

3.1 提高氣孔密度可能是應(yīng)對(duì)大氣CO2升高的有效途徑

CO2還原和H2O 光解發(fā)生在葉綠體內(nèi)，氣孔作為CO2和H2O 進(jìn)出葉綠體的開(kāi)關(guān)，響應(yīng)環(huán)境變化調(diào)控CO2和H2O 的進(jìn)出。長(zhǎng)期進(jìn)化形成了氣孔相對(duì)固定的調(diào)控模式，維持CO2和H2O 的進(jìn)出平衡，協(xié)調(diào)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)［41-42］。大氣CO2上升及溫室等人造環(huán)境的應(yīng)用，要求植物重新建立氣孔適應(yīng)環(huán)境的平衡［42］。揭示光合作用響應(yīng)氣孔變化機(jī)制，不僅有助于更深入理解氣孔的工作原理，而且可能開(kāi)辟通過(guò)調(diào)控氣孔增加作物產(chǎn)量的全新育種思路。

有研究已明確，氣孔密度隨大氣CO2上升而降低［1-3］，CO2富集誘導(dǎo)氣孔導(dǎo)度降低達(dá)22%［4］，表明以往大氣CO2濃度是植物碳固定的飽和臨界點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)低氣孔密度導(dǎo)致CO2吸收不足，碳饑餓導(dǎo)致葉綠體早衰，碳固定僅為高氣孔密度下的1/3；高氣孔密度增強(qiáng)光合電子傳遞，維持高水平葉綠素積累和CO2固定；高低氣孔密度導(dǎo)致的相反結(jié)果為應(yīng)對(duì)大氣CO2升高提供有益的啟示。

3.2 LHCA2促進(jìn)PSI-PSII-LHCII超復(fù)合體形成，參與了氣孔響應(yīng)

光捕獲復(fù)合體PSI（LHCI）由高達(dá)70 個(gè)葉綠素a 和b 及15 個(gè)胡蘿卜素和蛋白組成，其功能是吸收光能［10］，LHCA2 介導(dǎo)LHCII-PSII 磷酸化，促進(jìn)PSI-PSII-LHCII 和PSI-LHCII 超復(fù)合體形成［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)LHCA2 積累隨氣孔密度增加而上升，即氣孔密度增加誘導(dǎo)LHCA2 積累增加，兩者呈現(xiàn)正向變化；低氣孔密度誘導(dǎo)LHCA2 積累減少，與PSIPSII-LHCII 和PSI-LHCII 超復(fù)合體結(jié)合的葉綠素應(yīng)該減少；高溫誘導(dǎo)氣孔導(dǎo)度和葉綠體熒光參數(shù)降低、幼葉氣孔形成和葉綠素合成基因呈現(xiàn)低水平表達(dá)的研究報(bào)道［5］，證實(shí)了以上推測(cè)結(jié)論。

3.3 氣孔密度、碳固定正向調(diào)控葉綠素積累

正常氣孔密度下，幼葉氣孔形成和葉綠素合成基因呈現(xiàn)低水平表達(dá)［5］，低氣孔密度下，幼葉PORB 和ATPD 高表達(dá)顯著增加了葉綠素積累，但隨著葉片發(fā)育，葉綠素積累迅速降低。該結(jié)果為氣孔密度決定葉綠素積累提供了直接證據(jù)，結(jié)果也意味著大氣CO2上升誘導(dǎo)的氣孔密度降低可能減少光合產(chǎn)物的積累。

研究顯示，保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)葉綠素酶基因?qū)е氯~綠素缺乏及氣孔形態(tài)瘦?。?］，葉肉細(xì)胞光合作用下游產(chǎn)物蔗糖和蘋(píng)果酸積累參與氣孔運(yùn)動(dòng)動(dòng)態(tài)［11］，即除了外界環(huán)境因素調(diào)控氣孔動(dòng)態(tài)外，葉綠體內(nèi)代謝物也對(duì)氣孔動(dòng)態(tài)產(chǎn)生反饋調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)氣孔密度正向調(diào)控葉綠素積累，這些結(jié)果指向氣孔密度與葉綠素積累存在相互作用，葉綠素B 缺失突變體的氣孔功能異常也證實(shí)了這一點(diǎn)［15］，互作途徑解析則需本研究識(shí)別的響應(yīng)氣孔密度動(dòng)態(tài)的DEPs。

3.4 氣孔密度可能成為改變光系統(tǒng)損傷修復(fù)的途徑

PSII 反應(yīng)中心組成蛋白PSBB 和PSBC 可結(jié)合葉綠素啟動(dòng)光化學(xué)反應(yīng)，又具有光系統(tǒng)損傷修復(fù)功能［22］。正常氣孔密度下，遮陰可彌補(bǔ)葉綠素B 缺失，恢復(fù)氣孔功能［37］，遮陰意味著光保護(hù)色素胡蘿卜素減少、光損傷修復(fù)水平下降，葉綠素積累增加吸收更多光子，以彌補(bǔ)遮陰的光照不足。本研究發(fā)現(xiàn)氣孔密度增加，PSBB 和PSBC 積累隨之減少，光系統(tǒng)損傷修復(fù)水平下降。遮陰和氣孔密度增加均導(dǎo)致光損傷修復(fù)水平下降，遮陰減少光照，無(wú)需高水平光系統(tǒng)損傷修復(fù)，高氣孔密度下的低水平光系統(tǒng)損傷修復(fù)意味著，高氣孔密度誘導(dǎo)的光系統(tǒng)增強(qiáng)了對(duì)光照的耐受，即調(diào)控氣孔密度增強(qiáng)植物對(duì)光照的適應(yīng)性存在潛力。

4 結(jié)論

氣孔密度增加，加速了PSII-PSI 復(fù)合體形成和其電子傳遞，降低了光損傷修復(fù)水平，保持了不同葉齡葉片葉綠素積累和凈光合的高水平，碳固定隨之增加。氣孔密度降低，幼葉葉綠素和ATP合成增強(qiáng)，碳固定下游代謝酶積累減少，隨葉齡增加，葉片葉綠素積累模式發(fā)生了倒置。