汪盛華，秦春娟，安雙鳳，閆 明,*，徐芳芳，張書嘉，章晨峰，王團(tuán)結(jié),，王振中,，肖 偉,*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

3.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001

中藥配方顆粒是指由凈制合格的單味飲片經(jīng)提取精制后，干燥、制粒而成的顆粒[1]，相較于中藥飲片而言，具有易于服用、體積小、攜帶方便等特點，因此也受到患者的廣泛認(rèn)可[2]。從國家首次提出中藥配方顆粒試點工作開始，到2021年2月國家藥品監(jiān)督管理局等多部門宣布關(guān)于終止中藥配方顆粒試點工作，時間間隔已近30年；伴隨國家相關(guān)法規(guī)制度的出臺與完善，中藥配方顆粒在質(zhì)量控制方面得到快速發(fā)展[3-5]。雖國家大力扶持中藥配方顆粒的發(fā)展，但與此同時在質(zhì)量控制方面仍然面臨諸多問題與挑戰(zhàn)[6]。例如在實際大生產(chǎn)過程中，因中間體物料屬性差異導(dǎo)致生產(chǎn)工序上出現(xiàn)析出、焦屑等溶化性問題，影響最終產(chǎn)品質(zhì)量。

溶化性是顆粒劑考察的重要指標(biāo)，也是反映質(zhì)量屬性的外在體現(xiàn)。本研究從中藥粉體物料屬性角度，探討水提工藝下干法制粒的中藥配方顆粒溶化性的影響機(jī)制，運(yùn)用SeDeM 專家系統(tǒng)[7-10]及粉體學(xué)屬性對中間體粉末與顆粒進(jìn)行綜合表征[11-12]。采用二維矩陣熱圖與系統(tǒng)聚類分析（hierachical cluster analysis，HCA）對各品種物性參數(shù)間相似性進(jìn)行評價與歸類分析，并通過運(yùn)用多元統(tǒng)計分析方法偏最小二乘回歸（partial least squares regression method，PLS）與主成分分析（principal component analysis，PCA）建立物料粉體學(xué)屬性與顆粒溶化率之間的相關(guān)模型，初步篩選出關(guān)鍵物料屬性（critical material attributes，CMAs），為后期相關(guān)品種工藝改進(jìn)提供參考。中藥物料屬性復(fù)雜，理化性質(zhì)較多，單一變量分析不能很好地呈現(xiàn)各指標(biāo)間的相互關(guān)系，且無法對全部信息進(jìn)行綜合分析，而PCA 和PLS 可以克服單變量分析方法的缺陷，實現(xiàn)對多變量多因素的全面分析與判別[13-14]。PCA 是一種基于數(shù)學(xué)降維思維，將原來變量重新組合成幾個能反映盡可能多變量信息的綜合變量的統(tǒng)計方法[15-16]。PLS 是建立在自變量的潛變量關(guān)于因變量的潛變量矩陣上的線性回歸模型，可以實現(xiàn)多種數(shù)據(jù)分析的綜合運(yùn)用[17-18]。本研究中從提取工藝角度出發(fā)，以水提條件下干法制粒得到的60 種中藥配方顆粒為研究對象，結(jié)合2種多元統(tǒng)計方法對收集到的60 種中藥配方顆?；旌戏叟c對應(yīng)顆粒進(jìn)行模型關(guān)聯(lián)分析，以建立起中藥配方顆粒中間體粉體學(xué)與顆粒溶化性相互關(guān)系，從物料本身屬性闡明水提工藝下中藥配方顆粒質(zhì)量影響機(jī)制。

1 儀器與材料

Mettler Toledo 204 型萬分之一電子天平，梅特勒-托利多；Bettersize 2600 型激光粒度分布儀、BT1001 型智能粉體特性測試儀，丹東百特儀器有限公司；50 mm×30 mm 玻璃量瓶，東方科教儀器產(chǎn)；MYP11-2 型磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；HWS26 型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、LHS-250HC-II型恒溫恒濕箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

生產(chǎn)真實世界中對水提工藝下的中藥配方顆粒制粒前一步混合粉及干法制粒所得顆粒進(jìn)行收集，60 種中間體物料信息見表1，所有物料均購自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司。

表1 60 種中藥配方顆粒品名與批號Table 1 Name and batch number of 60 kinds of TCM formula granules

2 方法與結(jié)果

2.1 粉體與顆粒質(zhì)量屬性表征方法

2.1.1 松裝密度（Da） 采用智能粉體特性測試儀測定。待各元件組裝及參數(shù)設(shè)置（進(jìn)料速度4 mg/s，進(jìn)料時間300 s）后，把空的100 mL 量杯放在天平上進(jìn)行稱定質(zhì)量，將待測粉末加入振動篩中，啟動進(jìn)料待樣品充滿量杯并溢出后停止，用刮板將量杯口刮平后取出稱定質(zhì)量，計算Da，平行測定3 次。

2.1.2 振實密度（Dc） 使用智能粉體特性測試儀固定體積法測定。按照提示組裝相應(yīng)組件并完成參數(shù)設(shè)置后，稱定空的100 mL 量杯后，將空杯與100 mL 延長筒連接，向量筒里加入樣品后啟動振實，經(jīng)250 Hz、1250 次振動后取下延長筒，用刮板將杯口刮平后稱定質(zhì)量，計算Dc，平行測定3 次。

2.1.3 豪斯納比（IH） 由Dc與Da計算得到，計算公式如下[12,19]。

IH＝Dc/Da

2.1.4 卡爾指數(shù)（IC） 由Da與Dc計算而得，公式如下[12,19]。

IC＝(Dc－Da)/Dc

2.1.5 顆粒間孔隙率（Ie） 由Da與Dc計算而得，公式如下[12,19]。

Ie＝(Dc－Da)/(DcDa)

2.1.6 休止角（α） 采用智能粉體特性測試儀固定底面積法測定。按照提示組裝好各元件及設(shè)置參數(shù)（進(jìn)料速度4 mg/s，進(jìn)料時間200 s）后，向振動篩中加入樣品，啟動振動，直至下落粉末在平臺形成對稱圓錐體且平臺周圍都有粉體落下，停止測定休止角，平行測定3 次。

2.1.7 粒徑（D10、D50、D60、D90）與比表面積（specific surface area，SSA）、均勻性（uniformity，UN） 使用激光粒度分布儀進(jìn)行測試。取適量待測粉末置于激光粒度儀干法進(jìn)樣器中，以空氣為分散媒介，分別測定累積粒度分布數(shù)達(dá)到10%、50%、60%、90%時所對應(yīng)的粒徑D10、D50、D60、D90及SSA、UN。

2.1.8 粒徑分布范圍（width）與分布寬度（span）由粒徑D10、D50、D90計算而得，公式如下[12,19]。

width＝D90－D10

span＝(D90－D10)/D50

2.1.9 粒徑＜50 μm 百分比（Pf） 采用激光粒度分布儀，加入適量待測粉末樣品于干法進(jìn)樣器中，以空氣為介質(zhì)，計算Pf。

2.1.10 相對均齊度指數(shù)（Iθ） 使用激光粒度分布儀，以空氣為介質(zhì)，將粉末樣品加入干法進(jìn)料斗中，測定粉末的粒度分布，計算每個粒徑范圍內(nèi)待測粉末所占的百分比。分別選取粒徑355、212、100、50μm 4 個粒徑節(jié)點的粉末進(jìn)行計算，公式如下[12,19]。

Iθ＝Fm/[100＋(dm－dm－1)Fm－1＋(dm＋1－dm)Fm＋1＋(dmdm－2)Fm－2＋(dm＋2－dm)Fm＋2…(dm＋n－dm)Fm＋n]

n為所確定的粒徑范圍個數(shù)，F(xiàn)m代表粉末粒徑在多數(shù)范圍的質(zhì)量百分比，F(xiàn)m－1為多數(shù)粒徑范圍下一層篩子截留粉末的質(zhì)量百分比，F(xiàn)m+1為多數(shù)粒徑范圍上一層篩子截留粉末的質(zhì)量百分比，dm為多數(shù)粒徑范圍的粉末平均值，dm－1為多數(shù)粒徑范圍下一層篩子截留粉末平均粒徑，dm+1為多數(shù)粒徑范圍上一層篩子截留粉末的平均粒徑

2.1.11 吸濕性（H） 取洗凈干燥后的具塞稱量瓶，敞口置于事先設(shè)置好的恒溫恒濕箱［溫度（25±2）℃，濕度（75±2）%）］中平衡12 h，蓋上蓋子，取出稱定質(zhì)量（M1），加入約1 g 待測粉末于瓶中稱定質(zhì)量（M2），并平鋪于稱量瓶底部。將稱量瓶繼續(xù)敞口于恒溫恒濕箱中，24 h 后蓋好稱量瓶瓶蓋，精密稱定質(zhì)量（M3），計算公式如下。

H＝(M3－M2)/(M2－M1)

2.1.12 含水量（HR） 取干燥恒定質(zhì)量過的具塞稱量瓶（M4），向瓶中加入約2 g 待測粉末稱定（M5），并平鋪于瓶底，置于105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中先恒定質(zhì)量5 h 后取出放置室溫稱定質(zhì)量，再放回干燥箱中恒定質(zhì)量1 h，取出，放置室溫稱定質(zhì)量（M6），計算公式如下。

HR＝(M5－M6)/(M5－M4)

晶體管上的源/漏極開路缺陷可以被抽象成晶體管與電源或地之間的開路電阻,R1表示P1與VDD之間的開路電阻,R2表示P2與VDD之間的開路電阻,R3表示N3與VSS之間的開路電阻,R4表示N4與VSS之間的開路電阻?；诘碗妷?T SRAM結(jié)構(gòu),電阻R1、R2、R3、R4的依次注入,每次只添加一個附加電阻,阻值由小到大變化,同時觀察電路輸出狀態(tài),直到單元讀寫發(fā)生錯誤,并記錄最小可檢測電阻,如表1所示。

2.1.13 顆粒溶化性 參考《中國藥典》2020年版[20]三部0104 顆粒劑溶化性測定方法：稱取約10 g 顆粒樣品（M7）于250 mL 燒杯中，加入200 mL 熱水［（75±2）℃］攪拌5 min，趁熱濾過，將濾液轉(zhuǎn)移置已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿（M8）上蒸干，放入105 ℃干燥箱干燥至恒定質(zhì)量，取出放入干燥器中放涼后稱定質(zhì)量（M9），計算溶化率（dissolution rate，DR），計算公式如下。

DR＝(M9－M8)/M7

2.2 數(shù)據(jù)分析方法

采用GraphPad Prism 軟件（Version 8.0，美國GraphPad Software 公司）對各品種物性指標(biāo)間相似性進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并繪制二維相關(guān)系數(shù)矩陣熱點圖。運(yùn)用SPSS Statistics 軟件（Version 24.0，美國IBM公司）對各品種粉體學(xué)測定數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)合SIMCA 軟件（Version 14.1，瑞典MKS Umetrics 公司）建立HCA、PCA-PLS 相關(guān)性模型預(yù)測分析。

2.3 各品種間物性指標(biāo)的相關(guān)性分析

以60 個中藥配方顆粒制粒前一步混合粉及顆粒為研究對象，各粉體學(xué)指標(biāo)測得的數(shù)據(jù)見表2。同時以各品種的18 個物性指標(biāo)構(gòu)建物料屬性相關(guān)性熱點圖（圖1）分析，以科學(xué)評價各品種在物理屬性上的相關(guān)性。熱點圖（圖1）中各品種在同一指標(biāo)上顏色越深或者色差一致，說明品種在該物性指標(biāo)上相似性越高，反之，若各品種在某一指標(biāo)上色差越大，表明在該指標(biāo)上品種間相關(guān)性越差。結(jié)果顯示，各品種在Da、Dc、IH、Ie、IC、HR、Iθ 及D10、UN、span 上存在較高相似性，在a及D50、D60、D90、Pf、SSA、width 上存在差異，各品種間物性指標(biāo)相關(guān)系數(shù)為-0.951～1.000，其物性指標(biāo)間的相關(guān)性需做進(jìn)一步分析。

圖1 各品種中藥配方顆粒間物性指標(biāo)相關(guān)性熱點圖Fig.1 Hot spot map of correlation of physical properties index between various TCM formula granules

表2 60 個品種18 個物性指標(biāo)測定數(shù)據(jù)Table 2 Determination data of 18 physical properties of 60 varieties

續(xù)表2

2.4 粉體物料屬性的多元統(tǒng)計分析

基于上述各品種物性指標(biāo)間相關(guān)性分析，以18個參數(shù)表征數(shù)據(jù)做進(jìn)一步HCA，通過離差平方和法（Ward）計算類間相關(guān)系數(shù)，對60 個中藥配方顆粒進(jìn)行分類（圖2）。結(jié)果顯示，60 種中藥配方顆粒按粉體學(xué)屬性可歸為5 類，其中CYHS、THF、YHS、MBH 與BH 中藥配方顆粒聚為一類，HQ、MHJ、JG、ZBJT、GL、HY、SDH、MPPY、CXF、JSZ、HH 及MSBP12 種配方顆粒為一類，ZSZ、FF、JDG、DZ、DG、HS、CBCH、ZL、XD、YZ、HHP、HHH、MZC、YCH、YDZ、SW 與XKC 17 種配方顆粒為一類，F(xiàn)CZQ、HSW、SG、ZGC、YYDH 與JCR 6種配方顆粒為一類，WM、XF、CP、HJT、QH、DFZ、ZZGG、WY、SZ、SD、KS、TFL、JHQ、HB、XJ、QP、DZY、MHD、HZ 與ZJF 20 種配方顆粒聚集為一類，說明各品種物性參數(shù)存在一定的差異。物料屬性除了受粉體參數(shù)相互間的影響外，本身所含的化學(xué)成分也可能引起物性的差異，值得進(jìn)一步深入研究。采用PCA 對60 批粉體物料的18 個變量進(jìn)行分析，提取到的特征信息見表3。其中主成分1（PC1）方差貢獻(xiàn)率達(dá)53.87%，主成分2（PC2）與主成分3（PC3）方差貢獻(xiàn)率分別為15.62%、10.33%，累積貢獻(xiàn)率為79.82%，選取3 個主成分構(gòu)建PCA模型，PCA 得分圖見圖3。結(jié)果表明各品種批次信息并不會對物料屬性產(chǎn)生影響，2 種模型結(jié)果一致，其粉體學(xué)數(shù)據(jù)可做進(jìn)一步模型分析。

圖3 各品種配方顆粒生產(chǎn)真實世界物料屬性PCA 得分圖Fig.3 PCA score chart of material properties in real world production of various TCM formula granules

表3 數(shù)學(xué)模型的PCATable 3 PCA of mathematical model

圖2 60 種中藥配方顆粒物理屬性的HCA 樹狀分析Fig.2 HCA tree analysis of physical properties of 60 kinds of TCM formula granules

2.5 各物性指標(biāo)間的相關(guān)性分析

以60 個品種測得的18 個物性參數(shù)進(jìn)行指標(biāo)間相關(guān)性系數(shù)分析，其相關(guān)系數(shù)P值見表4，并繪制其二維矩陣熱點圖（圖4），圖中以白色為基線，顏色越紅或越綠，說明指標(biāo)間相關(guān)性越高，顏色越淺，其相關(guān)性越弱。從結(jié)果可以看出，Da、Ie、IC、IH、D10、D50與α呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；Dc、Ie、IC、IH、D10、D50、D60、D90、SSA、Iθ、width、Pf 與Da有顯著相關(guān)（P＜0.05）；Ie、IC、IH、D10、D50、D60、D90、SSA、Iθ、width、Pf 與Dc呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；IC、IH、D10、D50、D60、D90、SSA、Iθ、width、Pf 與Ie呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；IH、D10、D50、D60、D90、SSA、Iθ、width、Pf 與IC 呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；D10、D50、D60、D90、SSA、Iθ、width、Pf 與IH 顯著相關(guān)（P＜0.05）；D50、D60、D90、UN、SSA、span、Iθ、width、Pf 與D10顯著相關(guān)（P＜0.05）；D60、D90、SSA、Iθ、width、Pf 與D50顯著相關(guān)（P＜0.05）；D90、SSA、Iθ、width、Pf 與D60顯著相關(guān)（P＜0.05）；SSA、Iθ、width、Pf 與D90顯著相關(guān)（P＜0.05）；Iθ、span、width、Pf 與SSA；width、Pf與Iθ 呈顯著相關(guān)（P＜0.05）。同時發(fā)現(xiàn)，某些粉體屬性可以對多個指標(biāo)產(chǎn)生影響，如粒徑D10、D50、D60、D90、Pf、width 與Iθ 可以對粉體可壓性屬性造成影響，也反映出物料粉體性質(zhì)之間存在一定的關(guān)聯(lián)性及動態(tài)性，其中不同粒徑分布大小之間相關(guān)性更加顯著。

圖4 18 個物性指標(biāo)間相關(guān)矩陣熱點圖Fig.4 Hot spot diagram of correlation matrix among 18 physical property indexes

表4 指標(biāo)間相關(guān)性系數(shù)P 值Table 4 P value of correlation coefficient between indicators

2.6 中藥配方顆粒溶化性CMAs 的篩選

以各品種18 個物性參數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后作為自變量，顆粒DR 為因變量構(gòu)建PLS-DA 關(guān)鍵物料屬性辨識模型。同時以交叉驗證決定系數(shù)（Q2）、校正決定系數(shù)（R2X）與預(yù)測決定系數(shù)（R2Y）作為模型性能指標(biāo)，三者的值越接近于1，說明建立的模型預(yù)測和校正性能越好。結(jié)果顯示，Q2＝0.991，R2X＝0.973，R2Y＝0.994，計算后得到的模型相對預(yù)測誤差為7.70%＜10%，說明該模型預(yù)測性能較好。各品種粉體學(xué)性質(zhì)對顆粒溶化性的響應(yīng)值（variable importance for the projection，VIP）見圖5，由圖可知，對顆粒溶化性影響較為顯著（VIP 值大于1，說明自變量對因變量影響顯著）的有α、IH、IC、H、Pf、HR、span、UN、Dc、SSA、Da與Ie。α、IH 反映粉末的流動性；IC 與Ie反映粉末的可壓性；Da、Dc均表征的是粉末的堆積性；H與HR 反映其穩(wěn)定性；故在中藥配方顆粒生產(chǎn)過程中可以通過控制粉體的流動性、堆積性、穩(wěn)定性和表面形態(tài)等指標(biāo)達(dá)到改善顆粒的溶化性。

圖5 模型的VIP 值分布Fig.5 VIP distribution of PLS model

圖6 模型的相關(guān)系數(shù)Fig.6 Correlation coefficient of PLS model

以方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）為評價指標(biāo)，對12 個pCMAs 進(jìn)一步做變量共線性分析，結(jié)果見表5。其中VIF 小于10 表明存在弱共線性，介于10～100 則存在較強(qiáng)的共線性[21-22]?？梢钥吹溅痢R、H與SSA 的VIF 值均小于10，說明這4 個變量存在較弱共線性。

表5 模型變量的VIF 值Table 5 VIF value of model variable

綜上分析結(jié)果，VIF＜10 且VIP＞1 的變量為α、HR、H與SSA，同時4 個變量的回歸系數(shù)均為正，對顆粒溶化性影響較顯著，故可將其作為CMAs，提示在實際生產(chǎn)過程中可以從這4 個物理屬性指標(biāo)來控制水提條件下干法制粒的中藥配方顆粒溶化性問題。

3 討論

隨著國家對中藥配方顆粒相關(guān)法規(guī)的推進(jìn)與出臺，配方顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也已經(jīng)由“一企一規(guī)”轉(zhuǎn)為國家與企業(yè)共同制定，大大加快了中藥配方顆粒生產(chǎn)應(yīng)用進(jìn)程[5]。目前，對中藥質(zhì)量一致性評價包含化學(xué)成分與生物效應(yīng)的一致性評估[23-24]，中藥配方顆粒作為傳統(tǒng)湯劑的衍生物，化學(xué)成分的含量及品種評價不足以評價兩者的一致性，因為其藥效活性不僅受化學(xué)成分含量與種類影響，還有不同化合物間的相態(tài)影響[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，在當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同體系中，物料表面性質(zhì)可作為其質(zhì)量控制和制備工藝的參考指標(biāo)[27]。這也提示在中藥配方顆粒質(zhì)量控制方面應(yīng)關(guān)注中間體物料的物理屬性影響，挖掘更多理化參數(shù)，以提高產(chǎn)品質(zhì)量。

本實驗從提取工藝角度出發(fā)，以水提條件下的60 種中藥配方顆粒的混合粉與干法制粒所得顆粒為研究對象，通過對各品種粉體物料屬性進(jìn)行相關(guān)性分析與評價，初步篩選出α、HR、H與SSA 為影響水提工藝下干法制粒的中藥配方顆粒溶化性關(guān)鍵物料屬性。中藥配方顆粒以單味藥材入藥，不同藥材中所含成分存在差異，本實驗物料中以水溶性成分為主。從分析結(jié)果來看，水溶性成分的粉體學(xué)屬性中α、HR、H與SSA 是影響干法制粒所得配方顆粒溶化性的關(guān)鍵因素。針對不同提取工藝下所得粉體物料對顆粒溶化性影響的機(jī)制探索將是今后研究方向，同時同一提取條件下的粉體物料對不同制粒方式的中藥配方顆粒溶化性影響也值得進(jìn)一步探討。本研究基于中藥配方顆粒中間體粉體學(xué)性質(zhì)，采用二維相關(guān)性矩陣熱圖對品種間與指標(biāo)間相似性進(jìn)行分析，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法初步建立粉體物料屬性與顆粒溶化性關(guān)聯(lián)模型。研究中收集的樣本數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于大生產(chǎn)數(shù)據(jù)，后期將進(jìn)一步增大樣本量，以提高模型相關(guān)預(yù)測性能，為提升中藥配方顆粒質(zhì)量和生產(chǎn)提供參考與借鑒。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突