常慧娟，孟夜，朱玉榕，班燕芳，章建國(guó)，王芝濤，秦慧

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥 230601

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是血液系統(tǒng)第2 常見(jiàn)惡性腫瘤［1］，其進(jìn)展是一個(gè)多步驟的過(guò)程，起初是一個(gè)癌前狀態(tài)，如意義未明的單克隆丙種球蛋白?。∕GUS）和無(wú)癥狀骨髓瘤。隨后MM 可以進(jìn)展為漿細(xì)胞白血病（PCL）［2］。盡管近年來(lái)對(duì)于MM 治療已有較大進(jìn)展［3］，然而，目前的標(biāo)準(zhǔn)療法并未改善伴有髓外病變患者的預(yù)后［4-5］。有研究［6］表明，隨著MM患者生存率升高，PCL 發(fā)病率較前上升，但PCL 對(duì)于現(xiàn)有的治療方案不敏感，預(yù)后較差。因此，研究與MM 疾病進(jìn)展相關(guān)的機(jī)制，尋找新的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，有助于為MM 的診斷、靶向藥物研究及預(yù)后評(píng)價(jià)提供新的思路及理論依據(jù)。目前利用生物信息學(xué)工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析已在多種腫瘤研究中得到應(yīng)用，但其在MM 中的相關(guān)應(yīng)用研究較少。本研究利用可公開(kāi)獲得的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選MM 與PCL 的差異表達(dá)基因（DEGs），了解其生物學(xué)功能，明確關(guān)鍵基因與MM預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中輸入檢索詞“multiple myeloma”“extramedullary multiple myeloma”進(jìn)行搜索，篩選得到含有MM 及PCL患者基因數(shù)據(jù)樣本量較大的GEO基因芯片數(shù)據(jù)集GSE66291［7］以及GSE70323［8］。GSE66291 數(shù)據(jù)集平臺(tái)為GPL19824，包括114 例MM患者和72 例PCL 患者基因數(shù)據(jù)樣本；GSE70323 數(shù)據(jù)集平臺(tái)為GPL20614，包括192 例MM 患者和62 例PCL患者基因數(shù)據(jù)樣本。

1.2 MM 與PCL DEGs 的獲取與分析 用R 軟件（v.3.6.3）對(duì)上述兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的原始微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及l(fā)og2 轉(zhuǎn)換。基于平臺(tái)上的注釋信息，將探針I(yè)Ds 轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的基因名。當(dāng)多個(gè)探針對(duì)應(yīng)于同一基因時(shí)，計(jì)算平均表達(dá)值來(lái)表示基因表達(dá)水平。使用R 軟件讀取上述兩個(gè)數(shù)據(jù)集，使用LIMMA包分別在上述兩個(gè)數(shù)據(jù)集中篩選DEGs，篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2 FC|＞1 且P＜0.05。FC（fold change）表示DEGs的差值倍數(shù)。使用R 軟件中的ggplot2 和pheatmap程序包分析DEGs 的差異性表達(dá)并進(jìn)行可視化，使用在線(xiàn)工具Draw Venn diagram（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ Venn /）繪制Venn 圖，找出在兩組基因芯片數(shù)據(jù)集中同時(shí)上調(diào)或者下調(diào)的交集基因，即為MM 與PCL DEGs，下簡(jiǎn)稱(chēng)為DEGs。

1.3 DEGs 生物學(xué)功能分析 在R 中使用Cluster-Profiler 包，采用基因本體論（GO）分析DEGs 的基因本體功能，包括生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)部分；采用京都基因及基因組百科全書(shū)（KEGG） 進(jìn)行DEGs 的信號(hào)通路富集分析。以adjustP＜0.05 作為篩選條件選出富集結(jié)果，將其可視化。

1.4 關(guān)鍵基因的篩選 利用String 在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string.embl.de/）對(duì)上述所得的DEGs 進(jìn)行分析，構(gòu)建DEGs 的蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），使用Cytoscape 軟件（http：//cytoscape.org/）對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。使用Cytohubba 插件對(duì)PPI 上所有DEGs 進(jìn)行評(píng)分，本研究選取相關(guān)度前20 位的DEGs作為關(guān)鍵基因，即hub基因。

1.5 關(guān)鍵基因的表達(dá)與MM 患者預(yù)后的關(guān)系分析 根據(jù)關(guān)鍵基因的mRNA 表達(dá)值，將MM 患者分為高表達(dá)組及低表達(dá)組，并在芯片數(shù)據(jù)集GSE24080［9-12］對(duì)高表達(dá)組及低表達(dá)組MM 患者進(jìn)行生存預(yù)后分析。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，表示該基因?qū)τ贛M患者總體生存率具有顯著影響。

2 結(jié)果

2.1 DEGs 及其生物學(xué)功能 總共獲得了210 例MM和57例PCL患者的基因數(shù)據(jù)，篩選得到DEGs共389 個(gè)，其中120 個(gè)（30.8%）基因表達(dá)上調(diào)，269 個(gè)（69.2%）基因表達(dá)下調(diào)。

GO 分析結(jié)果顯示：DEGs 參與表達(dá)的細(xì)胞組分主要與細(xì)胞膜外區(qū)域相關(guān)；在生物過(guò)程方面，主要參與白細(xì)胞游走、中性粒細(xì)胞聚集、體液免疫等；分子功能方面，主要與抗原結(jié)合相關(guān)。KEGG結(jié)果提示DEGs在細(xì)胞黏附分子、局灶性黏附等相關(guān)通路上富集。

2.2 關(guān)鍵基因及其與MM 預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)MCC算法選出得分前20 的基因即為關(guān)鍵基因，分別為L(zhǎng)YZ，MMP8，QPCT，CRISP3，MMP9，PPBP，HBB，BPI，RNASE3，MPO，RNASE2，PLAC8，CD44，ITGA6，CDH1，CXCL12，ITGB7，ITGB3，VCAM1，PECAM1。

在GSE24080數(shù)據(jù)集中分析結(jié)果表明，CXCL12、CDH1、RNASE3、LYZ、PPBP、VCAM1、QPCT、PECAM1 的高表達(dá)組（279 例）總體生存率分別為75.6%、77.8%、74.2%、75.6%、74.6%、73.8%、76.0%、78.1%，低表達(dá)組（280 例）總體生存率分別為70.0%、67.9%、71.4%、70.0%、71.1%、71.8%、69.6%、67.5%，高表達(dá)組高于低表達(dá)組（P均＜0.05）。MMP8 基因、MMP9、CRISP3、HBB、PLAC8、ITGA6、ITGB3的下調(diào)對(duì)于MM 的總體生存率無(wú)顯著影響（P均＞0.05）。

3 討論

MM 是常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其髓外病變（EMD）是一種骨髓外單克隆漿細(xì)胞惡性增殖，在MM 患者診斷時(shí)的發(fā)生率為7%～17%，在疾病過(guò)程中的發(fā)生率為6%～20%［13］。PCL 是一種罕見(jiàn)的具有侵襲性的骨髓瘤變種，其外周血中存在20%以上的漿細(xì)胞或漿細(xì)胞絕對(duì)值大于2×109/L，占MM 患者的2%～4%［14］。盡管目前不斷引入新的治療方案［15-16］，但EMD 和PCL 仍預(yù)后不良［17-18］。因此了解從MM 到PCL 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和關(guān)鍵基因?qū)τ贛M EMD的診斷和治療有重要意義。

本研究選取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中MM和PCL樣本量較大的兩組基因芯片數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其分析，從而篩選出DEGs 共389 個(gè)，其中120 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，269 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。對(duì)于DEGs 進(jìn)行GO 分析的結(jié)果提示DEGs 主要參與白細(xì)胞游走、體液免疫等生物學(xué)過(guò)程。KEGG 分析顯示DEGs 在細(xì)胞黏附分子、局灶性黏附等相關(guān)通路上集中富集。這表明篩選出的DEGs 可能在干擾正常組織的免疫功能及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵犯正常組織方面發(fā)揮作用。對(duì)于DEGs 進(jìn)行PPI分析，再通過(guò)一組基因芯片對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行預(yù)后分析，共獲得CXCL12、CDH1 等8 個(gè)關(guān)鍵基因，其可能在MM 進(jìn)展中起重要作用。

CXCL12屬于細(xì)胞趨化因子，其通過(guò)Wnt信號(hào)通路表達(dá)增強(qiáng)導(dǎo)致破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的失衡，并導(dǎo)致克隆性漿細(xì)胞侵襲骨骼，促進(jìn)MM 進(jìn)展［19］。ZHANG 等［20］研究表明，CXCL12 在MM 患者骨髓中表達(dá)升高，其高表達(dá)提示預(yù)后較差。另外CXCL12參與的其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑也與瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)，如CXCL12/CXCR4 途徑能導(dǎo)致胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤性疾病進(jìn)展，其高表達(dá)與患者生存率呈負(fù)相關(guān)［21-22］。CDH1 屬于鈣黏蛋白家族，其參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附等生物學(xué)過(guò)程［23］。BI 等［24］研究表明，單克隆漿細(xì)胞會(huì)通過(guò)CDH1 途徑影響漿細(xì)胞樣樹(shù)突樣細(xì)胞，促進(jìn)MM 的發(fā)病并逃避免疫監(jiān)視，參與乳腺癌、胃癌等疾病相關(guān)的過(guò)程［25-26］。陳定宇等［27］研究表明，CDH1 過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后較差。但目前尚未有CDH1 表達(dá)與MM 患者預(yù)后相關(guān)性的報(bào)道。PECAM1，也稱(chēng)為CD31，屬于免疫球蛋白家族，其在促進(jìn)血管生成、增加血管通透性等方面發(fā)揮作用［28-29］。PECM1 高表達(dá)可增加細(xì)胞的侵襲能力，導(dǎo)致肝癌、胃癌等腫瘤患者預(yù)后較差［30］。VCAM1 是一種糖蛋白，參與炎癥反應(yīng)、免疫疾病等過(guò)程。TERPOS 等［31］研究表明，VCAM1 水平升高的MM 患者預(yù)后較差。在胃癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中，VCAM1 高表達(dá)會(huì)促進(jìn)血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究篩選出來(lái)的其他關(guān)鍵基因，如RNASE3、LYZ 、PPBP 、QPCT 等在MM 與PCL 患者中雖然具有差異性表達(dá)，但與MM 相關(guān)的機(jī)制尚未明確。

本研究發(fā)現(xiàn)上述8 個(gè)差異基因均在MM 骨髓組織中高表達(dá)，其高表達(dá)組較低表達(dá)組總體生存率高。既往研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12、CDH1、PECAM1 及VCAM1 高表達(dá)促進(jìn)MM 進(jìn)展，MM 患者預(yù)后較差。但本研究對(duì)其進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)組患者生存率較高，這可能是基因檢測(cè)技術(shù)的提高、新型免疫調(diào)節(jié)藥物及造血干細(xì)胞移植等治療方案廣泛應(yīng)用于臨床，導(dǎo)致MM患者預(yù)后較前改善。

綜上所述，MM 與PCLD 的DEGs 中120 個(gè)上調(diào)，269 個(gè)下調(diào)。DEGs 主要與細(xì)胞膜外區(qū)域相關(guān)，參與白細(xì)胞游走、與抗原結(jié)合、調(diào)控細(xì)胞黏附分子及局灶性黏附等相關(guān)通路。CXCL12、CDH1、RNASE 3、LYZ、PPBP 、VCAM1 、QPCT 和PECAM1 可能是與MM患者預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，其高表達(dá)組MM患者預(yù)后較好，但本研究的結(jié)果還需要進(jìn)一步進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，這些基因可能會(huì)為MM或者其他腫瘤的研究提供新的思路。