張紅芳， 施偉領(lǐng)， 馬靈燕， 呂文濤， 楊彩梅， 楊 華， 吳酬飛， 肖英平*

（1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000；2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江杭州 310021；3.浙江大飛龍動(dòng)物保健品股份有限公司，浙江金華 321017；4浙江萬方生物科技有限公司，浙江湖州 313300）

腸道作為哺乳動(dòng)物最重要的器官，其腸內(nèi)含有與宿主健康相關(guān)的多種微生物（Zhaxi，2020；徐娥，2019）。這些微生物在維持宿主生長發(fā)育方面發(fā)揮著顯著作用，例如合成維生素，刺激與免疫相關(guān)的組織來抵御病原菌的入侵，提供營養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物（李潔，2020；鄭有秀，2018）。仔豬作為豬生長發(fā)育中最重要的階段，其在斷奶期間引起的應(yīng)激會(huì)打破宿主與腸道微生物的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)和黏膜屏障損毀，容易引起仔豬腹瀉、采食量降低、生長速度緩慢，甚至死亡（Xun，2015；Campbell，2013）。研究表明，在飼料中加入微生態(tài)制劑能夠有效地改善斷奶仔豬的生長性能（李慧敏，2022），主要是通過改變宿主體內(nèi)腸道微環(huán)境，促進(jìn)宿主體內(nèi)有益菌的增加，抑制有害菌的生長起到益生作用（黃其田，2017）。特別是自2020年飼料全面實(shí)施禁抗以來，尋找綠色安全，無毒害作用的微生態(tài)制劑已成為必經(jīng)之路（Ming，2021）。眾所周知，丁酸梭菌作為一種能調(diào)節(jié)動(dòng)物疾病的革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，作為促進(jìn)動(dòng)物生長的飼料添加劑已被廣泛應(yīng)用。在日糧中添加丁酸梭菌可以顯著降低畜禽的腹瀉率和腸道通透性，增加營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，維持腸上皮屏障的完整性（李娜，2021；Fu，2021）。丁酸梭菌能夠使仔豬血清樣本中IgA、IgG蛋白的濃度明顯升高（李玉鵬，2020）。此外，丁酸梭菌在機(jī)體內(nèi)的代謝物SCFAs能夠?yàn)榇竽c提供必要的能量，對(duì)維持宿主的免疫穩(wěn)態(tài)起調(diào)節(jié)作用（Koh，2016），特別是在丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶作用下生成的代謝物能夠?yàn)闄C(jī)體腸道上皮細(xì)胞再生和修復(fù)等生物學(xué)過程提供必要的營養(yǎng)（楊華，2019）。然而，目前的研究大多集中在丁酸梭菌作為益生菌對(duì)仔豬生長性能、血清免疫的用途（Wang，2019a），對(duì)于丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬盲腸菌群及其產(chǎn)丁酸代謝的研究較少。因此，本試驗(yàn)通過研究丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在揭示微生物及微生物代謝產(chǎn)物（SCFAs）與宿主的關(guān)系，為丁酸梭菌替代抗生素在畜牧中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì) 選取日齡為（25±1）d、重量為（6.24±0.32）kg的“杜×長×大”斷奶仔豬162頭，隨機(jī)分成3個(gè)試驗(yàn)組。處理如下：對(duì)照組（Ctrl組）給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，試驗(yàn)組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加入濃度為500 mg/kg（CB500組）和2000 mg/kg（CB2000組）的丁酸梭菌。試驗(yàn)仔豬飼喂的常規(guī)飼料成分與配方參照鄭有秀（2018）的報(bào)道，飼養(yǎng)期為30 d，然后從每個(gè)組中選取4頭仔豬進(jìn)行屠宰，取盲腸內(nèi)容物于-80℃保存用于測序。

1.2 DNA提取和產(chǎn)丁酸關(guān)鍵功能基因RTPCR分析 用QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN，CA）試劑盒從試驗(yàn)仔豬盲腸內(nèi)提取一定量的微生物DNA，參照趙廣民（2021）的引物序列（表1）對(duì)仔豬盲腸丁酸激酶和丁酰-CoA，乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增體系共10μL，分別為5.0 μL SYBRTM Green Mix，上、下游引物各0.5μL，dd H2O 4.0μL，擴(kuò)增流程為:在溫度為95℃的條件下進(jìn)行預(yù)變性2 min；95℃變性15 s；58℃退火45 s；最后在72℃延伸1 min；共三十次循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置三次重復(fù)，根據(jù)所測定的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比來計(jì)算樣本中基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 短鏈脂肪酸測定 參照Xiao（2017）的方法進(jìn)行短鏈脂肪酸含量的測定，具體為稱取斷奶仔豬盲腸腸道內(nèi)容物0.5 g于15 mL的離心管中，加入5 mL超純水，緩慢搖晃至混合均勻，12000 r/min離心10 min。抽取1 mL的上清液后，向其中加入0.2 mL的巴豆酸和偏磷酸混合液，之后使用規(guī)格為0.22μm的濾膜對(duì)上述混合液進(jìn)行過濾，之后使 用毛細(xì)管 氣 相 色 譜 儀 （GC-2010 plus，Shimadzu，Japan）測定短鏈脂肪酸的濃度。

1.4 高通量測序和生物信息學(xué)分析 用341F（5＇-CCTAYGGGRB-GCASCAG-3＇）和806R（5＇-GGACTACNNGGG-TATCTAAT-3＇）對(duì)16S rRNA基因的高變區(qū)（V3～V4區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增，并借助于Illumina Hiseq平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行測定分析。用QIIME平臺(tái)對(duì)相似度為97%的測序數(shù)據(jù)按照不同操作單元（OTU）進(jìn)行分類。用Sliva和RPD對(duì)OTU中全部典型序列進(jìn)行物種匹配。之后按照最終有效數(shù)據(jù)對(duì)其不同分類下的相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析 qPCR、SCFA兩個(gè)試試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan's法進(jìn)行多重比較，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05為數(shù)據(jù)差異有意義。并用Graph Pad Prim7軟件包進(jìn)行微生物多樣性作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對(duì)仔豬盲腸菌群豐度和多樣性的影響 由表2可知，相比對(duì)照組，用丁酸梭菌處理可以使仔豬盲腸內(nèi)容物中菌群α多樣性的豐度指數(shù)（chao）指數(shù)和香農(nóng)（shannon）指數(shù)有明顯的升高趨勢。且本次測序樣本覆蓋度（Goods_coverage）指數(shù)為0.996～0.997，說明本次測序樣本的覆蓋度較全面，符合測序要求。

表2 仔豬盲腸菌群alpha多樣性分析

2.2 丁酸梭菌對(duì)仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)的分析 門和屬水平的盲腸內(nèi)容物中的細(xì)菌群落組成見圖1，在仔豬盲腸中相對(duì)豐度最高的三個(gè)優(yōu)勢菌門分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobac-teria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）、其厚壁菌門和變形菌門的相對(duì)豐度分別為61.67%～86.95%和4.96%～24.84%，擬桿菌門為3.37%～16.71%。且與Ctrl組相比，CB2000組的變形菌門和廣古菌門（Euryarchaeota）相對(duì)豐度分別下降了1.34%和6.62%（P＜0.05）。

圖1 丁酸梭菌對(duì)仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

在屬水平上，其相對(duì)豐度最高的有梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）、土 孢 桿 菌 屬（Terrisporobacter）、直腸真桿菌屬（[Eubacterium]_rectale_group）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、幽門螺桿菌（Helicobacter）、普雷沃氏菌屬（Prevotella_9）、布勞特氏菌屬（Blautia）、罕見小球菌屬（Subdoligranulum）、羅斯氏菌屬（Roseburia）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）。相比對(duì)照組而言，CB500組中Terrisporobacter和Staphylococcus相對(duì)豐度分別增加了0.38%和0.14%（P＜0.05）。

由圖2可知，與Ctrl組相比，CB2000組的彎曲菌屬（Campylobacter）和瘤胃菌屬（Ruminococcaceae_UCG-014）的相對(duì)豐度分別下降了5.5%和0.72%（P＜0.05）。但相比于Ctrl組，CB500組的庫特氏菌屬（Kurthia）和鏈球菌屬（Streptococcus）分別增加了0.71%和0.03%（P＜0.05）。

圖2 仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)熱點(diǎn)圖（前35種菌屬）

2.3 不同水平丁酸梭菌對(duì)仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)Beta多樣性分析 由圖3可知，基于非加權(quán)法通過對(duì)不同水平丁酸梭菌對(duì)仔豬盲腸菌群樣品間的差異進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)R=0.1065時(shí)，對(duì)照組和試驗(yàn)組有顯著不同的聚類，且試驗(yàn)組在不同水平下有不同的聚類，說明試驗(yàn)組和對(duì)照組仔豬盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)存在差異，且試驗(yàn)組在不同水平的丁酸梭菌濃度添加下其菌群結(jié)構(gòu)也存在差異。

圖3 仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)主坐標(biāo)分析

2.4 丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬盲腸SCFA的影響由表3可知，與對(duì)照組相比，丁酸梭菌處理使斷奶仔豬盲腸中丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總短鏈脂肪酸的含量有增多趨勢，其中丁酸含量增加趨勢較為明顯（P=0.064），且CB2000組丁酸含量比對(duì)照組增加了28.0%。

表3 仔豬盲腸短鏈脂肪酸含量

2.5 丁酸梭菌仔豬盲腸產(chǎn)丁酸代謝關(guān)鍵功能基因的影響 由表4可知，與對(duì)照組相比，丁酸梭菌處理組的丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)表達(dá)含量增加，尤其是丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量增加顯著（P＜0.05），且CB2000組丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量與對(duì)照組相比增加了15%。

表4 仔豬盲腸丁酸激酶和丁酰－CoA：乙酰－CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對(duì)表達(dá)量

3 討論

丁酸梭菌制劑作為一種活菌被廣泛應(yīng)用于豬、牛和家禽飼料中，其產(chǎn)生的芽孢能夠抵制外界環(huán)境的惡劣變化，并且在生物體內(nèi)能夠耐酸、耐熱、耐膽汁。Scalfaro（2017）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌進(jìn)入人和動(dòng)物腸道后，通過產(chǎn)生抗菌化合物如有機(jī)酸和細(xì)菌素來增強(qiáng)腸上皮屏障功能，進(jìn)而對(duì)病原體起到一定的拮抗效果，導(dǎo)致病原菌的增殖生長速率大幅下降，改善免疫狀態(tài)、腸黏膜結(jié)構(gòu)和腸道微生物的分布。Wang（2019b）用不同水平濃度的丁酸梭菌對(duì)仔豬空腸進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)，處理組腸道內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)水平明顯下調(diào)，這說明丁酸梭菌能夠?qū)LR4炎癥通路起到一定的調(diào)節(jié)控制作用，進(jìn)而使LPS誘導(dǎo)的機(jī)體炎性反應(yīng)明顯減緩。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能夠使仔豬腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群含量明顯增多，進(jìn)而對(duì)毒害菌群的增殖和生長產(chǎn)生一定的抑制作用，進(jìn)而使機(jī)體免疫系統(tǒng)生物學(xué)功能顯著增強(qiáng)，并有效促進(jìn)機(jī)體的生長發(fā)育（趙敏孟，2018）。本研究中，在斷奶仔豬日糧中添加500 mg/kg的丁酸梭菌可以顯著增加盲腸菌群厚壁菌門的相對(duì)豐度，通過進(jìn)一步對(duì)屬水平上進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，盲腸內(nèi)容物中鏈球菌屬（Streptococcus）的相對(duì)豐度顯著增加，彎 曲 菌 屬（Campylobacter）和 瘤 胃 菌 屬（Ruminococcaceae_UCG-014）等條件致病菌的相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05），這與Han（2020）和王遠(yuǎn)霞（2020）的研究結(jié)果一致。說明用丁酸梭菌處理可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，有效的緩解仔豬腹瀉。

丁酸作為腸上皮細(xì)胞的主要能源物質(zhì)，在人體結(jié)腸內(nèi)超過95%的丁酸被吸收利用，既維持了生物體內(nèi)結(jié)腸細(xì)胞的穩(wěn)定，又可以防止或抑制細(xì)胞發(fā)生病變，且一定水平的丁酸能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群來治療腸應(yīng)激綜合征。在動(dòng)物中，丁酸作為具有多種生物學(xué)特性的脂肪酸，能夠促進(jìn)動(dòng)物的生長性能并影響動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)（黃翠翠，2021）。Elamin（2013）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸通過增加黏液層的厚度來對(duì)Caco-2細(xì)胞起保護(hù)作用。丁酸梭菌代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（SCFA）特別是丁酸等可以被后腸迅速吸收，既維持了大腸的正常功能，又降低了腸道滲透壓和pH，有利于提高動(dòng)物腸道內(nèi)消化酶的活性（林華林，2019）。本研究中丁酸梭菌處理的斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物中丙酸、丁酸、戊酸的含量均有增加趨勢，產(chǎn)丁酸代謝關(guān)鍵酶丁酰－CoA：乙酰－CoA轉(zhuǎn)移酶基因的相對(duì)表達(dá)量明顯升高。這表明丁酸梭菌有助于生成多種對(duì)機(jī)體有益的代謝物，例如維生素和胞外酶等，進(jìn)而改善機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和消化，更好的塑造腸道代謝環(huán)境，有益于斷奶仔豬健康。

4 結(jié)論

丁酸梭菌處理能夠增加仔豬盲腸鏈球菌屬、庫特氏菌屬、土孢桿菌屬的豐度，顯著降低仔豬腸道內(nèi)彎曲菌屬和瘤胃菌屬等條件致病菌的豐度。丁酸梭菌處理能夠使腸道短鏈脂肪酸含量呈增加趨勢，且產(chǎn)丁酸的關(guān)鍵酶丁酰－CoA：乙酰－CoA轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平顯著上調(diào)。