徐書翔，文 萍，李宇超，趙少康，陳仕毅，賈先波

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130)

世界上畜牧業(yè)發(fā)達的國家對肉牛產(chǎn)業(yè)十分重視，目前我國雖然牛肉產(chǎn)量高，但是由于我國肉牛產(chǎn)業(yè)20世紀(jì)80年代才起步，發(fā)展時間短，基礎(chǔ)薄弱，導(dǎo)致整體的牛肉品質(zhì)不高，優(yōu)質(zhì)高檔的牛肉主要依賴進口[1]。隨著我國經(jīng)濟水平的提高，人們對食物的品質(zhì)也越來越重視。研究表明，牛肉中含有人體所需的8種必需氨基酸，且必需氨基酸占總氨基酸的比例(39.0%)，高于羊肉(37.2%)、豬肉(38.3%)和雞肉(33.5%)。牛肉還具有低脂肪的特點，其脂肪含量(5.7%)顯著低于人們?nèi)粘ＯM量較大的豬肉(6.6%)和羊肉(7.0%)[2]。肉產(chǎn)品中脂肪酸的含量和種類不僅直接影響其營養(yǎng)價值，而且對人體健康具有重要意義[3]。由于牛肉口感好，營養(yǎng)價值高，所以深受人們的喜愛，牛肉需求量不斷增高。據(jù)《2021年度肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)發(fā)展報告》報道，2021年，我國屠宰肉牛約2975萬頭，胴體總產(chǎn)量約為758×104t，牛肉總產(chǎn)值約6609億元。屠宰牦牛約 378 萬頭，胴體產(chǎn)量約為48.4 ×104t，牦牛肉總產(chǎn)值約為445 億元(肉牛牦牛體系測算)。我國牛肉進口總量233.26×104t，進口均價5.35美元/kg，進口額124.89億美元。

由于牛肉的價格會受到氣候、地域、經(jīng)濟條件等社會因素影響，導(dǎo)致不同牛肉及其肉制品的價格差異很大。目前市售常見牛肉有黃牛肉、牦牛肉和水牛肉，通常黃牛肉品質(zhì)較好，價格較貴，市場上往往會出現(xiàn)用便宜的水牛肉或牦牛肉替代黃牛肉等情況，以賺取差價利潤，這導(dǎo)致市售商品牛肉品質(zhì)往往混雜不一，難以辨別。人們對肉質(zhì)評定僅僅是一種感官評價，缺乏對牛肉品質(zhì)客觀的科學(xué)分析。雖然假牛肉往往顏色較淡，紋路較為散亂，口感會過于嫩滑，但是現(xiàn)在不良商家也有著多種手段去偽造真牛肉的質(zhì)感，因此牛肉品質(zhì)的鑒定與因素分析具有非常重要的意義。從營養(yǎng)角度來說，不同牦牛肉的粗蛋白、水分有較大差異，而脂肪差距較小，且較其他牛種更低[4]。秦川牛肉的水分不存在顯著差異，但粗蛋白和脂肪含量均存在與性別相關(guān)的顯著性差異[5]。水牛的各項營養(yǎng)品質(zhì)不存在顯著差異，但水牛肉的水分含量要高于牦牛肉和黃牛肉[6]。從現(xiàn)有數(shù)據(jù)來看，牦牛肉及黃牛肉的初始pH較高，在中性pH附近，極限pH在5.4～5.8之間。水牛肉初始pH較低，在6.0左右，極限pH與牦牛、黃牛差異不大。同一年齡段的黃牛肉嫩度最好，其次為水牛，而牦牛嫩度最差。但是由于嫩度與牛的年齡也有很大關(guān)系，因而3種牛嫩度的差異不能一概而論。

研究發(fā)現(xiàn)南陽牛與延邊牛西冷部位肉的汁液損失相當(dāng)(1%) ，差異不顯著(P>0.05) ，而蒸煮損失南陽牛顯著高于延邊牛(P<0.05)，分別為 31.87%和27.03%。秦川牛公牛西冷和牛霖部位肉的汁液損失和蒸煮損失均顯著低于魯西公牛(P<0.05)，其中魯西黃牛西冷部位肉的汁液損失以及蒸煮損失分別為2.12%和43.80%。SPANGHERO等[7]研究發(fā)現(xiàn)水牛和西門塔爾牛的蒸煮損失無顯著差異(33%左右) (P>0.05)。根據(jù)現(xiàn)有資料數(shù)據(jù)多序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃牛、牦牛、水牛12S rDNA基因不僅在片段長度上存在一定差異，而且在堿基序列上存在更為顯著的差異，顯示出明顯的種間特異性。牛種間12S rDNA基因序列差異百分比顯示，牦牛與水牛之間最大(約7.5%)，黃牛與水牛之間居中(約6.8%)，黃牛與牦牛之間最小(約3.2%)[8]。

現(xiàn)有文獻已分析了常見牛肉種類的品質(zhì)分析方法以及影響因素，但文獻采用的材料往往都是肉牛生產(chǎn)商提供的優(yōu)質(zhì)牛肉，我們需要了解當(dāng)今市面上銷售的牛肉種類和品質(zhì)狀況，就無法通過資料獲得相應(yīng)的的信息，因此只能去實地采集樣品，通過牛肉品質(zhì)測定的實驗方法來對市售牛肉進行鑒定。這樣我們就可以了解到我們現(xiàn)在日常生活中所食用的牛肉品質(zhì)。通過鑒定我們?nèi)粘Ｊ秤玫呐Ｈ馄焚|(zhì)，可以對我國牛肉品質(zhì)、處理、保存及運輸水平有大致了解。本實驗將從大型商超和各大農(nóng)貿(mào)市場隨機采購牛肉樣品，同時走訪調(diào)查、發(fā)布問卷，了解人們對牛肉的食用頻率和摻假牛肉鑒別程度，最后通過肉品質(zhì)實驗和DNA測序，對所購買的市售牛肉樣品進行檢測，得到牛肉種屬與品質(zhì)的檢測結(jié)果，最終對市售牛肉的來源和品質(zhì)進行評價。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器設(shè)備

25份市售牛肉樣品(分別采購自成都市3家大型商超和3處農(nóng)貿(mào)市場)，TIANamp Genomic DNA Kit 組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，DNAmaker，超聲波細胞粉碎機，恒溫水浴鍋，離心機，PCRTOUCH，振蕩機，剪切力儀，-20℃冰箱，實驗剪子與鑷子，酸度計，凝膠電泳儀，微波爐，EP管，電子秤，凝膠成像儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 市售商品牛肉問卷調(diào)查 制定調(diào)查問卷，到人流量較大的購物中心，隨機進行問卷調(diào)查，回收調(diào)查問卷，統(tǒng)計問卷結(jié)果數(shù)據(jù)，分布比例采用卡方檢驗或者Fisher精確檢驗進行比較。

1.2.2 pH檢測 將25份牛肉樣品分好編號，將酸度計垂直插入牛肉中心部分，記錄pH。

1.2.3 熟肉率檢測 每份牛肉樣品各取20.00g肌肉，電子天平稱重后蒸煮60min，后冷卻至室溫后再次稱重，使用下列公式計算熟肉率：熟肉率=蒸煮后肉樣重/蒸煮前肉樣重×100%[9]。

1.2.4 系水力檢測 每份樣品取20.00g肌肉，電子天平稱重記錄后，裝入樣品袋中，注意樣品不能與袋子接觸，置于4℃冰箱冷藏24h后取出肉樣品，用濾紙吸干肉樣品表面水分后再次稱重記錄。并使用下列公式計算系水率：系水率=滴水后肉樣重/滴水前肉樣重×100%[10]。

1.2.5 剪切力檢測 將牛肉樣品取出，垂直于肌纖維直徑方向，取厚度約為 5cm， 長寬為6cm的肌肉樣，重量約500g，注意除去肉樣表面附著的脂肪組織，放入水浴鍋水浴，水浴溫度設(shè)為 80℃，用穿刺溫度計持續(xù)測量肉樣中心溫度，當(dāng)肉樣中心溫度達到 71℃時， 繼續(xù)水浴約10min，取出肉樣，用濾紙吸干表面水分，放置冷卻至室溫。 用柱狀取樣器(直徑約1.27cm) 鉆取肉柱，注意取樣時要避開筋腱，每個肉樣取3個肉柱。用剪切力儀測定肉柱的剪切力值，記錄數(shù)據(jù)和圖表[11～12]。

1.2.6 DNA提取 將25份牛肉樣品剪取黃豆大小置于一個新的EP管中，向其中加入800μL PBS緩沖液置于超聲波細胞粉碎機制成粉碎懸浮液。使用天根磁珠法動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP341)提取樣品DNA。

1.2.7 PCR擴增 將獲得的DNA溶液使用通用引物(F：CAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT，R：GAGGGTGACGGGCGGTGTGT)擴增出目標(biāo)片段，該引物由成都擎科生物科技有限公司合成。PCR實驗采用30μL體系，分別加入24μL PCRmix(天根2×Taq PCR預(yù)混試劑Ⅱ(KT211))，上下游引物各1.5μL，DNA樣品3μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸50s，34個循環(huán)；4℃保溫。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組提取效果。

1.2.8 物種鑒定 將擴增PCR產(chǎn)物送至成都擎科生物科技有限公司進行sanger雙向測序，測序所得序列利用DNA manX軟件分別與黃牛，水牛和牦牛的參考序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析親緣關(guān)系的遠近并判斷該種牛肉的種屬[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 問卷調(diào)查結(jié)果

本次問卷調(diào)查一共發(fā)出30份，回收20份有效調(diào)查問卷，調(diào)查結(jié)果見圖1-10。在問卷統(tǒng)計中，購買市售牛肉的均價為54.6元/kg，而人們平均食用牛肉2.18 kg/年。由圖1可見，在此次問卷調(diào)查中，40%為男性，60%為女性，男女比例差異不顯著(P>0.05)。

圖1 問卷調(diào)查中男女比例

由圖2可見，人群收入40%為5000以內(nèi)，30%為5000～10000，25%為10000～20000，5%為20000以上，各收入層次人群比例差異不顯著(P>0.05)。

圖2 問卷調(diào)查中家庭年收入

由圖3可見，25歲以下和56歲以上各5%，26歲到35歲為40%，36歲到45歲為25%，46歲到55歲為25%，各年齡階段人群比例差異不顯著(P>0.05)。

圖3 問卷調(diào)查中年齡結(jié)構(gòu)

由圖4可見，家庭食用牛肉間隔2～3d的為5%，3～7d的為40%，1周以上的為55%，不同牛肉食用頻率人群比例差異顯著(P<0.05)。1周以上牛肉食用頻率人群比例和3～7d牛肉食用人群比例顯著大于2～3d肉牛食用頻率人群(P<0.05)，1周以上牛肉食用頻率人群比例和3～7d牛肉食用人群比例差異不顯著(P>0.05)

圖4 問卷調(diào)查中家庭食用牛肉頻率

由圖5可見，60%的人優(yōu)先選擇購買生牛肉，15%的人優(yōu)先購買熟牛肉，25%的人表示都可以，購買生/熟牛肉頻率人群比例差異顯著(P<0.05)。選擇購買生牛肉的人群比例顯著高于購買熟牛肉和都可以的人群比例(P<0.05)，選擇購買熟牛肉和都可以的人群比例差異不顯著(P>0.05)。

圖5 問卷調(diào)查中牛肉購買傾向

由圖6可見，40%的人每次購買0.5kg牛肉，50%的人每次購買1.0～1.5kg牛肉，10%的人會購買1.5kg以上的牛肉，差異顯著(P<0.05)。每次購買0.5kg和1.0～1.5kg牛肉的人顯著高于每次購買1.5kg以上牛肉的人(P<0.05)，每次購買0.5kg和1.0～1.5kg牛肉的人顯著不顯著(P>0.05)。

圖6 問卷調(diào)查中家庭單次購買牛肉數(shù)量

由圖7可見，52%的人會從大型商超購買牛肉，48%的人會從農(nóng)貿(mào)市場購買牛肉，差異不顯著(P>0.05)。

圖7 問卷調(diào)查中牛肉購買渠道

由圖8可見，95%的人沒有遇到過市售牛肉摻假的情況，但仍有5%的人買到了摻假牛肉，差異顯著(P<0.05)。

圖8 問卷調(diào)查中是否購買過假牛肉

由圖9可見，75%的人能夠接受網(wǎng)上購買熟牛肉，25%的人則難以接受，差異顯著(P<0.05)。

圖9 問卷調(diào)查中是否接受購買熟牛肉

由圖10可見，在購買牛肉的頻率上，間隔3d以內(nèi)的僅有5%的人，3～7d的有35%，60%的人購買牛肉間隔1周以上，差異顯著(P<0.05)。間隔3～7d和間隔1周以上的人數(shù)顯著高于間隔3d以內(nèi)的人數(shù)(P<0.05)，間隔3～7d和間隔1周以上的人數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

圖10 問卷調(diào)查中家庭購買牛肉頻率

2.2 不同來源的牛肉價格分析結(jié)果

本次調(diào)查在3個商超和3個農(nóng)貿(mào)市場采集了25份牛肉樣品，其中有黃牛肉樣品21份，牦牛肉樣品4份，具體結(jié)果見表1。

表1 不同種類牛肉價格和品質(zhì)分析結(jié)果

商超1按照不同品牌不同部位售賣，商超2、商超3和農(nóng)貿(mào)市場按照不同部位售賣。由表2可見，不同牛肉采樣點的平均價格由高到低分別為商超3>商超2>商超1>農(nóng)貿(mào)市場1>農(nóng)貿(mào)市場3>農(nóng)貿(mào)市場2，平均價格差異極顯著(P<0.01)。

表2 不同采樣地牛肉價格分析結(jié)果

表3可知，不同種類牛肉平均價格由高到低為黃牛肉>牦牛肉，平均價格差異極顯著(P<0.01)。

表3 不同種類牛肉價格分析結(jié)果

由表4可知，不同部位牛肉平均價格由高到低分別為里脊>腿肉>牛腩，平均價格差異極顯著(P<0.01)。

表4 不同部位牛肉價格分析結(jié)果

2.3 不同來源牛肉品質(zhì)分析結(jié)果

由表5可見，牦牛肉樣品的pH范圍為5.92～6.32，平均pH為6.09±0.15，黃牛肉樣品的pH范圍為5.17～6.17，平均pH為5.48±0.28%，牦牛肉平均pH顯著高于黃牛肉(P<0.05)。牦牛肉樣品的熟肉率范圍為62%～72%，平均熟肉率為66.8±0.04%，黃牛肉樣品的肉熟肉率范圍為59%～85%，平均熟肉率為68.6±0.06%，牦牛肉平均熟肉率顯著低于黃牛肉(P<0.05)。牦牛肉樣品的吸水力范圍為95%～97%，平均系水力為96，黃牛肉樣品的吸水力范圍為93%～99%，平均系水力為96，牦牛肉平均系水力與黃牛肉差異不顯著(P>0.05)。牦牛肉樣品的剪切力范圍為6.0～14.5kg·f，平均剪切力為10.85kg·f，黃牛肉樣品的剪切力范圍為2.8～12.2 kg·f，平均剪切力為5.79kg·f，牦牛肉平均剪切力顯著高于黃牛肉(P<0.05)。

表5 牛肉品質(zhì)分析數(shù)據(jù)

2.4 不同來源的牛肉種屬分析結(jié)果

如圖11所示最右邊為DNAmaker2000，PCR產(chǎn)物從右向左分別為牛肉樣品1-24號，經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶明亮且特異性好，無雜帶，在大約440bp處獲得一清晰的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，說明DNA片段擴增成功。

圖11 樣本基因 PCR 結(jié)果

為了確定肉牛樣品種類，我們將25個樣本擴增片段測序后用DNAMAN 軟件與從NCBI Genebank下載的參考序列：黃牛(登錄號：AJ885201.1)、牦牛(登錄號：GQ926974.1)、水牛(登錄號：MG214157.1)[13]進行對比，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹圖12，以分析牛肉樣品的種屬關(guān)系。結(jié)果顯示，所有來自農(nóng)貿(mào)市場和2份來自大型商超的黃牛肉樣品與牦牛參考序列聚在一起，說明它們是牦牛肉，與樣品售賣時的標(biāo)注不一致。其它來自商超的黃牛肉樣品和農(nóng)貿(mào)市場的牦牛肉樣品分別與黃牛參考序列或牦牛參考序列聚在一起，說明它們是黃牛肉或者牦牛肉，與樣品售賣時的標(biāo)注一致。

圖12 牛肉樣品種屬分析

3 討論

牛肉作為常見的餐桌肉類，鑒別其種源特性對幫助消費者選擇健康牛肉、打擊摻假肉牛具有重要意義。隨著DNA測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，基于PCR擴增、sanger 測序、DNA指紋圖譜等的常見測序技術(shù)為我們快速識別牛肉種屬和判定牛肉來源提供了有效的手段。動物線粒體DNA是一種環(huán)狀、閉合的雙鏈DNA分子，具有結(jié)構(gòu)簡單、進化速率快、性質(zhì)穩(wěn)定等特點，被廣泛用做動物群體遺傳結(jié)構(gòu)、起源進化及地理分布等方面研究的分子標(biāo)記。已有大量研究證明，通過比對線粒體DNA的序列，可以對深加工的肉制品進行真?zhèn)舞b別。本研究首先采用問卷調(diào)查的形式分析消費者的購買習(xí)慣，然后分別從不同市場購買不同牛肉進行pH、系水力、熟肉率等肉品質(zhì)鑒定，最后采用DNA 雙向測序?qū)λ繕?biāo)DNA片段進行特異性擴增，從而區(qū)分牛肉種屬來源。

3.1 肉品質(zhì)結(jié)果分析

本實驗所測量的熟肉率和滴水損失是衡量牛肉保水性的重要指標(biāo)，pH為牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。剛屠宰的牛肉pH通常為7.2～7.4，宰后糖酵解產(chǎn)生乳酸堆積，使牛肉pH下降至5.3～5.8[14]。賈先波等報道，通江黃牛平均pH、熟肉率、剪切力分別為6.41、60.64、9.66kg·f；夏西本雜交牛平均pH、熟肉率、剪切力分別為6.59、54.47、5.33kg·f[15]。在本實驗中，市售牦牛肉樣品平均pH、熟肉率、剪切力分別為6.09、66.8、10.85kg·f；市售黃牛肉樣品平均pH、熟肉率、剪切力分別為5.48、68.6、5.79kg·f。本實驗所采樣獲得的實驗數(shù)據(jù)與前人報道的牛肉品質(zhì)數(shù)據(jù)基本一致。本實驗所測的各項數(shù)據(jù)中，各種牛肉樣品均處于合理范圍，說明都是真牛肉，微小差異可能與牛肉處理和保存環(huán)境有關(guān)。市售商品牛肉樣品熟肉率較高，可能是由于市售牛肉經(jīng)過較長時間的運輸保存，牛肉水分減少導(dǎo)致。不同品種的牛肉嫩度有顯著性差異(p<0.05)，造成所測的剪切力數(shù)據(jù)也有較大的差異。這是由肌肉中的各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性所決定的，通常來說，黃牛肉較牦牛肉和水牛肉嫩[16]，而在所測數(shù)據(jù)中，1號樣品為黃牛肉，但嫩度卻和牦牛肉相當(dāng)，其余黃牛肉樣品均符合理論剪切力值。

3.2 DNA序列鑒定結(jié)果分析

使用PCR擴增和DNA序列鑒定技術(shù)，使我們能夠?qū)崿F(xiàn)快速、精確地進行牛肉種源鑒定。吳周林等報道，利用12S rRNA基因?qū)λ拇ǖ貐^(qū)7種牛肉干進行真?zhèn)舞b別，在大約440bp處獲得了清晰亮帶，通過構(gòu)建進化樹檢測出一黃牛肉干樣本由牦牛肉干假冒而成[17]。本試驗利用12S rRNA基因?qū)κ惺凵唐放Ｈ膺M行分析，在大約440bp處獲得了清晰亮帶，通過構(gòu)建進化樹檢測出商超1同一品牌的2份黃牛肉樣本和農(nóng)貿(mào)市場的3份黃牛肉樣本均屬于牦牛。這與吳周林等所報道的實驗結(jié)果基本一致，證明利用12S rRNA基因可以對牛肉品種進行鑒別，市場上存在利用牦牛肉代替黃牛肉售賣的現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本調(diào)查從消費者、牛肉品質(zhì)和牛肉來源等3個方面進行調(diào)查，反映出了居民的牛肉消費習(xí)慣，市場售賣的牛肉品質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)部分商超和農(nóng)貿(mào)市場存在用牦牛肉當(dāng)做黃牛肉售賣的問題。本次調(diào)查為消費者選購生鮮牛肉提供了科學(xué)的參考，同時也為肉牛養(yǎng)殖者和牛肉生產(chǎn)者在生產(chǎn)和銷售牛肉中的策略提供了參考。