劉耀東， 肖書(shū)雅， 王安虎， 劉 宇， 方 陽(yáng)， 李小意， 劉志斌， 李旭峰， 王健美， 楊 毅

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065； 2.西昌學(xué)院， 西昌 615000)

1 引 言

蛋白磷酸酶2C(protein phosphatases 2C, PP2C)依賴于Mg2+/Mn2+離子，是蛋白磷酸酶中極其重要的一支[1]. 從原核生物到真核生物，PP2C參與各種有意義的生命調(diào)控活動(dòng)，在植物中，PP2C是蛋白磷酸酶最大的一個(gè)分支[2]. 植物PP2C被認(rèn)為是蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子，也在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中扮演重要角色[3]. 此外，植物PP2C還能調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，包括種子萌發(fā)和根系發(fā)育[4-5]. 植物PP2C基因家族之前有很多研究，例如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和大豆(Glycinemax)[6-8]. 但是苦蕎PP2C基因家族的研究未見(jiàn)報(bào)道.

苦蕎(Fagopyrumtataricum)是一種藥食兼用的糧食，與甜蕎(Fagopyrumesculentum)相比，它更富含維生素B和蘆丁，這些成分有助于降低高血壓和緩解動(dòng)脈硬化[9]，并且苦蕎對(duì)惡劣環(huán)境有很強(qiáng)的耐受力，而PP2C的A亞族是ABA信號(hào)通路中的核心成員，參與植物逆境脅迫應(yīng)答[10-12]. 苦蕎的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，加快了苦蕎抗逆的機(jī)制研究. 本研究參考擬南芥PP2C基因家族信息，通過(guò)生物信息學(xué)方法在苦蕎中全基因組中鑒定出81個(gè)PP2C成員，并分析了理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、保守基序分布、染色體定位、進(jìn)化情況等. 同時(shí)，通過(guò)qRT-PCR對(duì)苦蕎PP2C的A亞族基因組織特異性表達(dá)和ABA處理后受誘導(dǎo)情況進(jìn)行了分析. 這些結(jié)果對(duì)苦蕎PP2C基因家族的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ).

2 材料和方法

2.1 材 料

實(shí)驗(yàn)使用的苦蕎種子為西蕎1號(hào)，由西昌學(xué)院王安虎老師提供. 所有的實(shí)驗(yàn)材料在四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陽(yáng)臺(tái)上的無(wú)菌土壤中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)土壤為蛭石和土壤的混合物(1∶3, v/v). 在相同生長(zhǎng)條件下選擇生長(zhǎng)情況相同的樣品進(jìn)行處理. 將收集到的植物樣品用液氮處理后保存在-80 ℃的冰箱中用以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn).

苦蕎的基因組完整信息下載自TBGP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mbkbase.org/Pinku1/). 作為參考的擬南芥PP2C家族成員從已發(fā)表文獻(xiàn)中獲取，蛋白質(zhì)序列和CDS序列從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/index.html)下載.

2.2 方 法

2.2.1 苦蕎中PP2C家族成員的鑒定 通過(guò)參考擬南芥PP2C家族成員的蛋白質(zhì)序列和苦蕎其他基因家族的鑒定方法及參數(shù)選擇[7,13]，使用BLAST軟件[14]搜索苦蕎中PP2C家族的候選序列(score≥100 and e-value≤10-10)，并通過(guò)HMMER[15]軟件搜索PP2C結(jié)構(gòu)域輔以搜索候選序列(e-value≤10-2). PP2C結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件(HMM)下載自PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)：PF00481. 候選序列通過(guò)搜索PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證是否含PP2C結(jié)構(gòu)域以進(jìn)一步篩選. 篩選后的序列中去掉基因的可變剪切，最終確認(rèn)了81個(gè)苦蕎PP2C家族成員. 理論等電點(diǎn)(pI)和理論分子量(MW)等信息通過(guò)ExPasy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/compute_pi/)上傳蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析.

2.2.2 基于系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)苦蕎PP2C家族進(jìn)行分類 通過(guò)構(gòu)建苦蕎和擬南芥PP2C的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并參考擬南芥PP2C家族的分類，根據(jù)它們?cè)跇?shù)上的相對(duì)位置，將苦蕎PP2C分為不同的亞族. 其中，通過(guò)使用MUSCLE軟件(默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行序列比對(duì)，用RAxML-NG軟件[16](--all --msa input_file --model VT+I+G4+F --prefix at_ft --seed 678 --threads 4 --bs-tree autoMREs)構(gòu)建極大似然(ML)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù). 建樹(shù)的模型通過(guò)Modeltest-NG軟件分析，選擇“VT+I+G4+F”模型. 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可視化通過(guò)iTOL網(wǎng)站(https://itol.embl.de/)完成.

2.2.3 苦蕎PP2C家族的基因結(jié)構(gòu)分析和序列特征分析 苦蕎PP2C家族的基因結(jié)構(gòu)分析通過(guò)GSDS2.0網(wǎng)站(http://gsds.gao-lab.org/)完成，蛋白質(zhì)保守基序分析通過(guò)使用MEME工具(http://meme-suite.org/tools/meme)完成，MEME的參數(shù)調(diào)整為數(shù)目20，基序長(zhǎng)度參數(shù)調(diào)整為6至200.

2.2.4 苦蕎PP2C家族的染色體定位和基因重復(fù)事件分析 苦蕎PP2C家族的染色體定位基于苦蕎基因組信息完成. 苦蕎PP2C家族的基因重復(fù)事件分析使用BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)，MCScanX軟件[17]進(jìn)行線性分析(默認(rèn)參數(shù))，得到苦蕎PP2C家族的串聯(lián)重復(fù)事件和區(qū)段重復(fù)事件.

2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 為了分析苦蕎PP2C的9個(gè)A亞族基因的組織特異性表達(dá)，通過(guò)qRT-PCR對(duì)它們?cè)诳嗍w根、莖、葉、花、果實(shí)五個(gè)器官中的表達(dá)進(jìn)行分析，并進(jìn)行三組生物學(xué)重復(fù). 為了分析苦蕎PP2C的A亞族基因的受ABA誘導(dǎo)情況，用50 μmol/L ABA處理7日齡的苦蕎幼苗后通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行分析，其中，處理時(shí)長(zhǎng)分別為0 h、0.5 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，用吸水紙干燥表面后使用RNA提取試劑盒(Tiangen)的方法從植物材料中提取總RNA，并通過(guò)使用Prime Script RT試劑盒(Takara)的方法合成cDNA. 在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，引物通過(guò)Primer3程序(http://frodo.wi.mit.edu/)獲取(表1)，使用FtH3基因作為內(nèi)部參考基因. 之后通過(guò)2-(ΔΔCt)方法分析獲得的mRNA的表達(dá)情況.

3 結(jié) 果

3.1 苦蕎81個(gè)PP2C家族成員的鑒定

用BLAST軟件[14]和HMMER軟件[15]篩選出600多個(gè)候選序列，通過(guò)是否含PP2C結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步篩選出88個(gè)序列，在去除可變剪切的情況后，確認(rèn)了81個(gè)苦蕎PP2C家族成員. 根據(jù)它們?cè)谌旧w上的位置，從上往下依次命名為FtPP2C01至FtPP2C81，相關(guān)結(jié)果提供下載(https://github.com/felixlyd/ftpp2c)，其中，苦蕎PP2C的A亞族序列特征信息如表2所示. 在苦蕎PP2C家族中，蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度從125(FtPP2C06)至1 098(FtPP2C15)，平均長(zhǎng)度為400；理論等電點(diǎn)(pI)分布在4.34(FtPP2C31)至9.6(FtPP2C60)之間；理論分子量在13 975.72 kD(FtPP2C06)至123 818.42 kD(FtPP2C15)之間.

表1 苦蕎PP2C的A亞族基因表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量引物

表2 苦蕎PP2C家族的A亞族基因的序列特征信息

3.2 苦蕎PP2C家族基因的分類

161個(gè)PP2C基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)通過(guò)ML方法構(gòu)建(圖1)，其中，苦蕎PP2C基因數(shù)目為81，擬南芥PP2C基因數(shù)目為80. 根據(jù)擬南芥PP2C基因的分類[6]，將苦蕎PP2C基因分為從A至K共11個(gè)亞族，標(biāo)識(shí)“other”表示那些未分類的PP2C基因，其中，苦蕎PP2C的A亞族有9個(gè)基因. Bootstrap值用來(lái)標(biāo)識(shí)分類的可靠性. C亞族和D亞族的bootstrap值為99%，被分類為2個(gè)亞族；F亞族的兩個(gè)子亞族bootstrap值為92%，但這些基因被分類至F亞族. 這樣的分類方法是依據(jù)擬南芥PP2C的分類推導(dǎo)出的. 在進(jìn)化樹(shù)中，最大的亞族是E亞族，有13個(gè)苦蕎PP2C基因和14個(gè)擬南芥PP2C基因；最小的亞族是J亞族，只有1個(gè)苦蕎PP2C基因和2個(gè)擬南芥PP2C基因. 此外，結(jié)果表明苦蕎和擬南芥PP2C基因在各亞族的數(shù)目分布上趨近相同.

表3 苦蕎PP2C的保守基序信息

3.3 苦蕎PP2C家族的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

基因結(jié)構(gòu)分析主要為外顯子和內(nèi)含子分布分析(圖 2b). 結(jié)果表明苦蕎PP2C家族基因中，內(nèi)含子的數(shù)目最小為0(FtPP2C25)，最大為19(FtPP2C15)，但大多數(shù)分布在3至5之間，其中有27個(gè)苦蕎PP2C基因內(nèi)含子數(shù)目為3，占比三分之一；外顯子的數(shù)目分布為1(FtPP2C25)至20(FtPP2C15)，但大多數(shù)分布在4至6之間，其中有37個(gè)苦蕎PP2C基因外顯子數(shù)目為4，占比45.7%. 此外，在不同亞族間，外顯子和內(nèi)含子的分布有一定差異，但在同亞族中，苦蕎PP2C基因之間的外顯子和內(nèi)含子分布接近.

在苦蕎PP2C中找到了20個(gè)保守基序(motif)(圖 2a，表3). 除FtPP2C78、FtPP2C07、FtPP2C60、FtPP2C12、FtPP2C24外，其他苦蕎PP2C均含motif4. 除D亞族和K亞族外，其他亞族均含motif6. 苦蕎PP2C的A亞族的保守基序分布模式基本為motif14、motif4、motif18、motif1、motif7、motif6、motif2、motif20、motif10(除FtPP2C39和FtPP2C52不含motif14而FtPP2C44含額外的motif17). 其他亞族中的保守基序分布也極為接近，例如G亞族保守基序均為motif14、motif4、motif1、motif7、motif6、motif2、motif20、motif10；D亞族保守基序分布模式基本為motif 8、motif 4、motif 9、motif 1、motif 5、motif 15、motif 2、motif 3(FtPP2C45、FtPP2C48、FtPP2C41不含motif15；FtPP2C03不含motif8；FtPP2C54不含motif2和motif3).

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果和保守基序分析結(jié)果可驗(yàn)證苦蕎PP2C家族分類的正確性，根據(jù)這些結(jié)果可以推測(cè)出苦蕎PP2C不同亞族間的基因功能有一定差異.

圖2 81個(gè)苦蕎PP2C基因的保守基序分布和基因結(jié)構(gòu)分析 (a) 苦蕎PP2C的保守基序, (b)苦蕎PP2C基因的基因結(jié)構(gòu).Fig.2 The conserved protein motifs and gene structures of the 81FtPP2C genes (a)The conserved motifs of the FtPP2C proteins， (b)the gene structures of the FtPP2C genes.

3.4 苦蕎PP2C家族的染色體定位和基因重復(fù)事件分析

基于苦蕎基因組信息對(duì)苦蕎PP2C基因進(jìn)行染色體定位，結(jié)果表明苦蕎PP2C基因在苦蕎的8個(gè)染色體上均有分布，并且分布情況相對(duì)均勻(圖 3a). 苦蕎PP2C基因在染色體上的分布數(shù)量分別為：15(Ft1)、10(Ft2)、9(Ft3)、9(Ft4)、4(Ft5)、8(Ft6)、10(Ft7)、16(Ft8). 基因重復(fù)事件分析結(jié)果表明苦蕎PP2C家族沒(méi)有串聯(lián)重復(fù)事件，但是有14次分布在苦蕎不同染色體上的區(qū)段重復(fù)事件(圖3b). 這表明區(qū)段重復(fù)事件是苦蕎PP2C基因數(shù)量增多的重要途徑.

圖3 苦蕎PP2C基因的染色體分布及線性分析

3.5 苦蕎PP2C的A亞族基因的組織特異性表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR分析了苦蕎PP2C的A亞族基因在苦蕎根、莖、葉、花、果實(shí)五個(gè)器官中的表達(dá)模式，結(jié)果表明它們?cè)谒衅鞴僦芯斜磉_(dá). 其中，除FtPP2C44外，8個(gè)基因在苦蕎生殖器官尤其是果實(shí)中，表達(dá)量比較高(圖4a)，例如FtPP2C08主要在花和果實(shí)中表達(dá)，F(xiàn)tPP2C38在果實(shí)中的表達(dá)量是在葉中的1 715倍. 此外，F(xiàn)tPP2C39在根中表達(dá)量比較高，其他基因在根中表達(dá)量較低. 據(jù)此推測(cè)苦蕎PP2C家族的A亞族基因主要在苦蕎生殖器官中表達(dá)并發(fā)揮一定作用，這與之前擬南芥[6]、水稻[7]、大豆[8]中的研究一致.

3.6 苦蕎PP2C的A亞族基因受ABA誘導(dǎo)的表達(dá)情況

通過(guò)qRT-PCR分析了苦蕎PP2C的A亞族基因在ABA處理下的表達(dá)情況，其中，處理?xiàng)l件分別為0 h、0.5 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h(圖 4b). 結(jié)果表明除FtPP2C08外，8個(gè)基因均受ABA誘導(dǎo)表達(dá)量顯著上調(diào). 其中，在ABA誘導(dǎo)下4 h時(shí)，8個(gè)基因受ABA誘導(dǎo)表達(dá)量最高；FtPP2C39在所有處理?xiàng)l件下表達(dá)量都較高. 從而推測(cè)，苦蕎PP2C的A亞族基因在ABA處理后表達(dá)量上調(diào)具有一定生物學(xué)意義，而FtPP2C39發(fā)揮的作用可能較為重要.

圖4 苦蕎PP2C的A亞族基因的表達(dá)分析

4 討 論

過(guò)去的研究表明PP2C基因家族在植物中具有關(guān)鍵作用，但是目前有關(guān)苦蕎PP2C基因家族的研究很少. 本文從苦蕎全基因組中鑒定出81個(gè)PP2C家族成員，與擬南芥80個(gè)PP2C家族成員在數(shù)量上非常接近[7]. 對(duì)苦蕎和擬南芥PP2C進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將苦蕎PP2C分類為從A-K的11個(gè)亞族，其中苦蕎PP2C的A亞族有9個(gè)成員. 結(jié)果還表明除AT4G11040外，擬南芥PP2C其他分類結(jié)果與以前的研究一致. 這可能是因?yàn)闃?gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的方法不同，以前的研究[7]使用了鄰接法(NJ)而此處使用了極大似然法(ML). 此外，與擬南芥PP2C家族相比，苦蕎PP2C家族中C、D、K亞族的成員更多，而A、B、E、G、J亞族的成員更少. 基因重復(fù)事件分析結(jié)果表明苦蕎PP2C家族有14次區(qū)段重復(fù)事件，而擬南芥中則是13次，數(shù)值非常接近. 基因重復(fù)事件與基因家族的擴(kuò)增有關(guān)，從而推測(cè)這可能是兩者PP2C數(shù)量上十分接近的原因. 出現(xiàn)這種情況的原因可能是植物PP2C的基因功能在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守[18].

保守基序分析結(jié)果表明苦蕎PP2C家族在保守基序分布上有一定差異，但它們均含保守的PP2C結(jié)構(gòu)域. 而且在相同亞族中，蛋白質(zhì)保守基序的組成相近. 特定的保守基序分布可以代表特定的功能，例如擬南芥中PP2C的A亞族成員參與調(diào)控ABA應(yīng)答過(guò)程[7]，而它們的保守基序組成類似. 苦蕎PP2C的A亞族也具有相似的保守基序組成，與擬南芥PP2C的A亞族親緣性較高，從而推測(cè)苦蕎PP2C的A亞族也參與調(diào)控ABA應(yīng)答過(guò)程. 而qRT-PCR分析結(jié)果表明苦蕎PP2C的A亞族基因在ABA處理后除FtPP2C08外均受誘導(dǎo)表達(dá)顯著上調(diào)，上調(diào)的原因可能是因?yàn)锳BF結(jié)合PP2C啟動(dòng)子調(diào)控其表達(dá)[19]. 因此推測(cè)苦蕎PP2C的A亞族基因在苦蕎ABA應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮一定作用.

qRT-PCR分析結(jié)果還表明苦蕎PP2C的9個(gè)A亞族基因在根、莖、葉、花、果中均有一定表達(dá)，其中，F(xiàn)tPP2C08、FtPP2C17、FtPP2C38在花和果實(shí)中的表達(dá)量較高；FtPP2C39在根中表達(dá)量很高. 此外，F(xiàn)tPP2C39與擬南芥AT4G11040(又名DOG18)基因同源性較高，而擬南芥種子休眠和萌發(fā)受到DOG18的調(diào)控[20]，據(jù)此推測(cè)FtPP2C39在苦蕎種子休眠和萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮一定作用.

綜上所述，本文通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)苦蕎PP2C家族進(jìn)行分析，并通過(guò)qRT-PCR對(duì)苦蕎PP2C的A亞族基因進(jìn)行了組織特異性表達(dá)和ABA處理后受誘導(dǎo)情況分析，這些結(jié)果為進(jìn)一步挖掘和研究苦蕎PP2C家族的基因功能奠定了基礎(chǔ)，有利于進(jìn)一步對(duì)苦蕎抗逆的機(jī)制研究.