盧哲丞， 張春桃， 成述儒， 屠 焰*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

大豆粕作為目前我國畜禽飼料中應(yīng)用最為廣泛的植物性蛋白質(zhì)飼料原料，每年消耗量很高，難以自給自足（鄭祖庭，2019），致使大豆進(jìn)口量逐漸攀升，進(jìn)口依賴度居高不下。近年來受中美貿(mào)易摩擦及全球新冠大流行的影響，大豆及其副產(chǎn)品的國際貿(mào)易受阻，嚴(yán)重影響了我國的飼料行業(yè)（He等，2019）。大豆粕等飼料原料的價格波動不斷，進(jìn)一步增大了畜牧養(yǎng)殖成本，實(shí)施大豆減量計(jì)劃已成為國家、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部及行業(yè)重點(diǎn)關(guān)注的問題（薛俊敬等，2019）。充分利用非常規(guī)蛋白飼料資源（如菜籽粕、棉籽粕等）替代大豆粕，進(jìn)而減少對大豆粕需求是大勢所趨，但受抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響使得雜粕整體的營養(yǎng)性及適口性較差（Le等，2021；Yusuf等，2021），因此，用其替代大豆粕時應(yīng)注意適宜的添加比例，以免影響畜禽的采食及健康。

體外產(chǎn)氣法由Menke等（1988）所提出，是一種借助產(chǎn)氣管等體外產(chǎn)氣裝置來模擬反芻動物瘤胃內(nèi)部的發(fā)酵過程，并通過測定飼草料的體外發(fā)酵產(chǎn)氣量，進(jìn)而評定其營養(yǎng)價值的試驗(yàn)方法，相比傳統(tǒng)的動物試驗(yàn)而言更為簡便，且數(shù)據(jù)重復(fù)性更好，應(yīng)用已十分廣泛。我國在1983年開始在奶牛的相關(guān)研究上使用此方法 （丁角立等，1983）。Sallam等（2007）通過體外產(chǎn)氣法驗(yàn)證了不同飼草料的體外產(chǎn)氣量與其營養(yǎng)物質(zhì)消化率的關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證了通過體外產(chǎn)氣試驗(yàn)證明飼草料營養(yǎng)價值的可行性。本研究針對飼料中雜粕替代大豆粕的現(xiàn)實(shí)問題，通過體外產(chǎn)氣法評定了不同比例的菜籽粕、棉籽粕及大豆粕等蛋白飼料原料間的組合效應(yīng)，提出雜粕替代大豆粕的適宜比例，為進(jìn)一步開展的飼料大豆粕減量提供理論依據(jù)，減緩畜牧養(yǎng)殖成本及壓力。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料 精料飼料原料為玉米、大豆粕、麩皮、菜籽粕、棉籽粕和干酒糟及其可溶物（DDGS），混以10%預(yù)混料；粗飼料原料為苜蓿和全株玉米青貯。所有飼料原料均購自內(nèi)蒙古富川飼料科技股份有限公司，10%預(yù)混料購自北京精準(zhǔn)動物營養(yǎng)研究中心有限公司。

1.2 試驗(yàn)日糧 本試驗(yàn)將精料和粗料按各自原料比例配制好后，再以精粗比為60：40混合配制成7種不同配方組合的飼糧，試驗(yàn)飼糧組成及原料營養(yǎng)水平見表1和表2。

表1 試驗(yàn)飼糧組成（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表2 飼糧原料營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）%

1.3 試驗(yàn)動物及樣品的采集 本試驗(yàn)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口中試基地開展。瘤胃液取自3頭體重相近、健康無病且裝有永久性瘺管的荷斯坦干奶牛，試驗(yàn)期3 d，每天飼喂全混合飼糧（TMR）兩次（07：00、16：00），自由采食和飲水。于晨飼前1 h通過瘤胃瘺管采集瘤胃內(nèi)容物，經(jīng)4層紗布過濾至已預(yù)熱的39℃保溫瓶內(nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用于后續(xù)體外發(fā)酵。TMR組成及營養(yǎng)水平見表3。

表3 TMR組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4 體外發(fā)酵 體外發(fā)酵采用DSHZ－300A水域恒溫振蕩器裝置，稱取約0.200 g組合飼糧樣品于已涂抹凡士林的玻璃注射器內(nèi)管中進(jìn)行體外產(chǎn)氣試驗(yàn)，每樣品6個重復(fù)，每重復(fù)6支，并設(shè)置3支空白管。采用Menke法（1998）配制人工瘤胃液，并將人工瘤胃液與瘤胃液按體積比2：1混合，作為培養(yǎng)液。通入二氧化碳（CO2）排除空氣，同時用分液器向培養(yǎng)管分裝30.00 mL培養(yǎng)液，排除氣泡，放置39℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并開始計(jì)時。當(dāng)培養(yǎng)至0、2、4、8、12、16、24、32、36、40、48、56、64 h及72 h時間點(diǎn)時，取培養(yǎng)管快速讀取活塞所處的刻度值并記錄。培養(yǎng)24 h后，每組各重復(fù)快速取3支培養(yǎng)管放入冰水浴中，發(fā)酵停止。將培養(yǎng)管中發(fā)酵液排出至對應(yīng)編號的10.00 mL離心管中，用已校準(zhǔn)的pH計(jì)測定pH并記錄。發(fā)酵液經(jīng)低溫離心（4℃，8000g及15 min）后，取上清液冷凍保存，以備其他發(fā)酵參數(shù)［氨態(tài)氮（NH3-N）和微生物蛋白（MCP）產(chǎn)量］測定，每組各重復(fù)剩余的3支培養(yǎng)管至72 h時終止培養(yǎng)。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 常規(guī)營養(yǎng)成分 測定的常規(guī)營養(yǎng)成分包括：干物質(zhì)（DM），將粉碎風(fēng)干后的樣品至于105℃烘箱中烘干3 h后測定；粗灰分（Ash），將樣品置于馬弗爐內(nèi)550℃灼燒8 h后測定；粗蛋白質(zhì)（CP），采用FOSS DumatecTM-8000定氮儀測定；粗脂肪（EE），采用ANKOM-XT15i全自動脂肪分析儀測定；中性洗滌纖維（NDF）及酸性洗滌纖維（ADF），采用ANKOM-2000i全自動纖維分析儀測定；鈣（Ca）和磷（P），采用FOSS NIRS DS-2500近紅外分析儀測定。

1.5.2 體外累計(jì)凈產(chǎn)氣量的計(jì)算 凈產(chǎn)氣量的計(jì)算公式如下：

凈產(chǎn)氣量=某一時間段產(chǎn)氣量-對應(yīng)時間段內(nèi)3支空白管的平均產(chǎn)氣量。

1.5.3 體外產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)計(jì)算 記錄底物在不同 時 間 點(diǎn)（0、2、4、8、12、16、24、32、36、40、48、56、64 h及72 h）的產(chǎn)氣量，產(chǎn)氣模型計(jì)算公式：Y=B（1-e-ct），式中：Y、B及c分別為t時間點(diǎn)0.200 g組合飼糧樣本累積產(chǎn)氣量、理論最大產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣速度。

1.5.4 發(fā)酵液pH 采用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)的德圖Testo 206 pH計(jì)測定體外發(fā)酵液的pH。

1.5.5 發(fā)酵液NH3-N的測定 應(yīng)用屯妮薩（2012）的方法用堿性次氯酸鈉-苯酚分光光度法測定發(fā)酵液中的NH3-N濃度。

1.5.6 微生物蛋白產(chǎn)量的測定 MCP產(chǎn)量的測定采用嘌呤法，利用酵母RNA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用分光光度計(jì)測定其吸光度值，計(jì)算微生物蛋白質(zhì)量濃度：

微生物蛋白氮=RNA測定值×RNA含氮量/細(xì)菌中RNA含氮量×稀釋倍數(shù)；

微生物蛋白產(chǎn)量=微生物蛋白氮×6.25。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有數(shù)據(jù)先采用Excel 2010進(jìn)行初步整理得到凈產(chǎn)氣量，使用SAS 9.2處理軟件NLIN（Nonlinear regression）程序計(jì)算B和c等發(fā)酵參數(shù)，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）程序進(jìn)行分析。差異顯著性用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 體外產(chǎn)氣量 從表4可見，0～72 h各時間點(diǎn)的產(chǎn)氣量總體呈遞增趨勢，但48～72 h時增速相對較慢，組合5除2 h和4 h外，其他各時間點(diǎn)的累計(jì)產(chǎn)氣量均高于其他組（P＜0.05），2 h時產(chǎn)氣量最高的為組合1，為17.50 mL，4 h時產(chǎn)氣量最高的為組合4，為25.66 mL。組合6各時間點(diǎn)的累計(jì)產(chǎn)氣量均低于其他組（P＜0.05），0～72 h各組合的累積產(chǎn)氣量最大的是組合5，為70.67 mL（P＜0.05），最小的是組合6，為34.83 mL（P＜0.05），其他組合的產(chǎn)氣量從多到少依次為組合4＞組合7＞組合2＞組合1＞組合3，產(chǎn)氣量分別為66.67、64.17、63.03、48.17 mL和40.83 mL。

表4 體外發(fā)酵累計(jì)產(chǎn)氣量mL

2.2 產(chǎn)氣曲線 從圖1可以看出，不同精粗料組合在各時間點(diǎn)產(chǎn)氣量的動態(tài)變化，均呈產(chǎn)氣加速度由慢到快，再到增速趨于0逐漸呈平緩的趨勢。組合5較其他組合上升速度快之后趨于緩慢；其他組合于0～4 h產(chǎn)氣量上升緩慢，4～48 h的體外產(chǎn)氣量上升較快，之后趨于平緩。組合5產(chǎn)氣速度最快且產(chǎn)量最大，其他組合的體外產(chǎn)氣均有較長的延滯期。組合6的總產(chǎn)氣量最少。

圖1 體外產(chǎn)氣曲線

2.3 體外產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù) 由表5可見，底物的產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)與體外產(chǎn)氣曲線相對應(yīng)，各組的理論產(chǎn)氣量與實(shí)際產(chǎn)氣量相接近，組合5的理論產(chǎn)氣量最大，為67.583 mL，其次是組合4、組合7和組合2，分別為63.950、62.810 mL和61.633 mL，四者差異不顯著（P＞0.05）；但顯著大于其他飼糧樣品的理論產(chǎn)氣量（P＜0.05），組合6的理論產(chǎn)氣量最小，為39.013 mL（P＞0.05）；體外產(chǎn)氣速度最快4個組合分別為組合5＞組合4＞組合2＞組合3，分別為0.105、0.103、0.093、0.092 mL/h，顯著高于組合1和組合6（P＜0.05），組合6產(chǎn)氣速度最慢，為0.053 mL/h（P＜0.05）。

表5 體外產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)

2.4 24 h發(fā)酵液發(fā)酵參數(shù) 由表6可見，24 h發(fā)酵液的pH為6.32～6.48，最高的4個組合依次為組合1＞組合7＞組合2＞組合6，四者差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他組合（P＜0.05）；24 h發(fā)酵液的NH3-N濃度為19.11～33.17 mg/100 mL，組合3的發(fā)酵液NH3-N濃度為33.17 mg/100 mL，顯著高于其他各組（P＜0.05），組合6最低，為19.11 mg/100 mL；各組24 h發(fā)酵液的MCP產(chǎn)量最高的為組合2，為1.04 mg/100 mL，組合6發(fā)酵液的MCP產(chǎn)量顯著低于其他組合，為0.88 mg/100 mL（P＜0.05）。

表6 24 h發(fā)酵液發(fā)酵參數(shù)

3 討論

3.1 體外產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣曲線 體外發(fā)酵產(chǎn)氣的來源主要是通過發(fā)酵液中的瘤胃細(xì)菌等微生物與底物（如碳水化合物）發(fā)酵產(chǎn)生的CO2、CH4等氣體，體外產(chǎn)氣量的高低不僅反映了飼草料的營養(yǎng)價值，同時也反映了微生物的活力及對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率（金恩望等，2012）。從體外產(chǎn)氣曲線可看出，本試驗(yàn)中各組合飼糧的體外產(chǎn)期量均經(jīng)歷了增加速度由慢到快，再到增速趨于0逐漸呈平緩的趨勢，這與李文娟等（2016）對5種甘蔗副產(chǎn)物所測定的體外產(chǎn)氣趨勢相一致。其主要原因可能是發(fā)酵初期微生物主要與飼草料植物細(xì)胞的細(xì)胞壁發(fā)生反應(yīng)，而細(xì)胞壁中的糖類等碳水化合物含量較少且分解速度較慢，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣速度較慢，后期與含糖量較高的細(xì)胞液進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng)從而使得產(chǎn)氣量提升加快（趙慶新和袁生，2007）。孟梅娟（2015）通過研究不同非常規(guī)飼料資源組合的體外瘤胃體外發(fā)酵特性發(fā)現(xiàn)，各組的產(chǎn)氣量與其有機(jī)物的含量呈正相關(guān)，本研究的結(jié)果與其基本一致。周玲等（2017）通過體外產(chǎn)氣法評定空心菜、木薯?xiàng)U等6種飼草料的營養(yǎng)價值發(fā)現(xiàn)，各草料的產(chǎn)氣量與其消化率及營養(yǎng)價值等呈正相關(guān)，產(chǎn)氣量越高的草料其相對飼用價值越高，而本試驗(yàn)在保證飼糧精粗比為60：40的情況下，產(chǎn)氣量最高的飼糧組合為玉米∶麩皮∶棉籽粕∶菜籽粕∶DDGS=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株玉米青貯=10∶30，這說明飼糧中使用適量的棉籽粕、菜籽粕及DDGS代替的大豆粕后仍具有一定的飼喂價值。

3.2 體外產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù) 本試驗(yàn)中所有組合飼料樣本的72 h實(shí)際產(chǎn)氣量與理論產(chǎn)氣量基本一致。Nsahlai等（1994）通過體外產(chǎn)氣法評定田菁的營養(yǎng)價值發(fā)現(xiàn)，其理論產(chǎn)氣量與中性洗滌纖維、半纖維素及木質(zhì)素的含量呈負(fù)相關(guān)，其原因是纖維、木質(zhì)素等結(jié)構(gòu)較為致密，會影響糖類等營養(yǎng)物質(zhì)的釋放，本試驗(yàn)的研究結(jié)果與其基本一致。湯少勛等（2006）將體外產(chǎn)氣法進(jìn)行一定的改進(jìn)后，利用其評定了10種牧草的體外產(chǎn)氣特性發(fā)現(xiàn)，各牧草的累計(jì)產(chǎn)氣量及理論產(chǎn)氣量與牧草中CP的含量均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，本試驗(yàn)中玉米∶麩皮∶大豆粕∶棉籽粕∶菜籽粕=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株玉米青貯=10∶30組合飼糧的累計(jì)產(chǎn)氣量及理論產(chǎn)氣量均為最低，且該組合中的大豆粕、菜籽粕及棉籽粕的CP含量均高于DDGS，飼糧整體CP含量也較高，驗(yàn)證了此結(jié)論。

3.3 體外發(fā)酵參數(shù) 酸度是瘤胃發(fā)酵參數(shù)的重要指標(biāo)之一，與動物采食飼糧的類型、瘤胃的健康狀況及其中VFA、NH3-H的濃度等均有一定關(guān)系。瘤胃中的pH對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起到至關(guān)重要的作用，pH過低會造成動物瘤胃酸中毒，過高則會降低瘤胃微生物的活性，影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化及吸收（尹夢潔，2021）。Rodrigues等（2020）研究表明，瘤胃微生物最適宜的pH為6.1～7.2，而本試驗(yàn)各組和飼糧的體外發(fā)酵pH均在6.3～6.5，說明各組合飼糧進(jìn)入瘤胃后均未對瘤胃內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生不良影響。同時有研究表明，反芻動物瘤胃中的pH與其采食飼糧的纖維含量呈一定正相關(guān)關(guān)系（王海榮等，2008），這與本試驗(yàn)的結(jié)果有一定差異，本試驗(yàn)中pH最高的飼糧組合為不含雜粕的單一大豆粕組，且大豆粕的纖維含量要低于菜籽粕及棉籽粕，但瘤胃中的pH受到試驗(yàn)動物、飼糧、飲水及瘤胃中的VFA、NH3-H濃度等多種因素的共同影響，對此有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

NH3-H濃度是反映反芻動物瘤胃中氮代謝程度的重要指標(biāo)，瘤胃微生物合成蛋白質(zhì)的主要氮源就是NH3-H（焦光月等，2015），但NH3-H濃度若過高不僅是對養(yǎng)分的一種浪費(fèi)，同時也會造成瘤胃內(nèi)環(huán)境的pH偏高，不利于瘤胃微生物的生長及繁殖。研究表明瘤胃中NH3-H的濃度范圍為7～34 mg/dL（Illius，1989），本試驗(yàn)中各組合飼糧體外瘤胃發(fā)酵液的NH3-H濃度均在此范圍內(nèi)。李金輝等（2022）研究表明，使用一定比例的棉籽粕替代飼糧中的大豆粕進(jìn)行體外發(fā)酵后，發(fā)酵液的NH3-H濃度有所升高，而本試驗(yàn)中單一大豆粕組飼糧相比于添加棉籽粕飼糧的NH3-H濃度偏低，與該研究結(jié)果相一致，這可能與棉籽粕中的棉酚等物質(zhì)限制了瘤胃微生物對NH3-H的降解及利用有一定關(guān)系。MCP是反芻動物機(jī)體每日消耗蛋白質(zhì)的重要供應(yīng)源，其質(zhì)量濃度可以反映瘤胃中NH3-H的分解及利用程度，同時也一定程度的反映了瘤胃中細(xì)菌等微生物的種群多樣性及大?。ㄓ阱\皓等，2018）。本試驗(yàn)在保證精粗比為60∶40的情況下，除玉米∶麩皮∶大豆粕∶棉籽粕∶菜籽粕=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株青貯玉米=10∶30該組合飼糧體外瘤胃發(fā)酵液的MCP質(zhì)量濃度顯著低于其他各組外，其余各組間差異均不顯著，說明該組的體外瘤胃發(fā)酵液中的微生物種群較小，其他無明顯差異。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，不同組合比例的粗料代替豆粕體外發(fā)酵72 h時，玉米∶麩皮∶棉籽粕∶菜籽粕∶DDGS=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株青貯玉米=10∶30時組合效果最佳，可有效提高其營養(yǎng)成分的互補(bǔ)、瘤胃發(fā)酵水平，但其具體營養(yǎng)價值還需要通過動物試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。