王鈞 王強 郭智

隨著基因組學(xué)和代謝組學(xué)的技術(shù)進步，利用下一代測序技術(shù)(NGS)可檢測腸道微生物的分類和功能屬性，通過綜合方式研究整個微生物組[1]。腸道微生物群可通過調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)和腫瘤微環(huán)境(TME)來影響腫瘤免疫，基于腸道菌群與免疫治療相關(guān)性挖掘微生物信息，開發(fā)可行的微生物干預(yù)方法[2-5]，有望優(yōu)化免疫檢查點抑制劑(ICI)不良反應(yīng)尤其是腸道并發(fā)癥的管理，通過對異常微生態(tài)系統(tǒng)的監(jiān)測減少ICI的不良反應(yīng)，避免ICI療效減低，也可通過微生態(tài)指標(biāo)的監(jiān)測對ICI的療效進行早期判斷，還能夠通過糞菌移植(FMT)[6]、益生菌[7]等改善ICI療效，通過移植正常腸道微生物作為調(diào)節(jié)抗原激活內(nèi)源性T細胞,把冷腫瘤變成熱腫瘤，進而使用ICI靶向腫瘤細胞。此外在ICI治療中，抗生素的合理用藥、針對ICI原發(fā)和繼發(fā)耐藥及不良反應(yīng)的早期預(yù)警也是臨床ICI應(yīng)用管理中關(guān)注的熱點問題?；跇?gòu)建腸道微生物群(抗原)與腫瘤抗原相似的“抗原模擬”策略可刺激體內(nèi)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，增強ICI抗腫瘤治療效果。

一、腸道微生態(tài)與機體免疫

1.腸道微生態(tài)的組成及功能

隨著科技的進步，人體腸道微生物組數(shù)量和分類在持續(xù)修正。這些微生物主要是細菌，還包括古生菌、真菌、病毒和蠕蟲等，多數(shù)存在于遠端腸道。目前已知腸道微生物群可影響宿主免疫功能、提供必需維生素合成、影響宿主細胞增殖和血管形成、調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳導(dǎo)及腸道內(nèi)分泌功能等，腸道菌群失衡會導(dǎo)致炎癥性腸病，與風(fēng)濕病、肥胖、糖尿病、特應(yīng)性過敏等有關(guān)[8-9]。目前大多數(shù)關(guān)于微生物組的研究文獻均集中于細菌或細菌組，已明確腸道細菌基因由數(shù)百萬個堿基對組成，稱為16S核糖體RNA多態(tài)性區(qū)域。目前NGS即基于16S DNA的定量鑒定進行細菌類型特征序列測定，如以糞便中腸桿菌的DNA為模板設(shè)計用于擴增部分16S區(qū)域的引物擴增基因。盡管細菌在微生物群落中占主導(dǎo)地位，但病毒、古生菌和真菌也可能在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用，只是由于病毒和真菌生物群落豐度較低及缺乏特征性識別和分類優(yōu)化工具，精選參考數(shù)據(jù)庫相對研究較少。

腸道病毒組主要包括DNA或RNA噬菌體，真菌主要包括曲霉屬、念珠菌屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬和酵母菌屬，腸道古生菌主要是產(chǎn)甲烷菌及嗜鹽(嗜鹽微生物)古生菌，蠕蟲物種從宿主-寄生蟲相互作用進行免疫調(diào)節(jié)。另外，一些傳染性非共生DNA和RNA病毒(如人乳頭瘤病毒、人類皰疹病毒8、EB病毒、巨細胞病毒、丙型肝炎病毒和人嗜T淋巴細胞病毒)均有致癌性。因此，人體微生物組被認(rèn)為是人體第二基因組，我們對腸道微生態(tài)的認(rèn)知才剛剛起步[10]。

2.腸道微生態(tài)與免疫系統(tǒng)及腫瘤發(fā)生的影響

腸道微生物組在免疫治療中的作用受到越來越多關(guān)注。細菌、病毒和真菌通過巨噬細胞激活固有免疫系統(tǒng)，進而通過T細胞[如輔助性T細胞(Th)1、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)]來激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。需要注意的是腸道中性菌即條件致病菌，如腸桿菌。腸道微生態(tài)平衡時它們是無害的，但在某些條件下具有攻擊性。有害細菌即腸道病原體，主要包括霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌和致病性大腸桿菌。如果人體腸道內(nèi)有害細菌過多，免疫系統(tǒng)就會被削弱，甚至?xí)a(chǎn)生致癌物等有害物質(zhì)[11]。

腸道菌群在人體環(huán)境中起著重要作用，能刺激機體淋巴組織增生并產(chǎn)生大量淋巴細胞，從而促進全身免疫系統(tǒng)和黏膜免疫系統(tǒng)正常發(fā)育及逐漸成熟。腸道菌群失衡可促進多種惡性腫瘤的發(fā)展，如胃腸道惡性腫瘤。與其他內(nèi)臟和黏膜組織相比，腸道在集體穩(wěn)態(tài)下持續(xù)暴露于飲食和腸道微生物群[外來抗原(Ag)]，將有或無膳食Ag和腸道微生物群條件下飼養(yǎng)的小鼠進行對比，發(fā)現(xiàn)微生物抗原可深刻影響腸道CD4+T細胞，尤其是腸道Treg細胞。廣泛的微生物物種能夠誘導(dǎo)腸道Foxp3+Treg(pTreg)細胞和Th17細胞。由微生物群和腫瘤新抗原介導(dǎo)的特異性T細胞具有多樣性、高表達的T細胞受體(TCR)，是宿主抵御眾多病原體及控制腫瘤生長的關(guān)鍵因素，腸道微生物群誘導(dǎo)CD4+T細胞分化為各種Th亞群，如腸外周pTreg和Th17細胞，由腸道微生物群產(chǎn)生的Treg細胞可防止來自飲食和腸道微生物的免疫反應(yīng)，如天然淋巴細胞(ILC)可通過調(diào)節(jié)IL-7的可用性來調(diào)節(jié)組織駐留T細胞的維持，尤其是組織駐留記憶CD8+T細胞。產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFAs)的微生物可增強針對病毒的特異性長記憶CD8+T細胞。這些局部 CD8+T細胞是靶向細胞內(nèi)病原體和腫瘤細胞的基礎(chǔ) 。此外，腸道中的CD8+T細胞，尤其是腸上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)可通過響應(yīng)腸道微生物群產(chǎn)生抗菌因子和組織修復(fù)因子，有助于組織穩(wěn)態(tài)和上皮修復(fù)[12]。這些效應(yīng)T細胞中，Th17具有促炎作用并有抗腫瘤功能，而IL-10介導(dǎo)的Treg細胞具有抗炎作用并導(dǎo)致效應(yīng)T細胞的抑制，CD8+T細胞產(chǎn)生的干擾素-γ(IFN-γ)具有抗腫瘤作用。除了細胞免疫系統(tǒng)，腸道上皮Peyer斑被認(rèn)為是一個組織良好的生發(fā)中心，其由不同的B細胞庫組成，分泌的IgA抗體是體液免疫的關(guān)鍵部分[13]。

3.TME內(nèi)的相互作用

TME對免疫應(yīng)答的負向調(diào)節(jié)會促進腫瘤進展，腫瘤能夠表達特異性免疫檢查點并利用此機制逃避T細胞攻擊，特別是T細胞受體程序性死亡受體1(PD-1)、PD-配體1(PD-L1)和PD-L2，這些配體通過PD-1與T細胞結(jié)合來阻止其激活。此外，腫瘤通過改變主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅰ的表達來對抗免疫應(yīng)答，從而限制交叉反應(yīng)性腫瘤相關(guān)抗原(TAA)表現(xiàn)為CTL。通過細胞因子和生長因子積累產(chǎn)生的慢性炎癥狀態(tài)促進免疫抑制細胞募集和誘導(dǎo)，如Treg細胞、髓源性抑制細胞(MDSC)和腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)。腫瘤來源的免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，如IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和粒細胞-單核細胞-集落刺激因子(GM-CSF)及前列腺素E2導(dǎo)致代謝失調(diào)和組織缺氧，有助于單核細胞和巨噬細胞向TAM極化。TAM分泌蛋白酶和細胞因子，如表皮生長因子(EGF)或VEGF，可進一步促進黑色素瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而有利于癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和新生血管生成。總之，TME構(gòu)成了一個免疫調(diào)節(jié)環(huán)境，其損害活化免疫細胞(包括T效應(yīng)細胞)的浸潤，T效應(yīng)細胞可能在血管邊界發(fā)揮抗腫瘤活性作用[14]。

二、免疫療法及ICI

1.免疫檢查點及免疫療法

免疫系統(tǒng)在腫瘤防治中至關(guān)重要，致癌因素導(dǎo)致基因突變形成腫瘤，但腫瘤的持續(xù)進展取決于其逃避宿主免疫監(jiān)視的能力。免疫檢查點的生理作用是限制免疫應(yīng)答，通過“關(guān)閉”CTL實現(xiàn)自我耐受、避免自我攻擊，但這也導(dǎo)致腫瘤細胞逃逸于T細胞的攻擊。癌細胞通過免疫檢查點途徑直接抑制CD8+CTL來逃避免疫，如PD-1和CTL活化抗原-4(CTLA-4)。免疫療法是加強或誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的治療技術(shù)，分為主動非特異性、主動特異性和被動方式[如給予腫瘤抗原、DNA或RNA疫苗、樹突細胞疫苗、抗腫瘤抗原受體、嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)、溶瘤病毒抗體等]。免疫療法是針對免疫細胞(T細胞)和(或)癌細胞上的免疫檢查點的抗體激活腫瘤特異性免疫反應(yīng)起作用[15-17]。

2.ICI及不良反應(yīng)

隨著伊匹利單抗成為首個商品化ICI，至今ICI的適應(yīng)證已擴大到黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤和其他實體腫瘤，如非小細胞肺癌、結(jié)腸癌和腎細胞癌等。ICI可單藥或與化療及其他ICI(雙重免疫檢查點阻斷)聯(lián)合使用，促進T細胞活化并靶向腫瘤細胞，目前研究最廣泛的是CTLA-4和PD-1/PD-L1。ICI單藥及聯(lián)合治療已成為許多不同類型腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。與ICI相關(guān)的獨特不良反應(yīng)稱為免疫相關(guān)不良反應(yīng)(irAE)，其與T細胞活化作用機制有關(guān)。幾乎所有器官系統(tǒng)都可能受到irAE的影響，包括皮膚、胃腸道、肺臟、內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)。不良反應(yīng)從輕微到危及生命，其發(fā)生時間可能延遲數(shù)周，不易管理。輕度irAE對癥治療即可，Ⅱ～Ⅳ級的irAE需評估是否停止治療并應(yīng)用ICI治療。irAE患者管理涉及個體患者長期目標(biāo)的多學(xué)科觀察協(xié)調(diào)，在使用ICI前臨床醫(yī)生必須了解與免疫療法相關(guān)的獨特且可能致命的毒理學(xué)特征，確保及時診斷管理[18]。

所有因疑似發(fā)生irAE的患者應(yīng)由具有irAE專業(yè)知識的腫瘤學(xué)?？漆t(yī)生進行評估。腫瘤科醫(yī)生與各亞?？漆t(yī)生協(xié)調(diào)會診，這些?？漆t(yī)生包括但不限于免疫檢驗學(xué)、心臟病學(xué)、皮膚病學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、胃腸病學(xué)、血液學(xué)、腎臟病學(xué)、神經(jīng)病學(xué)、眼科、呼吸病學(xué)、風(fēng)濕病學(xué)及ICU團隊的專家。Ⅰ～Ⅱ級irAE患者可繼續(xù)使用ICI治療，也可短暫中斷治療和監(jiān)測。重度irAE患者(Ⅲ～Ⅳ級)應(yīng)停用ICI。任何重新開始ICI的決定都應(yīng)在患者與其醫(yī)生團隊討論后作出，并考慮其器官特異性毒性、疾病復(fù)發(fā)可能性、預(yù)后和潛在的替代療法。

三、腸道微生態(tài)與ICI的交叉管理

1.ICI不良反應(yīng)管理

一項Meta分析結(jié)果顯示，約10%～30%的受試者出現(xiàn)≥Ⅲ級irAE，包括14%使用PD-1單藥的患者、34%使用CTLA-4單藥治療的患者及55%ICI聯(lián)合治療的患者均可能出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，需使用高劑量ICI并住院治療。此外irAE發(fā)展的分子機制仍不明確，也缺乏針對性預(yù)測的標(biāo)志物來早期識別可能發(fā)生ICI不良反應(yīng)風(fēng)險的個體。隨著ICI治療成為腫瘤治療的核心支柱，irAE的發(fā)病率將隨著ICI的使用而顯著增加[19-21]。

2.抗生素治療對腫瘤免疫治療期間ICI的負調(diào)節(jié)

流行病學(xué)研究揭示抗生素對免疫治療的有害影響，抗生素治療可引起腸道微生物群紊亂，可能降低相關(guān)ICI獲益。臨床試驗和臨床常規(guī)治療結(jié)果均顯示ICI治療后接受抗生素治療患者總生存率和治療反應(yīng)率均有降低，抗生素應(yīng)用可能與腸道微生物群受損有關(guān)，進而影響免疫細胞的發(fā)育和功能。在抗生素抑制腸道益生菌后，Th1/Th2細胞和Treg細胞的數(shù)量和性能發(fā)生了變化，抗菌肽表達水平降低，IgA分泌減少，IFN-γ表達水平下調(diào)，機體更易受感染?？股貙δc道微生物群影響也可能干擾ICI的功效，但目前評估微生物群、抗生素和ICI之間關(guān)系的研究多為回顧性，建議在評估后不用或僅選用窄譜抗生素[22-23]。

3.腫瘤對ICI的耐藥與腸道微生態(tài)

腫瘤對ICI的耐藥分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性耐藥是指腫瘤細胞通過改變與DNA損傷反應(yīng)、細胞信號通路或免疫識別相關(guān)過程來獲得對ICI的耐藥性，機制包括以下方面：(1)腫瘤新抗原的呈遞或表觀遺傳學(xué)上改變，影響免疫反應(yīng)激活和效應(yīng)T細胞募集；(2)腫瘤MHCⅡ/Ⅰ結(jié)構(gòu)的改變影響抗原呈遞；(3)干擾素(INF)信號通路功能失調(diào)導(dǎo)致抗腫瘤T細胞效應(yīng)功能不足。繼發(fā)性耐藥的影響因素包括TME、年齡等宿主因素、遺傳背景、合并癥、飲食、抗生素和類固醇的使用、代謝和腸道微生物群等。任何判斷及評估耐藥、及時調(diào)整藥物包括聯(lián)合用藥對患者的預(yù)后均具有重要價值[24]。

4.微生物特異性T細胞對自身抗原和新抗原交叉反應(yīng)用于腫瘤治療

抗原模擬是腸道微生物群在腫瘤耐藥中發(fā)揮作用的一個方面，可以利用給予腫瘤耐藥患者移植腸道微生物群并將其作為“腫瘤抗原模擬物”策略誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性T細胞，在克服腫瘤耐藥中發(fā)揮作用。腸道微生物群決定了腫瘤患者對ICI治療的反應(yīng)，該治療可重振腫瘤相關(guān)Ag特異性耗盡的CD8+T細胞。對ICI治療有反應(yīng)的腫瘤患者中腸道微生物群的微生物組成與無反應(yīng)者不同。此外，糞便微生物群從應(yīng)答者轉(zhuǎn)移到荷瘤的無菌(GF)小鼠中可增加抗腫瘤效果，減少腫瘤負擔(dān)。從健康個體移植糞便微生物群，重建患者抗原系統(tǒng)使無應(yīng)答者對ICI治療有反應(yīng)，如某些具有抗腫瘤作用的微生物通過Toll樣受體(TLR)激活樹突狀細胞，并促進Th1和CD8+T細胞反應(yīng)，有助于腫瘤免疫監(jiān)視和根除。腸道微生物是一種Ag來源，可刺激交叉反應(yīng)性腫瘤相關(guān)Ag(TAA)特異性CD8+T細胞?；谏镄畔W(xué)和計算分析揭示腸道微生物群中TAAs與微生物Ags之間的模擬性，可合理地設(shè)計微生物聯(lián)盟，由可能通過抗原模擬誘導(dǎo)TAA特異性CD8+T細胞反應(yīng)的微生物組成。能否通過腸道微生物群(厚壁菌和擬桿菌門)產(chǎn)生的TAA和腫瘤抗原之間的同源性，即腸道微生物與Ag之間的抗原模擬激發(fā)ICI反應(yīng)，是目前科學(xué)研究的一個方向[25-26]。

5.基于微生態(tài)的ICI調(diào)節(jié)

盡管通過益生菌與FMT來調(diào)節(jié)微生物組在一些臨床和實驗?zāi)Ｐ椭挟a(chǎn)生了有希望的結(jié)果，但其中大多數(shù)并不一致，且可能無法提供一致的臨床益處。如益生菌(單菌株或多菌株)被認(rèn)為是腸道微生物組成的天然、安全和有益的調(diào)節(jié)劑，但其功效取決于菌株和劑量，且并非所有益生菌都能對抗全部疾病。另外一種方法是FMT，如從抗PD-1應(yīng)答者中制備糞便樣本，其樣本中所攜的共生菌做為抗原，能誘被移植患者腸道產(chǎn)生有活性的淋巴細胞，然后再通過內(nèi)窺鏡將微生物移植到抗PD-1耐藥且腸道組成不佳的患者體內(nèi)。這種方法與已證明有效用于治療患者難治性/艱難梭菌感染的策略相同。豐富的腸道微生物菌群在PD-1免疫治療和T細胞反應(yīng)中充當(dāng)免疫佐劑，可能與PD-1/PD-L1免疫治療聯(lián)系較深。有大量T細胞浸潤的熱腫瘤對腫瘤免疫治療反應(yīng)率最高。靶向抑制Vps34可將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)化為“熱腫瘤”，從而增強PD-L1/PD-1阻斷療法的療效，基于生物信息學(xué)和計算分析揭示腸道微生物群中TAAs與微生物Ags之間的模擬性，可合理地設(shè)計微生物聯(lián)盟，由可能通過抗原模擬誘導(dǎo)TAA特異性CD8+CTL反應(yīng)的微生物組成。通過結(jié)合分析腫瘤浸潤T細胞的TCR庫及基于TCR序列的肽-MHC特異性預(yù)測，進一步改善療效[27-30]。

四、總語

腸道微生態(tài)對腫瘤的影響取決于微生物群、腫瘤和免疫系統(tǒng)之間的相互作用。人腸道微生物群參與宿主免疫應(yīng)答并調(diào)節(jié)腫瘤免疫周期的多個步驟，包括抗原呈遞、T細胞啟動和激活。通過結(jié)合微生物組和宿主多組學(xué)表征的方法(如16S核糖體RNA基因擴增子測序、微生物組的鳥槍法宏基因組測序和代謝組學(xué)表征及宿主的單細胞RNA測序)結(jié)合臨床前模型(無菌小鼠模型)，以便改善ICI在腫瘤患者治療中的效果。此外，抗生素的使用現(xiàn)已被證明是影響ICI療效的動態(tài)因素，識別微生物群將促進臨床治療個體化(如使用窄譜抗生素或FMT等)發(fā)展。同時希望ICI耐藥患者通過調(diào)節(jié)腸道微生物群的方式激活正常細胞免疫以改善ICI的療效。