張開京，何帥帥，賈利，胡玉超，楊德坤，陸曉民，張其安，嚴從生?

1安徽科技學院農學院，安徽鳳陽 233100；2安徽省農業(yè)科學院園藝研究所/農業(yè)農村部園藝作物種質創(chuàng)制與利用重點實驗室（部省共建）/園藝作物種質創(chuàng)制及生理生態(tài)安徽省重點實驗室，合肥 230031

0 引言

【研究意義】Dirigent（DIR）基因家族廣泛存在于維管植物中，是參與木脂素及木質素生物合成的一類關鍵基因，在植物防御反應、次生代謝和抗病性等方面具有重要的作用[1-2]。黃瓜（Cucumis sativusL.）作為第一個完成基因組測序工作的蔬菜作物[3]，在國民經濟發(fā)展中占據(jù)著重要地位。通過在黃瓜全基因組范圍內進行DIR基因家族的鑒定，并分析其在不同組織器官和脅迫響應過程中的表達模式，以初步探明DIR基因家族在黃瓜應答生物和非生物脅迫過程中所發(fā)揮的相關作用，為后續(xù)深入研究DIR基因在黃瓜中的功能奠定重要基礎，并為黃瓜抗性分子育種提供參考?！厩叭搜芯窟M展】DIR基因家族蛋白結構均含有一個典型的 dirigent結構域，但少數(shù)成員含有兩個串聯(lián)的dirigent結構域[4]。植物DIR家族通常分為DIR-a、DIR-b/d、DIR-c、DIR-e、DIR-f和 DIR-g等 6個亞族[5]，研究表明，DIR-a亞族的一些成員直接參與了木脂素和木質素的合成，參與細胞壁修飾，而關于其他DIR亞族的基因功能研究較少[6-7]。DIR蛋白最先在連翹中發(fā)現(xiàn)[8]，目前，已在許多重要植物中進行了DIR蛋白家族的鑒定研究，如擬南芥[9]、水稻[10-11]、云杉[5]、白梨[12]、楊樹[13]、白菜[14]、辣椒[15]、草莓[16]、陸地棉[17]等，并發(fā)現(xiàn)DIR基因家族在響應非生物脅迫和生物脅迫中發(fā)揮重要作用，如高溫[11,18]、冷害[11,14]、干旱[11,14,18-21]、鹽害[11,19,21]、重金屬[11]、H2O2[18-19]和病蟲害[1,14,21-26]等，還受乙烯、JA、SA、ABA等信號分子的調控[14,18,21]?！颈狙芯壳腥朦c】利用黃瓜的高質量基因組信息，已經在黃瓜全基因組范圍內開展了大量的基因家族鑒定工作，如WRKY[27]、MADS-box[28]、NBS[29]、bZIP[30]等基因家族的鑒定。雖然有個別研究報道了黃瓜DIR家族基因的鑒定[21,31]，但其是基于黃瓜ChineseLong_V2版本基因組信息[3]進行的分析，這就導致了黃瓜DIR家族基因的全基因組鑒定不完全，并且之前的研究沒有進行黃瓜DIR家族基因在響應生物脅迫和非生物脅迫過程中的表達模式分析，這極大地限制了DIR基因在黃瓜中的生物學功能研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究將利用生物信息學手段，在黃瓜 ChineseLong_V3版本基因組[32]中進行全基因組范圍內的DIR家族基因鑒定和分析；再基于黃瓜轉錄組測序大數(shù)據(jù)，利用黃瓜 ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進行轉錄組分析，完成黃瓜DIR基因家族的組織特異性表達分析以及在脅迫響應過程中的表達模式分析，初步探明DIR家族基因在黃瓜生長發(fā)育過程中的生物學功能，為后續(xù)黃瓜DIR基因功能的深入研究奠定重要基礎，并為黃瓜抗性分子育種提供有利基因。

1 材料與方法

試驗于2021年在安徽科技學院進行。

1.1 黃瓜DIR家族基因鑒定與染色體定位

從Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）[33]中下載DIR基因家族的HMM模型文件（PF03018），從葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.icugi.org/）中下載黃瓜ChineseLong_V3蛋白組序列文件（http://cucurbitgenomics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese_lon g/v3/），并構建本地蛋白數(shù)據(jù)庫，利用HMMER軟件包[34]的hmmsearch程序從黃瓜蛋白數(shù)據(jù)庫中篩選出可能的DIR基因ID（E<1×10-5），利用Perl腳本提取候選蛋白的序列信息，并利用在線工具Pfam、SMART（http://smart.embl.de/smart/batch.pl）[35]對可能的DIR基因序列進行結構域驗證，選擇含有Dirigent結構域的序列，最終確定黃瓜中的DIR基因家族成員。根據(jù)擬南芥DIR基因家族鑒定研究結果[9]，從擬南芥基因組網站（https://www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥DIR基因家族成員信息。利用在線工具 ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析黃瓜DIR基因家族成員的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點、不穩(wěn)定性系數(shù)、脂肪系數(shù)、親水性平均值等理化特征。利用在線網站 CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）[36]對黃瓜中DIR基因進行亞細胞定位預測。利用TBtools軟件[37]繪制黃瓜DIR基因家族在染色體上的分布圖。

1.2 黃瓜DIR家族基因特征分析與系統(tǒng)進化分析

利用在線工具GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[38]分析黃瓜 DIR基因家族成員的結構。利用在線軟件MEME（http://meme-suite.org/）[39]分析黃瓜 DIR 家族蛋白的保守基序（motif），參數(shù)設置為：保守基序個數(shù)為10，保守基序最佳匹配長度為6—100。利用MEGA 11[40]軟件對擬南芥和黃瓜的 DIR家族基因進行系統(tǒng)進化樹構建，采用鄰接法，參數(shù)設置為：Poisson model, pairwise deletion, 1 000 bootstrap replications。利用在線網站 PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[41]分析黃瓜DIR基因家族成員啟動子cis元件。

1.3 黃瓜DIR家族成員基因復制類型及共線性分析

利用MCScanX[42]軟件分析黃瓜DIR基因家族中的串聯(lián)重復基因和片段重復基因。為了解黃瓜DIR基因家族與擬南芥、水稻DIR基因家族的種間共線性關系，用MCScanX軟件對黃瓜、擬南芥、水稻DIR家族基因進行共線性分析，使用 Circos軟件[43]可視化DIR基因家族在種間的共線性關系。

1.4 黃瓜轉錄組測序數(shù)據(jù)重新進行RNA-seq分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索到黃瓜相關的轉錄組測序數(shù)據(jù)，進行下載，然后利用TBtools中的SRA to Fastq插件，將下載的sra數(shù)據(jù)轉換成fastq數(shù)據(jù)，利用FastQC插件查看數(shù)據(jù)質量，利用Trimmomatics插件去除接頭和低質量序列，清理完原始數(shù)據(jù)后獲得clean data，再利用Hisat2-Build Index插件對黃瓜ChineseLong_V3版本基因組建立索引，利用 Hisat2-Align插件將過濾后的轉錄組數(shù)據(jù)比對到黃瓜 ChineseLong_V3版本基因組上，生成 bam文件，接著利用StringTie Quantify插件進行基因表達量分析，最后，基于每個基因的counts數(shù)據(jù)，利用DESeq2插件完成差異表達基因的分析。

1.5 黃瓜DIR家族基因組織特異性表達分析

在 NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索黃瓜不同組織間的轉錄組測序項目PRJNA80169[44]，利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進行轉錄組分析，再利用 TBtools軟件繪制黃瓜DIR家族基因在黃瓜不同組織器官中的表達熱圖。

1.6 黃瓜 DIR家族基因在非生物脅迫和生物脅迫下的表達模式分析

在 NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索黃瓜在高溫脅迫（PRJNA634519）[45]、低溫脅迫（PRJNA438923）、鹽和硅脅迫（PRJNA477930）[46]、霜霉病（PRJNA285071）[47]、白粉?。≒RJNA321023）[48]、根結線蟲脅迫（PRJNA419665）[49]處理下的轉錄組測序數(shù)據(jù)，基于黃瓜 ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進行轉錄組分析，利用TBtools軟件繪制黃瓜DIR家族基因在非生物脅迫和生物脅迫響應過程中的表達熱圖，并根據(jù)不同處理中的差異表達基因結果篩選出每個處理中發(fā)生差異表達的黃瓜DIR基因。

2 結果

2.1 黃瓜DIR基因家族成員的基本信息

基于已公布的黃瓜 ChineseLong_V3基因組信息，利用生物信息學方法，在黃瓜全基因組范圍內鑒定到23個DIR基因家族成員，基因CDS大小介于237—2 055 bp，編碼氨基酸數(shù)量在78—684，分子量大小為 8.70—73.82 kD，脂肪系數(shù)在 64.37—100.63。23個DIR蛋白的等電點理論值在4.31—10.08。除CsaV3_1G003540.1、CsaV3_1G010290.1、CsaV3_2G015830.1、CsaV3_5G006670.1、CsaV3_7G005610.1、CsaV3_7G005630.1和CsaV3_7G022920.1屬于不穩(wěn)定蛋白外（不穩(wěn)定性指數(shù)大于40），其余DIR基因的不穩(wěn)定性指數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白。在23個DIR基因家族中，14個DIR基因的平均親水性小于零，表明它們是親水性蛋白；9個DIR基因的平均親水性大于零，表明它們是疏水蛋白。通過亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)黃瓜DIR基因主要定位于質膜、細胞外間隙、線粒體和葉綠體中（表1）。

表1 黃瓜23個DIR基因家族成員的理化特征Table 1 The physiochemical characteristics of 23 members in the cucumber DIR gene family

2.2 黃瓜DIR家族基因的染色體定位

根據(jù)黃瓜23個DIR家族基因的染色體定位分析，繪制DIR家族基因在黃瓜染色體上的分布圖（圖1）。黃瓜DIR家族基因在黃瓜的每條染色體上均有分布，其中4號染色體上的DIR基因最多，有7個DIR基因，其中CsaV3_4G006240/CsaV3_4G006250、CsaV3_4G023480/CsaV3_4G023490/CsaV3_4G023500/CsaV3_4G023510為串聯(lián)重復基因；6號染色體的DIR基因最少，僅有1個DIR基因；3號染色體上有2個DIR基因；7號染色體上有 4個 DIR基因，其中CsaV3_7G003510和2號染色體上的CsaV3_2G034820為片段重復基因；其余染色體上分別各有3個DIR基因，2號染色體上的CsaV3_2G015820/CsaV3_2G015830、5號染色體上的CsaV3_5G006660/CsaV3_5G006670為串聯(lián)重復基因（圖1）。

圖1 黃瓜DIR家族基因在染色體上的分布Fig.1 The distribution of DIR gene family on cucumber chromosomes

2.3 黃瓜和擬南芥DIR家族基因聚類分析

為充分明確黃瓜DIR家族各基因間親緣關系與生物學功能，對鑒定到的黃瓜DIR家族基因和模式植物擬南芥的DIR家族基因成員進行多序列比對分析，構建系統(tǒng)進化樹（圖2）。依據(jù)擬南芥DIR家族基因的分類結果，發(fā)現(xiàn)進化樹共分為3個亞族：a、b/d、e，其中b/d亞族中的DIR基因最多，共有29個；而a亞族中的DIR基因最少，只有10個；e家族中含有11個黃瓜 DIR基因。分析發(fā)現(xiàn)黃瓜與擬南芥的 DIR家族基因間存在 3對直系同源基因，即CsaV3_7G022920/AT5G42655、CsaV3_2G015820/AT2G21110和CsaV3_2G015830/AT2G21100，黃瓜DIR基因家族中存在5對旁系同源基因，分別是CsaV3_1G003540/CsaV3_4G023510、CsaV3_2G034820/CsaV3_7G003510、CsaV3_4G006240/CsaV3_4G006250、CsaV3_4G023480/CsaV3_4G023490、CsaV3_7G005610/CsaV3_3G005630，在進化關系上比較相近的一類DIR基因在結構和功能上均比較相似，可以根據(jù)模式植物擬南芥中相似基因的研究結果推測黃瓜中DIR基因的生物學功能。

圖2 黃瓜、擬南芥DIR家族基因聚類分析Fig.2 Phylogenetic analysis of DIR genes from cucumber and Arabidopsis

2.4 黃瓜DIR家族基因結構與保守序列

利用TBtools軟件繪制黃瓜DIR家族基因聚類分析圖和結構示意圖，發(fā)現(xiàn)黃瓜DIR基因家族可以分為3個亞族，即a、b/d、e亞族（圖3），與黃瓜、擬南芥 DIR基因聚類結果一致（圖 2），其中 b/d亞族中的黃瓜DIR基因最多，有14個；而a亞族中的DIR基因最少，只有4個；e家族中含有5個黃瓜DIR基因。根據(jù)黃瓜DIR家族基因的結構示意圖，發(fā)現(xiàn)a亞族中的黃瓜DIR基因平均外顯子和內含子個數(shù)最多，分別是3.75和2.75個，而e亞族中的黃瓜DIR基因平均外顯子和內含子個數(shù)最少，分別是1.4和0.4個，b/d亞族中的黃瓜DIR基因平均具有 2.1個外顯子和 1.1個內含子。利用在線軟件MEME對黃瓜中DIR蛋白進行保守motif分析，共獲得10條motif（表2）。通過黃瓜DIR家族基因的結構示意圖，發(fā)現(xiàn)不同亞族中的DIR蛋白保守序列不同，而相同亞族中的DIR蛋白具有相同的保守序列，例如在b/d亞族中，大多數(shù)基因都含有motif 3、1、4、2，且具有相同的排列順序，而在 e亞族中大多數(shù)基因都含有motif 3、1、2、10，且具有相同的排列順序，這說明不同亞族中基序分布的不同導致其可能在進化過程中出現(xiàn)了功能多樣性演變。同時，在相同亞族中DIR基因相似的保守基序表明其含有相似的功能。

表2 黃瓜DIR蛋白的基序信息Table 2 The motifs information of cucumber DIR proteins

圖3 黃瓜DIR家族基因結構與保守序列示意圖Fig.3 Exon-intron structures of DIR genes and a schematic diagram of the amino acid motifs of DIR proteins in cucumber

2.5 黃瓜、擬南芥和水稻DIR家族基因共線性分析

對黃瓜與擬南芥、黃瓜與水稻中的DIR家族基因進行共線性分析，發(fā)現(xiàn)黃瓜中有 12個 DIR基因（CsaV3_1G003540、CsaV3_1G010290、CsaV3_2G015820、CsaV3_2G015830、CsaV3_3G011390、CsaV3_4G006220、CsaV3_4G023510、CsaV3_5G006670、CsaV3_5G026130、CsaV3_6G006930、CsaV3_7G005610、CsaV3_7G022920）與擬南芥中的19個DIR基因（AT1G22900、AT1G55210、AT1G56180、AT1G58170、AT1G64160、AT1G65870、AT2G21100、AT2G21110、AT2G28670、AT2G39430、AT3G13650、AT3G13662、AT3G24020、AT3G55230、AT3G58090、AT4G13580、AT4G23690、AT5G42500、AT5G49040）存在27種線性關系；黃瓜中有12個DIR 基因（CsaV3_1G003340、CsaV3_1G003540、CsaV3_2G015830、CsaV3_3G011390、CsaV3_4G006220、CsaV3_4G023500、CsaV3_4G023510、CsaV3_5G006670、CsaV3_5G026130、CsaV3_7G005610、CsaV3_7G005630、CsaV3_7G022920）與水稻中的 11個 DIR基因（Os01g06250、Os02g07250、Os03g05030、Os03g17220、Os07g44450、Os07g44930、Os11g07680、Os11g07830、Os11g27620、Os11g42550、Os12g07580）存在19種線性關系。另外還有8個DIR基因（CsaV3_ 2G034820、CsaV3_3G015180、CsaV3_4G006240、CsaV3_4G006250、CsaV3_4G023480、CsaV3_4G023490、CsaV3_5G006660、CsaV3_7G003510）在黃瓜中較保守，既不與擬南芥中的DIR基因存在共線性，也不與水稻中的DIR基因存在共線性。對黃瓜中的DIR家族基因進行共線性分析，發(fā)現(xiàn)僅有1對黃瓜DIR家族基因（CsaV3_2G034820/CsaV3_7G003510）存在線性關系（圖4）。

圖4 黃瓜、擬南芥、水稻中DIR家族基因的共線性關系Fig.4 Syntenic relationships of DIR gene family in cucumber, Arabidopsis and rice

2.6 黃瓜DIR家族基因啟動子序列cis元件

在23個黃瓜DIR家族基因啟動子序列中，共鑒定到14種不同的cis元件（圖5）。其中，與光響應（lightresponsiveness）相關的cis元件是最多的一類cis元件，包括ACE、Box 4、G-box、I-box等，占總cis元件數(shù)目的51%。另外，還鑒定到一些其他cis元件，包括與激素（生長素、赤霉素、水楊酸、脫落酸、MeJA）響應，逆境（干旱、低溫）響應，光周期調控，胚乳表達和分生組織表達等相關的cis元件。不同的DIR基因啟動子區(qū)域存在不同的cis元件成員，表明黃瓜DIR基因在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮了多種功能。

圖5 黃瓜DIR家族基因啟動子序列cis元件分析Fig.5 Cis-elements analysis of the promoters of cucumber DIR family genes

2.7 黃瓜DIR家族基因的組織特異性表達

基于已公布的黃瓜不同組織間的轉錄組測序數(shù)據(jù)（PRJNA80169）[44]，利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進行轉錄組分析，繪制黃瓜DIR家族基因在不同組織間的表達熱圖（圖 6），發(fā)現(xiàn)CsaV3_3G011390、CsaV3_3G015180、CsaV3_1G003540、CsaV3_4G023480、CsaV3_5G006660和CsaV3_1G010290在所有組織中均不表達；CsaV3_2G034820、CsaV3_5G006670、CsaV3_7G003510、CsaV3_4G006220、CsaV3_4G023510、CsaV3_4G006250和CsaV3_4G006240在黃瓜的根中特異性表達，但在其他組織中低表達或者不表達；CsaV3_7G005610、CsaV3_7G005630、CsaV3_7G022920、CsaV3_4G023490、CsaV3_2G015820、CsaV3_5G026130和CsaV3_1G003340在黃瓜的所有組織中均有表達，但表達量較低；CsaV3_4G023500在所有組織中都有表達，且表達量較高，在根、莖、子房和受精子房中表達量最高；CsaV3_6G006930在卷須中高表達，在根中不表達，在其余組織中有表達；CsaV3_6G006930在莖、葉片和卷須中特異性表達，在其余組織中有表達，但表達量較低。

圖6 黃瓜DIR家族基因在不同組織器官中的表達熱圖Fig.6 The expression heatmap of DIR gene family in different tissues of cucumber

2.8 黃瓜DIR家族基因在非生物脅迫處理下的表達模式

基于已公布的黃瓜在高溫（PRJNA634519）[45]、低溫（PRJNA438923）、鹽和硅脅迫（PRJNA477930）[46]處理下的轉錄組測序數(shù)據(jù)，利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，進行轉錄組分析，繪制黃瓜DIR家族基因在不同非生物脅迫響應下的表達熱圖（圖7）。研究發(fā)現(xiàn)在高溫脅迫處理下，與對照材料相比，僅有CsaV3_4G023490這一個DIR基因發(fā)生顯著的上調表達，而CsaV3_6G006930、CsaV3_2G015830、CsaV3_4G023500、CsaV3_1G0003340發(fā)生顯著的下調表達。在低溫脅迫處理下，與對照材料相比，發(fā)現(xiàn)CsaV3_2G015830和CsaV3_1G003540分別發(fā)生顯著的下調表達和上調表達，但由于FPKM值小于5，不認為是可靠的差異表達基因，因此，在低溫脅迫處理下，僅發(fā)現(xiàn)CsaV3_6G006930發(fā)生顯著的下調表達，CsaV3_4G023490發(fā)生上調表達。在鹽脅迫處理下，與對照材料相比，發(fā)現(xiàn)所有黃瓜DIR基因對鹽脅迫處理沒有顯著的響應調控，但在硅脅迫下，與對照材料相比，CsaV3_4G023490和CsaV3_4G023510發(fā)生顯著地上調表達。

圖7 黃瓜DIR家族基因在非生物脅迫處理下的表達熱圖Fig.7 The expression heatmaps of cucumber DIR gene family under abiotic stress treatments

2.9 黃瓜 DIR家族基因在生物脅迫處理下的表達模式

基于已公布的黃瓜在霜霉病（PRJNA285071）[47]、白粉?。≒RJNA321023）[48]、根結線蟲脅迫（PRJNA419665）[49]處理下的轉錄組測序數(shù)據(jù)，利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進行轉錄組分析，繪制黃瓜DIR家族基因在生物脅迫響應下的表達熱圖（圖8）。研究發(fā)現(xiàn)，在霜霉病脅迫處理下，與對照材料相比，CsaV3_4G023490、CsaV3_2G015820、CsaV3_4G023500、CsaV3_1G003340在抗、感材料中全都發(fā)生顯著的上調表達，CsaV3_4G006250、CsaV3_4G006240、CsaV3_4G023510僅在感病材料中發(fā)生明顯的上調表達，而CsaV3_7G005610和CsaV3_2G034820的FPKM值小于5，因此不認為是差異表達基因。在白粉病脅迫處理下，與對照材料相比，僅發(fā)現(xiàn)CsaV3_4G023490在抗、感材料中均發(fā)生顯著地上調表達，而CsaV3_4G023510、CsaV3_2G015830和CsaV3_2G015820的FPKM值小于5，因此不認為是差異表達基因。在根結線蟲脅迫處理下，與對照材料相比，CsaV3_6G006930和CsaV3_2G034820在抗、感材料中均發(fā)生顯著上調表達，CsaV3_4G023510和CsaV3_5G006660在抗、感材料中均發(fā)生顯著地下調表達；CsaV3_4G023490和CsaV3_4G006240只在感病材料中發(fā)生顯著上調表達，在抗病材料中也發(fā)生上調表達，但不顯著，其中CsaV3_4G023490的表達水平隨著接種時間的增加而逐漸上調表達，而CsaV3_4G006240的表達水平隨著接種時間的增加先增高后下降；CsaV3_4G006250表達水平在感病材料接種1 d后顯著上調表達，隨后開始緩慢下降，而在抗病材料中是持續(xù)地下調表達；CsaV3_7G003510在感病材料中的表達水平隨著接種時間增加而逐漸下降，但在抗病材料中的表達水平是先增加后下降；CsaV3_5G006670、CsaV3_5G026130和CsaV3_1G010290在感病材料中發(fā)生顯著下調表達，在抗病材料中也發(fā)生下調表達，但不顯著；CsaV3_4G006220在抗病材料中發(fā)生顯著的下調表達，在感病材料中也發(fā)生下調表達，但不顯著；CsaV3_1G003340的FPKM值小于5，因此不認為是差異表達基因。

圖8 黃瓜DIR家族基因在生物脅迫處理下的表達熱圖Fig.8 The expression heatmaps of cucumber DIR gene family under biotic stress treatments

2.10 黃瓜DIR家族基因在非生物脅迫和生物脅迫響應下的調控模式分析

通過上述黃瓜DIR家族基因在非生物和生物脅迫下的表達模式分析，將有差異表達的黃瓜DIR基因進行標注，繪制熱圖（圖 9）。發(fā)現(xiàn)CsaV3_4G023490在非生物和生物脅迫下均呈現(xiàn)明顯上調表達，表明該基因積極參與脅迫響應，可以作為后續(xù)研究的重點候選基因；還有一些黃瓜DIR基因，例如CsaV3_4G023500、CsaV3_6G006930、CsaV3_1G003340、CsaV3_4G023510，同時在個別非生物和生物脅迫處理中有差異表達，但表達模式不一樣；還有一些黃瓜DIR基因只在非生物脅迫中參與響應表達，例如CsaV3_2G015830只在高溫脅迫中下調表達；還有一些黃瓜DIR基因，例如CsaV3_4G006250、CsaV3_7G003510、CsaV3_2G034820、CsaV3_4G006240、CsaV3_5G006670、CsaV3_5G026130、CsaV3_1G010290、CsaV3_2G015820、CsaV3_4G006220、CsaV3_5G006660，只在生物脅迫中參與響應表達。

圖9 黃瓜DIR家族基因在非生物和生物脅迫下的表達模式熱圖Fig.9 The expression patterns heatmap of cucumber DIR gene family under the abiotic and biotic stresses

3 討論

3.1 黃瓜 DIR基因家族的鑒定與表達分析為后續(xù)深入研究提供借鑒

近年來，隨著基因組測序技術的不斷發(fā)展和廣泛應用，越來越多的植物基因組序列信息已經公布[50]，許多重要的基因家族鑒定工作也已經陸續(xù)開展。DIR蛋白幾乎存在于所有維管植物中，往往以基因家族的形式出現(xiàn)，DIR基因家族已經在模式植物擬南芥[9]、水稻[10-11]中相繼鑒定，隨后在一些重要蔬菜作物如白菜[14]、辣椒[15]中也有報道。黃瓜作為在世界范圍內廣泛栽培的重要蔬菜作物，其栽培面積僅次于番茄和洋蔥[51]，早在2009年就完成了黃瓜基因組測序工作，獲得黃瓜ChineseLong_V2版本基因組信息[3]，雖然已有根據(jù)黃瓜 ChineseLong_V2版本基因組信息進行DIR家族基因鑒定的報道[21,31]，但鑒定的 DIR家族基因數(shù)目少于本研究中利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息[32]鑒定到的DIR家族基因數(shù)目，表明之前研究中的黃瓜DIR家族基因全基因組鑒定不完全，并且之前的研究沒有進行黃瓜DIR家族基因在響應生物脅迫和非生物脅迫過程中的表達模式分析，這極大地限制了DIR基因在黃瓜中的生物學功能研究。因此，本研究利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，對黃瓜中DIR家族基因成員進行鑒定，并基于黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息和轉錄組測序大數(shù)據(jù)，重新進行轉錄組分析，探究黃瓜DIR家族基因在不同組織器官和不同脅迫響應過程中的表達模式，可為黃瓜 DIR基因的功能深入研究提供參考，并為黃瓜抗性分子育種提供理論依據(jù)。

3.2 DIR基因家族在不同物種間具有保守性

不同植物中DIR家族基因的數(shù)目變化很大，本研究共鑒定到23個黃瓜DIR家族基因成員，而擬南芥[9]、水稻[10-11]、云杉[5]、白梨[12]、楊樹[13]、白菜[14]、辣椒[15]、草莓[16]、陸地棉[17]中鑒定的DIR基因數(shù)目分別是25個、61個、35個、35個、40個、29個、24個、33個和12個。系統(tǒng)進化樹分析將黃瓜中的23個DIR基因分為3個亞族，即a、b/d、e，這與擬南芥[9]、楊樹[13]、辣椒[15]和陸地棉[17]中DIR家族基因的系統(tǒng)進化分析結果類似，也與之前利用黃瓜 ChineseLong_V2版本基因組信息進行DIR家族基因分析的聚類結果一致[21]，3個亞族成員間的基因結構存在明顯差異，每個亞族中的基因結構和 motif基本一致。通過對黃瓜中的DIR家族基因進行重復基因分析，發(fā)現(xiàn)黃瓜DIR基因家族有5對串聯(lián)重復基因對，僅有1對片段重復基因對，可見黃瓜中DIR基因的擴張主要來自于串聯(lián)重復。通過對擬南芥、水稻和黃瓜中DIR家族基因的共線性分析，發(fā)現(xiàn)黃瓜中有8個DIR基因比較保守，其與擬南芥和水稻中的DIR基因都不存在共線性，而另外15個黃瓜DIR基因與擬南芥和水稻中的DIR基因存在多種共線性關系，表明各物種以特異的方式進行了基因擴張，這種現(xiàn)象也普遍出現(xiàn)在其他植物基因家族研究中[52-53]。

3.3 CsaV3_4G023490積極參與黃瓜對生物和非生物脅迫響應的調控

由于近年來高通量測序技術的發(fā)展，轉錄組測序成本逐漸下降[54]，有很多研究者進行了大量的黃瓜轉錄組測序，形成了黃瓜轉錄組測序大數(shù)據(jù)。因此，利用好這些轉錄組測序大數(shù)據(jù)，不僅能降低研究成本，還能深入挖掘這些數(shù)據(jù)，并且可以結合不同處理的黃瓜數(shù)據(jù)來研究黃瓜不同基因家族的分子生物學功能。本研究發(fā)現(xiàn)23個黃瓜DIR家族基因中有些基因在所有組織中低表達甚至不表達，有些基因在所有組織中均有表達，有些基因只在部分組織中特異表達，正是由于這些DIR家族基因在不同組織中的特異表達，協(xié)同調控了黃瓜的生長發(fā)育。通過分析脅迫響應過程中黃瓜 DIR家族基因表達模式，發(fā)現(xiàn)黃瓜CsaV3_4G023490在生物和非生物脅迫中均發(fā)生上調表達，表明該基因積極響應黃瓜脅迫過程中的抗性調控，這與前人報道的CsDIR16（黃瓜ChineseLong_V2版本基因組信息中命名為Csa4G280630）功能一致，在響應霜霉威（殺菌劑 Propamocarb）、JA、ABA、PEG、NaCl、黃瓜褐斑病脅迫過程中均呈現(xiàn)上調表達[21]，可見該基因在抵御生物和非生物脅迫過程中積極響應，可進行后續(xù)深入研究。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)黃瓜DIR家族基因在生物脅迫和非生物脅迫中的表達模式也不一樣，在非生物脅迫響應過程中，發(fā)生差異表達的DIR家族基因數(shù)目較少，除了CsaV3_4G023490上調表達，其余大部分基因下調表達；而在生物脅迫響應過程中，發(fā)生差異表達的 DIR家族基因數(shù)目較多，且大多數(shù)差異表達的 DIR基因上調表達，這表明相對于非生物脅迫，在病原菌侵染黃瓜后，較多的DIR家族基因會協(xié)同上調表達，以積累更多的木質素，從而抵御病原菌的侵染。這證實了植株在病原菌侵染過程中，侵染部位或侵染點周圍的植物細胞會積累木質素，從而達到抵抗病菌侵染和擴展的目的[55]。很多研究已經證明 DIR基因在植株與病原菌互作過程中的重要性[56-59]。此外，還有一些黃瓜DIR基因在個別的非生物脅迫中也發(fā)揮著重要的作用，特別是在低溫、干旱、激素信號等脅迫下，這與啟動子中的cis元件類型相符，其他作物中的DIR家族基因也具有非生物脅迫響應調控功能[11,14,18-21]，但黃瓜中大多數(shù)非生物脅迫響應調控基因為下調表達，這也有待進一步探討。

4 結論

在黃瓜全基因組范圍內共鑒定到23個DIR家族基因，分為3個亞族。黃瓜DIR家族基因在不同組織器官和脅迫響應下的表達模式具有差異性，協(xié)同調控了黃瓜的生長發(fā)育，其中CsaV3_4G023490在非生物和生物脅迫下均呈現(xiàn)出明顯的上調表達，表明該基因積極參與逆境脅迫響應調控。