羅萬珍，王丹，齊宏玥，王彤，劉政，田李，戴小楓，陳捷胤?，麥合木提江·米吉提

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北荒漠綠洲農(nóng)林外來入侵生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院西部農(nóng)業(yè)研究中心，新疆昌吉831100；4牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157012；5石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000；6曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜 273165；7新疆慧爾農(nóng)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，新疆昌吉 831199

0 引言

【研究意義】作物黃萎病（Verticilliumwilt）是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的植物土傳維管束真菌病害。大麗輪枝菌具有寄主范圍廣、變異快和致病機(jī)理復(fù)雜等特點(diǎn)，引起的作物黃萎病難以防治，造成世界范圍內(nèi)經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量的巨大損失[1]。目前作物黃萎病的防治手段包括抗病品種選育、物理防治和化學(xué)藥劑處理等?？共∑贩N選育具有育種周期長、易產(chǎn)生品種退化導(dǎo)致的抗病性喪失、其他病原菌發(fā)展為優(yōu)勢種群等問題，物理防治不能從根本上防治黃萎病的發(fā)生，化學(xué)藥劑長期使用會導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng)、土壤有益微生物減少等[2]。因此，開發(fā)安全、高效的生物防治產(chǎn)品可能是防治作物黃萎病的新途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】豐富的功能微生物資源是生物防治措施研發(fā)的關(guān)鍵，目前報道的生防微生物資源包括芽孢桿菌（Bacillusspp.）、鏈霉菌（Streptomycesspp.）、木霉（Trichodermaspp.）和假單胞菌（Pseudomonasspp.）等[3]。芽孢桿菌因其對葉面、土壤傳播和采后真菌病害的拮抗作用已被廣泛應(yīng)用[4]。假單胞菌對多種植物病原菌具有很好的抑制作用，具有誘導(dǎo)植物抗性[5]、產(chǎn)生多種具有抑菌活性的次級代謝物[6]、產(chǎn)生生長素和鐵載體促進(jìn)植物生長發(fā)育等特性[7-8]，適合防治土傳病害。張煜琦等[9]研究表明，假單胞菌PSB-06處理番茄植株后能夠抑制其褪綠病的傳播，通過提高番茄茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）防御途徑激發(fā)抗病功能并促進(jìn)其生長；BIESSY等[10]研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌產(chǎn)生的吩嗪、鐵載體能有效抑制馬鈴薯晚疫病、瘡痂病以及黃萎病的病原菌。在過去的20年中，假單胞菌屬的許多細(xì)菌已被證明是黃萎病菌的有效拮抗菌[11-12]。BERG等[13]發(fā)現(xiàn)在對黃萎病菌具有拮抗作用的560株分離菌中，假單胞菌占77%；LIU等[14]采用平板抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)假單胞菌GWSMS-1粗提物中的幾丁質(zhì)酶能顯著抑制大麗輪枝菌菌絲生長。銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）、熒光假單胞菌（P.fluorescens）作為黃萎病菌的拮抗菌已有很多報道[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)室對分離自健康棉田根際土壤的細(xì)菌進(jìn)行了抑菌活性篩選，其中一株細(xì)菌KRS022對大麗輪枝菌具有較強(qiáng)拮抗功能，該菌株具有繁殖速度快、易培養(yǎng)等特點(diǎn)，16S rDNA序列分析初步明確該菌株屬于假單胞菌，其防治效果及抑菌機(jī)理還需進(jìn)一步探究。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過明確拮抗菌株KRS022的分類地位、測定其對病原真菌的抑制作用、對由大麗輪枝菌引起的棉花和煙草黃萎病的防治效果以及檢測植物抗性相關(guān)基因的表達(dá)，為該菌株生防菌劑的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年9月至2022年9月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 材料

供試菌株：大麗輪枝菌Vd991、尖鐮孢（Fusarium oxysporum）、禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosprioides）、果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）；貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）Bv17、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、生防細(xì)菌KRS022均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

供試植物：煙草（Nicotiana benthamianaLAB）、棉花（Gossypium hirsutumcv.Junmian No.1，品種為軍棉1號）在25℃溫室培育，光照16 h，暗處理8 h。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、完全培養(yǎng)基（CM）、細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB）、酪素培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、嗜鐵素檢測固體培養(yǎng)基（CAS）[17]、解磷菌無機(jī)磷固體培養(yǎng)基（PVK）、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基（SB）、阿須貝氏無氮培養(yǎng)基（Ashby）[18]、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（MR-VP）、吲哚培養(yǎng)基（IM）、克氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、利夫森二氏培養(yǎng)基（HL）[19]、血瓊脂平板（BAP）。

1.2 KRS022菌液及大麗輪枝菌孢子懸浮液的制備

將實(shí)驗(yàn)室分離篩選所得KRS022原始菌株從平板上用挑針挑取單菌落，接種于含25 mL LB液體培養(yǎng)基的50 mL離心管進(jìn)行液體發(fā)酵，進(jìn)行種子液的制備，28℃，200 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h。為進(jìn)一步純化培養(yǎng)，將得到的KRS022種子液體按2%的接種量接種至含有200 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，于同樣的發(fā)酵條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h，得到KRS022菌液（OD600約為3.0）。

將在 PDA平板上生長的大麗輪枝菌切成小塊放入CM培養(yǎng)液，25℃振蕩培養(yǎng)4 d，用滅菌紗布過濾掉帶菌絲的培養(yǎng)基，倒入50 mL離心管，4 000 r/min高速離心10 min，去上清留菌體，加無菌水重懸，得到孢子懸浮液，將濃度調(diào)為1×107個/mL。

1.3 KRS022菌株顯微形態(tài)鑒定

劃線接種細(xì)菌于LB固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)，觀察并記錄24 h和72 h菌落大小、顏色及形態(tài)特征，并用革蘭氏染色試劑盒（購自北京酷來搏科技有限公司）對該生防菌進(jìn)行革蘭氏染色。

1.4 KRS022菌株生理生化特征及其功能鑒定

對KRS022進(jìn)行明膠水解、檸檬酸鹽利用、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、厭氧試驗(yàn)、葡萄糖酵解試驗(yàn)以及血平板試驗(yàn)的生理生化測定，生理生化試驗(yàn)參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[21]。對KRS022的產(chǎn)鐵載體、解磷、解鉀、固氮以及蛋白酶、淀粉酶、過氧化氫酶活能力進(jìn)行測定[22]。

甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)以及檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：從 LB平板挑取 KRS022菌體分別接入 MR-VP、IM以及檸檬酸鹽培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2 d后滴加甲基紅、吲哚、溴麝香草酚藍(lán)指示劑，觀察顏色變化；過氧化氫酶試驗(yàn)：透明試管配置 3%過氧化氫水溶液，從LB平板挑取KRS022菌體放入試管中觀察是否產(chǎn)生大量氣泡；厭氧試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)以及葡萄糖酵解試驗(yàn)是從LB平板挑取KRS022菌體分別穿刺進(jìn)PDA、明膠以及HL培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2 d后分別觀察菌體在培養(yǎng)基內(nèi)是否生長、菌體周圍液化情況以及培養(yǎng)基顏色變化；血平板試驗(yàn)：蘸取KRS022菌液劃線于BAP平板，12 h后觀察是否生長及菌體顏色。鐵載體、解磷、解鉀、固氮、蛋白酶、淀粉酶試驗(yàn)：取10 μL的KRS022發(fā)酵原液分別滴于CAS、PVK、SB、Ashby、酪素及淀粉酶培養(yǎng)基平板中央，28℃培養(yǎng)4 d后分別觀察平板是否有黃紅色菌落、產(chǎn)生透明光圈、出現(xiàn)油狀菌落、菌落周圍出現(xiàn)透明圈、滴加盧哥氏碘液菌落為棕色來鑒定其能力。

1.5 KRS022菌株分子鑒定

以KRS022基因組DNA為模板，利用16S rDNA特異性引物 Primer-27F（5′-GAAGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′）和 Primer-1540R（5′-CTACGGCTACCTT GTTACGA-3′）與gyrB特異性引物 UP2F（5′-GAA GTCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTY GA-3′）和 UP2R（5′-AGCAGGGTACGGATG TGCGA GCCRTCNACRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′）進(jìn)行PCR，將得到的擴(kuò)增片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將16S rDNA與gyrB測序結(jié)果串聯(lián)在NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast進(jìn)行序列比對，獲得同源性最高的典型菌株序列。利用MEGA 6.0，ClustalW比對，采用比鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值為1 000。

1.6 KRS022抑菌活性測定

采用對峙培養(yǎng)法和對扣熏蒸法測定KRS022對大麗輪枝菌、尖鐮孢、禾谷鐮孢、稻瘟病菌、灰葡萄孢、膠孢炭疽菌和果生炭疽菌7種病原真菌的抑菌活性。對峙培養(yǎng)法：接種直徑為 6 mm的真菌菌餅于 PDA平板中央，在菌餅上/下方2 cm的位置用KRS022發(fā)酵原液劃線為處理組，劃線空白LB為對照組；對扣熏蒸法：取100 μL的KRS022發(fā)酵原液涂布LB平板，將接種真菌的PDA平板同涂布KRS022的LB平板對扣密封為處理組，涂布空白LB液體密封為對照組。每個處理設(shè)置5個重復(fù)，25℃根據(jù)其生長情況培養(yǎng)4—10 d后取出觀察。真菌生長抑制率（%）=[（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）]/對照組菌落直徑×100。

1.7 KRS022對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)及菌絲生長的影響

采用發(fā)酵菌液平板法、涂布法以及對扣熏蒸法明確KRS022對大麗輪枝菌的抑制效果。發(fā)酵菌液平板法：將直徑6 mm大麗輪枝菌Vd991接種于KRS022菌液與PDA按1∶9比例混合的平板中央；涂布法：將直徑6 mm的Vd991接種于表面涂有KRS022菌液的PDA平板。每處理3個重復(fù)，25℃培養(yǎng)10 d后觀察KRS022對大麗輪枝菌抑制情況。

KRS022無細(xì)胞上清液與大麗輪枝菌孢子懸浮液（1×107個/mL）等比例混合培養(yǎng)進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)，LB液體混合孢子懸浮液為對照，每處理15個重復(fù)，25℃培養(yǎng)48 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)及菌絲生長情況；取 200 μL Vd991孢子懸浮液（1×107個/mL）涂布于貼有無菌微孔濾膜的PDA平板，并與涂布KRS022發(fā)酵原液的LB平板對扣熏蒸10 d后觀察菌絲生長情況。

1.8 KRS022菌液室內(nèi)防治效果測定

待棉花長至3周齡、煙草長至4周齡，用KRS022菌液（OD600=1.0）對其灌根處理，以清水灌根的植株為對照。2 d后分別接種大麗輪枝菌 Vd991（1×107個/mL），每盆灌根30 mL，進(jìn)行4個重復(fù)，定期統(tǒng)一澆水。30 d后觀察植株發(fā)病情況，剖莖觀察各處理組維管束是否被侵染使其褪綠變色。

1.9 定量PCR檢測大麗輪枝菌繁殖量

室內(nèi)防治效果試驗(yàn)30 d觀察發(fā)病情況時，使用天根DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒提取棉花和煙草根部DNA，利用定量PCR（qPCR）檢測大麗輪枝菌Vd991在棉花和煙草植株莖基部的相對繁殖量。以大麗輪枝菌的延伸因子Verticillium dahliaeelongation factor 1-α（VdEF1-α）在棉花和煙草莖基部的相對拷貝數(shù)來衡量大麗輪枝菌的相對生物量，棉花和煙草的內(nèi)參基因均為 18S rRNA和延伸因子elongation factor 1-α（EF1-α）。試驗(yàn)過程中定量引物序列為 18S-F（5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′）和 18S-R（5′-TGTCACTACCTCCCCGTGTCA-3′）；NbEF-F（5′-AGGATACAACCCTGACAAGA-3′）和NbEF-R（5′-GTGGGACCAAAAGTAACAAC-3′）；VdEF-α-F（5′-TGAGTTCGAGGCTGGTATCT-3′）和VdEF-α-R（5′-CACTTGGTGGTGTCCATCTT-3′），反應(yīng)體系及條件參考文獻(xiàn)[23]，數(shù)據(jù)分析方法采用 2-??CT[24]，目的基因相對表達(dá)量=2-ΔΔCT，ΔΔCT=（CT目的基因-CT管家基因）試驗(yàn)組-（CT目的基因-CT管家基因）對照組。

DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒方法：處理30 d后棉花和煙草剪取根部基材，金屬水浴鍋85℃預(yù)熱TE，全程使用去RNA酶離心管，離心機(jī)轉(zhuǎn)速12 000 r/min。每100 mg的根部組織放入研缽加液氮充分碾磨直至成粉末狀；離心管分別加入400 μL緩沖液 LP1 和 6 μL RNaseA（mg·mL-1），將粉末倒入離心管，漩渦振蕩1 min，室溫放置10 min；加入130 μL緩沖液 LP2，混勻后立即漩渦振蕩1 min，離心5 min，取上清液放入新的離心管；在新的離心管中加入750 μL等體積緩沖液LP3混勻，用移液槍分兩次吸出，加入吸附柱CB3離心30 s，去廢液；加入600 μL漂洗液PW漂洗，離心30 s，去廢液，再漂洗一次，空轉(zhuǎn)離心2 min；將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的2 mL收集管中，開蓋晾20 min；向吸附柱CB3中間垂直懸空滴加70 μL TE，室溫放置5 min，離心2 min，將溶液收集到離心管中，得到棉花及煙草根部組織 DNA。

1.10 KRS022激發(fā)植物抗性免疫

待棉花長至3周齡，分別灌根清水、KRS022菌液（OD600=1.0），2 d后分別接種大麗輪枝菌Vd991孢子懸浮液（1×107個/mL），每盆灌根30 mL，設(shè)置灌根清水、KRS022菌液、Vd991孢子懸浮液、KRS022+Vd991孢子懸浮液4個試驗(yàn)組，進(jìn)行3個重復(fù)，3 d后取棉花根部。煙草長至4周齡，同一葉片分別注射空白 LB液體和 KRS022無細(xì)胞上清液（KRS022菌液通過高速離心機(jī)，25℃、12 000 r/min離心10 min后取上清，無菌注射器吸取發(fā)酵上清液，插上0.22 μm微孔濾膜過濾裝置，過濾得到無細(xì)胞上清液），6 h后剪取注射部位的葉片。RNA 的提取使用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊），利用TransScript Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（全式金）進(jìn)行cDNA的合成。RT-qPCR在QuantStudioTM5 System上進(jìn)行，以棉花及煙草的管家基因GhUB7、NbEF-1α為內(nèi)參，測定防御相關(guān)基因的表達(dá)量，棉花及煙草防御基因引物[25-28]見表1。反應(yīng)體系：2×TransStart Top GreenqPCR superMix（全式金）10 μL，ddH2O 7.6 μL，正向和反向引物各 0.6 μL，cDNA 1.2 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取Ct值，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量[24]。

表1 棉花及煙草防御相關(guān)基因表達(dá)檢測引物Table 1 Specific primers for defense-related genes of cotton and tobacco

1.11 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，并完成單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 KRS022菌株形態(tài)鑒定

KRS022在LB平板上生長良好。菌落顏色為深黃色，單菌落近圓形，菌落邊緣整齊、表面光滑，稍微向上突起，質(zhì)地較為黏稠，呈油膜狀發(fā)亮；隨著培養(yǎng)時間的增長，菌落從中間到邊緣會有黃色到透明黃色漸變的油狀分泌物，逐漸向平板擴(kuò)散開；直至培養(yǎng)5 d后，平板未生長菌株的位置也會逐漸染成油狀淺黃色，與培養(yǎng)基融為一體不易挑出。革蘭氏染色結(jié)果顯示該菌株為紫紅色短桿狀，鑒定為革蘭氏陰性細(xì)菌（圖1）。

圖1 菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Colony morphology and gram staining results

2.2 KRS022生理生化特性及其功能測定

如表2所示，KRS022菌株甲基紅試驗(yàn)為陰性，能夠利用檸檬酸鹽產(chǎn)生吲哚，能夠使明膠液化；KRS022為好氧細(xì)菌，須在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵；能夠產(chǎn)生植物所需的氮、磷、鉀元素以及合成細(xì)胞色素和酶類所需的鐵載體，具有蛋白酶、淀粉酶、過氧化氫酶活性；葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明 KRS022為產(chǎn)堿型細(xì)菌；在血平板上形成光滑、濕潤、邊緣整齊的灰色菌落，無溶血性；經(jīng)天然抗生素測定KRS022菌株對氨芐青霉素具有天然抗性，能夠在25、50、100 μg·mL-1氨芐青霉素LB平板上生長，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]對比，并參考石中全等[29-31]對產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）生理生化特征的描述，發(fā)現(xiàn)菌株KRS022符合產(chǎn)堿假單胞菌生物學(xué)特征。

表2 KRS022生理生化特性測定Table 2 Physiological and biochemical characteristics of KRS022

2.3 KRS022分子序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以KRS022菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16S rDNA和gyrB擴(kuò)增分別得到1 467和1 125 bp的片段，測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，并上傳GenBank數(shù)據(jù)庫，16S rDNA和gyrB序列ID號分別為OQ167785、OQ184953。結(jié)果表明，其與產(chǎn)堿假單胞菌R1-96（序列ID：JQ659530.1）16S rDNA序列一致性為99.59%，gyrase subunit B基因（gyrB）測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中產(chǎn)堿假單胞菌MSSRFD254的gyrB序列（序列ID：KF111014.1）一致性高達(dá) 97%；分別將KRS022的16S rDNA核酸序列和gyrB核酸序列串聯(lián)，使用 MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對菌株的16S rDNA-gyrB基因串聯(lián)序列數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明KRS022與產(chǎn)堿假單胞菌聚為一支（圖2），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征初步鑒定為產(chǎn)堿假單胞菌。

圖2 采用比鄰法構(gòu)建序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree analysis derived by neighbor joining method

2.4 KRS022對病原真菌的抑制作用

KRS022與稻瘟病菌和大麗輪枝菌兩種真菌對峙培養(yǎng)10 d，與其余真菌培養(yǎng)5 d，結(jié)果表明，KRS022對膠孢炭疽菌、禾谷鐮孢、尖鐮孢、果生炭疽菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢和大麗輪枝菌均有不同程度的抑制作用（圖3-A），抑制率分別為（54.96±2.52）%、（56.61± 2.57）%、（66.57±1.67）%、（61.73±4.31）%、（56.08±1.82）%、（72.12±3.05）%和（75.19± 0.50）%（圖 3-B）。

圖3 平板對峙法測定KRS022對病原真菌生長的廣譜抑制作用Fig.3 The broad-spectrum inhibitory effect of KRS022 on pathogenic fungi growth determined by plate confrontation test

KRS022與稻瘟病菌和大麗輪枝菌兩種真菌對扣熏蒸培養(yǎng) 10 d，與其余真菌培養(yǎng) 4 d，結(jié)果表明，KRS022對禾谷鐮孢和尖鐮孢的抑制效果較差，抑制率僅為（27.21±2.34）%和（60.83±1.77）%；對其余測試真菌的抑制率均在80%以上，其中對大麗輪枝菌的抑制效果最佳，抑制率為（99.78±0.16）%，稻瘟病菌和灰葡萄孢次之，抑制率分別為（98.60±0.41）%和（97.14±1.13）%（圖 4）。以上結(jié)果表明，KRS022揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對各病原真菌的生長具有不同的抑制作用。

圖4 KRS022揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原真菌生長的廣譜抑制作用Fig.4 The broad-spectrum inhibitory effect of KRS022 volatile metabolites on pathogenic fungi growth

2.5 KRS022對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)及菌絲生長的影響

如圖5-A所示，通過將KRS022菌液混入PDA培養(yǎng)基、涂布KRS022和對扣熏蒸方法培養(yǎng)大麗輪枝菌，10 d后進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，3種處理方法的抑制率分別為（96.21±1.20）%、（99.72±0.07）%和（99.44±0.16）%（圖5-B），說明KRS022對大麗輪枝菌Vd991的生長具有良好的抑制效果；KRS022無細(xì)胞上清液處理48 h后，Vd991孢子未見萌發(fā)，而對照組空白LB處理可見大量的孢子萌發(fā)（圖 5-C）。此外，KRS022菌液對扣熏蒸孢子液培養(yǎng)10 d后觀察到孢子萌發(fā)形成的菌絲膨大、變粗（圖5-D）。

圖5 KRS022對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)及菌絲生長的影響Fig.5 Effects of KRS022 on conidia germination and hyphae development of V.dahliae

2.6 KRS022對棉花和煙草黃萎病的室內(nèi)防治效果

室內(nèi)防治效果顯示，僅接種Vd991的棉苗植株矮小，葉片黃化萎蔫甚至脫落，維管束褐化，嚴(yán)重時甚至整株死亡；與之相比，經(jīng) KRS022處理后再接種Vd991的棉苗生長茂盛，維管束組織無褐化現(xiàn)象，同水處理對照相比無顯著差異（圖 6-A）。煙草室內(nèi)防治效果顯示，Vd991處理的煙草生長矮小，葉片黃化萎蔫，維管束組織嚴(yán)重褐化；而經(jīng)KRS022菌液處理后，煙草植株依然保持健康，與水處理對照相比無顯著差異；此外，與水處理對照相比，KRS022菌液處理的煙草植株生長更為茂密，葉面積也更寬大（圖6-B），清水處理的煙草盆栽葉維度及單葉面積分別為（17.56±1.33）mm、（26.50±6.06）cm2，KRS022菌液處理的煙草盆栽葉維度及單葉面積分別為（29.09±2.93）mm、（65.30±12.00）cm2，與清水處理的煙草盆栽相比施用KRS022菌液煙草盆栽的葉維度及單葉面積增幅分別達(dá)65.7%和146.4%。以上結(jié)果表明，KRS022能夠有效防治作物黃萎病，并對植物具有一定的促生效果。

圖6 KRS022菌液對棉花和煙草植株黃萎病的防治效果Fig.6 The control efficacy of KRS022 on cotton and tobacco plants Verticillium wilt

2.7 定量PCR檢測大麗輪枝菌繁殖量

通過定量 PCR測定被侵染植物中病原菌的生物量，結(jié)果表明，單獨(dú)接種Vd991的煙草和棉花莖基部中的真菌生物量顯著高于 KRS022菌液處理后再接種Vd991的處理組，棉花和煙草對照組（單獨(dú)接種Vd991）中大麗輪枝菌的生物量分別是處理組（KRS022+Vd991）的1.75和2.57倍（圖7），說明KRS022能夠有效抑制大麗輪枝菌對作物的侵染和繁殖。

圖7 棉花和煙草莖基部中大麗輪枝菌的相對生物量檢測Fig.7 Detection of relative biomass of V.dahliae in cotton and tobacco stem basal tissue

2.8 KRS022激發(fā)植物免疫反應(yīng)

利用RT-qPCR對KRS022菌液灌根處理后的棉花根部及注射KRS022無細(xì)胞上清液的煙草葉片防御相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，相較于清水處理的棉花植株，經(jīng)KRS022處理的棉花植株中水楊酸通路標(biāo)記基因GhPR1、茉莉酸通路標(biāo)記基因GhAOC4和乙烯（ET）通路標(biāo)記基因GhEIN2均上調(diào)表達(dá)，上調(diào)倍數(shù)分別為7.23、1.69和15.05倍，其中GhPR1和GhEIN2顯著上調(diào)表達(dá)。相較于大麗輪枝菌孢子懸浮液單獨(dú)處理的棉花植株，經(jīng)KRS022菌液處理后再接種大麗輪枝菌，GhAOC4和GhEIN2被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，上調(diào)倍數(shù)分別為68.09和11.87倍（圖8-A）。同樣地，檢測了KRS022無細(xì)胞上清液處理?xiàng)l件下煙草植株中HR反應(yīng)標(biāo)記基因（NbHIN1、NbHSR203）、水楊酸信號通路標(biāo)記基因（NbPR1、NbPR2、NbPR5）以及ROS反應(yīng)標(biāo)記基因（NbRbohA、NbRbohB）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相較于空白LB液體處理的煙草植株，經(jīng)KRS022菌液處理后NbHSR203、NbHIN1、NbPR1、NbPR2、NbPR5、NbRbohA、NbRbohB上調(diào)表達(dá)倍數(shù)分別為1.98、2.79、2.52、1.25、1.70、3.28、3.44倍，均顯著上調(diào)。

圖8 KRS022誘導(dǎo)防御相關(guān)基因的表達(dá)Fig.8 KRS022 induces the expression of defense-related genes

3 討論

3.1 KRS022細(xì)菌的分類地位及功能特性

假單胞菌屬的不同種之間親緣關(guān)系極為相近，16S rDNA分辨率有限，因而很多菌株只能鑒定到屬水平，在種的分類上仍然需要借助其他手段加以輔助分析[32]，gyrB因其進(jìn)化速率快且不易發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，具有良好的分辨率，適用于區(qū)分親緣關(guān)系較近的菌株[33]。ZHOU等[34]為明確BR-01的分類地位，使用16S rDNA和gyrB分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，序列分析結(jié)果 BR-01的16S rDNA和gyrB序列與Bacillus velezensis聚集成一個分支，鑒定BR-01為貝萊斯芽孢桿菌。本研究通過形態(tài)觀察并結(jié)合16S rDNA與gyrB序列串聯(lián)分析，將一株拮抗細(xì)菌KRS022鑒定為產(chǎn)堿假單胞菌。

目前，對作物黃萎病病原大麗輪枝菌具有防治效果的拮抗微生物以芽孢桿菌居多，但對其具有拮抗活性的產(chǎn)堿假單胞菌相關(guān)研究和報道非常少。在篩選生防菌的過程中篩到一株產(chǎn)堿假單胞菌 KRS022，發(fā)現(xiàn)其易培養(yǎng)并且菌體在培養(yǎng)基上易擴(kuò)散甚至與其融合，具有一定特殊性，筆者認(rèn)為這一現(xiàn)象更易拮抗病原菌。為了豐富功能微生物資源，將篩選到的KRS022進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其對多種病原真菌具有良好的抑制作用，其中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌的抑制效果最為突出，在作物黃萎病的防治上具有較強(qiáng)的研究價值。嗜鐵素、吩嗪-1-羧酸、蛋白酶和2,4-二乙酰基間苯三酚等代謝產(chǎn)物是假單胞菌產(chǎn)生的較為常見的抗菌類物質(zhì)[35]，如熒光假單胞菌VSMKU3054產(chǎn)生的氰化氫、鐵載體、吲哚乙酸、水解酶和2,4-二乙?；g苯三酚對青枯菌具有抑制作用，有效抑制了番茄細(xì)菌性枯萎病的發(fā)生[36]；還有部分菌株具有解磷、解鉀、固氮、分泌IAA等特性，對植物生長具有促進(jìn)作用[37]，如銅綠假單胞菌CQ-40可以溶解磷、固定氮，并產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶、嗜鐵蛋白和其他抗菌代謝物促進(jìn)番茄生長并有效防治番茄灰霉病[38]。產(chǎn)堿假單胞菌KRS022可以產(chǎn)生嗜鐵素以及多種類型的酶（如蛋白酶、淀粉酶和過氧化氫酶），另外還具有解磷、解鉀、固氮的功能，具有促進(jìn)植物生長的潛力。

3.2 KRS022的拮抗作用及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)

拮抗微生物的預(yù)防作用一般大于治療作用，拮抗菌能在病原菌侵染作物之前抑制病原菌是其發(fā)揮抑菌功能的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，拮抗菌產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物（volatile organic compound，VOC）具有極強(qiáng)的抑菌活性，部分菌株的VOC對植物還具有促生效果[39]，如熒光假單胞菌 UM240產(chǎn)生的甲硫醇和二甲基硫醚等揮發(fā)性含硫化合物對灰葡萄孢具有極強(qiáng)的抑制作用[40]，而熒光假單胞菌ALEB7B產(chǎn)生揮發(fā)性含氮化合物對蒼術(shù)具有促生作用[41]；綠針假單胞菌（P.chlororaphis）XF10的揮發(fā)性物質(zhì)對煙草黑脛病菌菌絲發(fā)育具有抑制作用[42]；假單胞菌屬Bt851產(chǎn)生的VOC具有抗菌活性，顯著降低了甜菜軟腐病致病因子的毒力性狀，對軟腐病發(fā)生表現(xiàn)出更高的遞減效果[43]。本研究中產(chǎn)堿假單胞菌KRS022對大麗輪枝菌等7種病原真菌菌落生長具有明顯的抑制作用，產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)抑菌效果也極為顯著，其中揮發(fā)性物質(zhì)對大麗輪枝菌菌落生長的抑制率高達(dá) 99.78%，表明揮發(fā)性物質(zhì)是KRS022菌株發(fā)揮防治作用的主要抗菌活性物質(zhì)之一，這為探究KRS022抑菌機(jī)理提供了線索，后續(xù)將通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、頂空固相微萃取（HSSPME）等手段對揮發(fā)性化合物成分進(jìn)行鑒定，以期找到關(guān)鍵活性物質(zhì)，為生防制劑研發(fā)提供理論依據(jù)。

假單胞菌屬對作物黃萎病病原大麗輪枝菌具有良好的抑制作用。BERG等[44]從馬鈴薯、油菜、草莓根系及植株根際土壤中分離出抗黃萎病的生防菌，發(fā)現(xiàn)其中1/2的菌株為假單胞菌屬，超過1/3的菌株被鑒定為惡臭假單胞菌（P.putida）。本研究通過平板對峙和對扣熏蒸試驗(yàn)測定了產(chǎn)堿假單胞菌KRS022的抑菌活性，對大麗輪枝菌抑菌效果最為顯著。拮抗細(xì)菌通常能夠抑制病原真菌孢子萌發(fā)和菌絲發(fā)育，如趙君潔等[45]研究發(fā)現(xiàn)兩株拮抗芽孢桿菌與大麗輪枝菌孢子共孵育后，菌絲發(fā)生斷裂或發(fā)育受損，孢子畸形或不萌發(fā)。本研究也表明KRS022能夠顯著抑制孢子萌發(fā)使其不萌發(fā)芽管及菌絲，導(dǎo)致菌絲發(fā)育畸變，說明KRS022可能通過抑制孢子萌發(fā)及菌絲生長來發(fā)揮抑菌功能。

近年來，拮抗微生物在室內(nèi)盆栽及田間小區(qū)的病害防治應(yīng)用中已取得了良好的效果。DUAN等[46]研究發(fā)現(xiàn)拮抗細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）QSB-6處理能夠顯著改善馬蹄蓮的生長，QSB-6菌液能夠有效防止尖鐮孢對根系的損害；定量PCR檢測表明，QSB-6菌株處理后顯著降低了土壤中尖鐮孢的豐度。綠針假單胞菌YS05對盆栽番茄匍柄霉葉斑病的防治效果可達(dá)61.27%[47]；從水稻葉片中分離得到的內(nèi)生菌——嗜堿假單胞菌（P.alcaliphila）Ej2對水稻葉瘟和穗頸瘟的田間防治效果分別高達(dá) 83.67%和75.09%[48]。本研究發(fā)現(xiàn)棉花和煙草幼苗經(jīng)KRS022菌液灌根處理后能夠顯著抑制黃萎病的發(fā)生，且能夠顯著抑制莖基部維管束的褐化，大麗輪枝菌在莖基部的生物量也顯著降低；同時還發(fā)現(xiàn)僅經(jīng)過KRS022菌液處理的煙草植株長勢茂密且葉片寬大，株高和莖粗較水處理組也有一定程度的改善。后續(xù)將在細(xì)胞學(xué)水平、生理生化驗(yàn)證及基因表達(dá)水平對KRS022在植物促生方面的作用進(jìn)行更詳細(xì)的探究。

自然界中，植物在有害病原微生物的脅迫下會進(jìn)化出不同的防御機(jī)制。拮抗微生物除了能夠產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)外，還能夠通過誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)性防御反應(yīng)來減少或抑制病原的侵染和繁殖，如ROS響應(yīng)、胼胝質(zhì)沉積、HR相關(guān)基因表達(dá)、防御相關(guān)酶活性水平上升、水楊酸和茉莉酸信號通路激活、氣孔關(guān)閉等[49]。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)堿假單胞菌KRS022菌液灌根到棉花根部，棉花水楊酸通路標(biāo)記基因GhPR1、茉莉酸通路標(biāo)記基因GhAOC4和乙烯通路標(biāo)記基因GhEIN2防御相關(guān)基因均被誘導(dǎo)表達(dá)；KRS022菌液無細(xì)胞上清注射到煙草葉片后，煙草HR反應(yīng)標(biāo)記基因（NbHlN1、NbHSR203）、水楊酸信號通路標(biāo)記基因（NbPR1、NbPR2、NbPR5）以及ROS反應(yīng)標(biāo)記基因（NbRbohA、NbRbohB）均被誘導(dǎo)表達(dá)，說明KRS022可能是通過多種作用機(jī)制協(xié)同作用來發(fā)揮抑菌和促生功能，未來可對深層次的激發(fā)植物抗性機(jī)理及信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)一步挖掘。

4 結(jié)論

拮抗細(xì)菌KRS022鑒定為產(chǎn)堿假單胞菌，具有解磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體的能力；對多種病原真菌具有較好的抑制效果，其中對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)和菌絲生長具有良好的抑制作用；室內(nèi)防治試驗(yàn)表明KRS022能夠有效抑制棉花和煙草黃萎病的發(fā)生，對植物具有一定的促生作用。此外，KRS022能夠顯著誘導(dǎo)棉花和煙草中防御相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，以激發(fā)植物抗性抵御大麗輪枝菌的侵染。因此，產(chǎn)堿假單胞菌KRS022通過直接抑制病原菌生長和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，抵御病原菌在植株體內(nèi)侵染和擴(kuò)展，從而達(dá)到防治黃萎病的目的，可作為潛在的生物防治菌劑和植物促生劑進(jìn)行開發(fā)和利用。