陳華宇 許海辰 張 宇

(齊魯醫(yī)藥學(xué)院，淄博 255000）

牙列缺損和牙列缺失是我國(guó)老年人主要口腔問(wèn)題之一[1]，種植修復(fù)是目前最理想的修復(fù)方式，為滿足種植術(shù)對(duì)牙槽骨骨量的要求，可在拔牙位點(diǎn)植入骨替代材料以恢復(fù)牙槽嵴高度。天然牙經(jīng)去除牙釉質(zhì)及軟組織，對(duì)剩余牙本質(zhì)進(jìn)行脫礦處理，消除部分礦物成分以及免疫原性物質(zhì)，磨碎后得到脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)材料，是一種同時(shí)具備骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)、骨生成能力的材料，大量實(shí)驗(yàn)研究表明其具有良好的成骨性能[2]，但對(duì)于其制備過(guò)程中不同脫礦方法和脫礦程度及顆粒大小對(duì)其性能影響的相關(guān)研究尚少。家兔與人的牙成分具有相似性[3]，由于兔牙易于獲取，故本實(shí)驗(yàn)采用兔牙代替人牙進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)探究，為牙本質(zhì)基質(zhì)材料后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 主要器材和材料

常規(guī)手術(shù)器械（手術(shù)刀、艾麗絲鉗、拔牙鉗等）；OCA 25 靜態(tài)接觸角測(cè)量?jī)x（德國(guó)奧德利諾公司）；掃描電鏡（日立SU8020）；傅里葉變換紅外光譜儀（島津IRTracer-100）；ELS5000 電子能譜儀（美國(guó)LK）；研磨器（安薩ALA）；生理鹽水；HCL溶液；蒸餾水；新西蘭家兔。

1.2 脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)材料制備

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理（去除表面軟組織，拔除牙髓，以口腔科高速手機(jī)磨除牙釉質(zhì)）的新西蘭家兔上頜門(mén)牙30 顆隨機(jī)分為A/B 兩組，每組15 顆；A組恒溫20 ℃環(huán)境下置于盛有100 ml HCL 溶液（濃度1 mol/L）的廣口瓶中脫礦45 min，經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗后置于陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干24 h，用骨粉研磨器粉碎牙齒，選擇不同孔徑分樣篩反復(fù)篩樣4-5 次，制得3 種不同粒徑（400 μm 以下、400-800 μm、800-1200 μm） 的DDM 顆粒。B 組平均分成3 份，恒溫20℃環(huán)境下分別置于盛有100 mL 不同濃度（1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L）HCL 溶液的廣口瓶中脫礦45 min，經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗后置于陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干24 h，骨粉研磨器粉碎牙齒，選擇粒徑400 μm 分樣篩反復(fù)篩樣4-5 次，制得粒徑400 μm 以下的自體牙本質(zhì)顆粒。

1.3 DDM 顆粒表面掃描電鏡觀察

將A 組3 種不同粒徑的DDM 顆粒分別進(jìn)行超聲清洗；使用2%戊二醛固定；50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水(無(wú)水乙醇脫水兩次)，每次10 min;臨界點(diǎn)干燥；噴金；掃描電鏡（SEM）進(jìn)行微觀形貌觀察，分析比較其差異。

1.4 DDM 顆粒靜態(tài)接觸角檢測(cè)

分別將2 μL 去離子水滴在A 組3 種不同粒徑的DDM 顆粒表面，等待3 s 至液滴穩(wěn)定后進(jìn)行靜態(tài)接觸角檢測(cè)（測(cè)試環(huán)境：溫度24.8℃；濕度68%），比較其親水性差異。

1.5 DDM 顆粒衰減全反射紅外光譜檢測(cè)

將B 組采用3 種不同濃度HCL 溶液脫礦制得的DDM 顆粒分別置于紅外光譜儀上，以4cm-1分辨率進(jìn)行衰減全反射紅外光譜檢測(cè)，掃描波長(zhǎng)399-4000 cm-1，采樣32 次，采用OMNIC 7 軟件去除水譜，矯正基線，分析其成分差異。

1.6 DDM 顆粒鈣元素測(cè)定

對(duì)B 組采用3 種不同濃度HCL 溶液脫礦制得的DDM 顆粒分別用電子能譜儀進(jìn)行鈣元素分布（wt%）測(cè)定，為保證實(shí)驗(yàn)一致性，取每組樣本顆粒橫斷面邊緣點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試，每組重復(fù)3 次，取其平均值，觀察各組鈣含量變化情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察結(jié)果

SEM 觀察A 組3 種不同粒徑牙本質(zhì)顆粒，隨機(jī)掃描結(jié)果顯示：粒徑400 μm 以下的DDM 顆粒呈破碎片狀，牙本質(zhì)小管暴露充分，間隙較多且形態(tài)不規(guī)則（圖1A）；粒徑400-800 μm 的DDM顆粒斷面粗糙，可見(jiàn)牙本質(zhì)小管，間隙較少，顆粒形態(tài)較為規(guī)整（圖1B）；粒徑800-1200 μm 的DDM 顆粒表面光滑連續(xù)，僅有少量破碎間隙存在于顆粒表面（圖1C）。

圖1 掃描電鏡結(jié)果（×1000）

2.2 靜態(tài)接觸角檢測(cè)結(jié)果

對(duì)A 組3 種不同粒徑的DDM 顆粒進(jìn)行靜態(tài)接觸角檢測(cè)以評(píng)價(jià)其親水性，結(jié)果顯示粒徑400 μm 以下、400-800 μm、800-1200 μm 的DDM顆粒靜態(tài)接觸角分別為6.0°（圖2A）、67.0°（圖2B）和96.7°（圖2C），提示DDM 顆粒的親水性隨粒徑減小而增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)果提示：粒徑400 μm 以下的DDM 顆粒植入患者創(chuàng)口后有利于血液的鋪展?jié)櫇?，為血液機(jī)化成骨提供前期保障。

圖2 靜態(tài)接觸角檢測(cè)結(jié)果

2.3 衰減全反射紅外光譜檢測(cè)結(jié)果

采用不同濃度HCL 脫礦制得的B 組3 種DDM顆粒的紅外光譜圖顯示：所有DDM 顆粒均存在（1020±20） cm-1及566 cm-1兩個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰，分別為P-o 伸縮振動(dòng)峰及P-o 變形振動(dòng)峰，表明樣品含有大量PO42-陰離子基團(tuán)，與羥基磷灰石的紅外光譜相符，其吸收度隨脫礦所采用的HCL 濃度增加而呈現(xiàn)梯度式下降（P＜0.05），表明隨著HCL濃度增加，DDM 顆粒中羥基磷灰石的含量降低。此外，3 種DDM 顆粒在3300cm-1附近均出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)烈而寬泛的吸收峰，對(duì)應(yīng)膠原中的＞NH 和-OH，可見(jiàn)其吸收度差異不大（P＞0.05），提示在一定范圍內(nèi)采用不同濃度HCL 脫礦對(duì)DDM 顆粒中膠原的含量影響較?。▓D3）。

圖3 不同濃度的HCL 脫礦制得的DDM 顆粒其紅外光譜圖檢測(cè)結(jié)果

2.4 電子能譜儀測(cè)定鈣元素分布結(jié)果

對(duì)B 組的3 種牙本質(zhì)顆粒分別進(jìn)行鈣元素質(zhì)量分布（wt%）測(cè)定，結(jié)果顯示：在一定范圍內(nèi)隨著脫礦程度增加，樣品鈣含量呈現(xiàn)梯度式降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 B 組DDM 顆粒鈣元素分布測(cè)定（wt%）

3 討論

造成中老年人牙列缺損和牙列缺失的原因眾多，牙齒缺失后破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)、咀嚼物理刺激的缺失、血液供應(yīng)的減少乃至中斷等因素造成了牙槽骨的吸收[4]，骨量不足對(duì)種植修復(fù)造成了相當(dāng)程度的困難。臨床上可通過(guò)植入牙本質(zhì)基質(zhì)骨替代材料以達(dá)到種植術(shù)區(qū)骨增量的目的，牙本質(zhì)基質(zhì)各組分決定了其同時(shí)具備骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)和骨生成能力。其中，羥基磷灰石具有與人骨相似的鈣磷比以及天然孔隙結(jié)構(gòu)，能將游離的磷酸鹽與鈣附著于骨[5]，此外，羥基磷灰石能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，具備良好的骨誘導(dǎo)活性[6]。Ⅰ型膠原能夠?yàn)樾鹿巧膳c細(xì)胞附著提供載體，可與羥基磷灰石晶體一同構(gòu)成支架，以促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移。除此之外，牙本質(zhì)中還含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）以及胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）[2]。為提升牙本質(zhì)基質(zhì)材料的成骨性能，通常會(huì)對(duì)其進(jìn)行煅燒、冷凍、煮沸、脫礦和化學(xué)處理等[7]。目前關(guān)于脫礦牙本質(zhì)顆粒材料的相關(guān)研究眾多，但其材料制備方法并不統(tǒng)一，關(guān)于脫礦處理程度以及顆粒粒徑對(duì)脫礦牙本質(zhì)顆粒性能的影響并無(wú)定論，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究尚少，鑒于此，設(shè)計(jì)了本次研究。

SEM 觀察不同粒徑DDM 顆粒的表面結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：粒徑400 μm 以下的DDM 顆粒呈破碎片狀，其牙本質(zhì)小管在本實(shí)驗(yàn)制備的3 種不同粒徑顆粒中暴露最充分，間隙較多且形態(tài)不規(guī)則，此種結(jié)構(gòu)可提供更多的蛋白質(zhì)釋放通道，利于牙本質(zhì)中所含有的誘導(dǎo)成骨活性成分釋放[8]。此外，粒徑越小的牙本質(zhì)顆粒其空隙率越大，具備更大的比表面積，利于肉芽組織的長(zhǎng)入完成機(jī)化過(guò)程，加速單骨的形成，也利于牙本質(zhì)顆粒在植入位點(diǎn)降解及新骨的長(zhǎng)入，具備更好的骨傳導(dǎo)性能[9]。良好的親水性使得體液在植入材料表面擴(kuò)散，促進(jìn)其周?chē)?xì)胞內(nèi)環(huán)境形成，更利于成骨細(xì)胞黏附以及增殖分化，對(duì)于牙本質(zhì)顆粒的生物相容性至關(guān)重要[10]。本研究通過(guò)測(cè)量不同粒徑脫礦牙本質(zhì)顆粒的靜態(tài)接觸角以評(píng)價(jià)其親水性差異，結(jié)果顯示：牙本質(zhì)顆粒隨粒徑減小，親水性逐漸增強(qiáng)，在粒徑400 μm 以下的牙本質(zhì)顆粒中靜態(tài)液滴幾乎完全鋪展開(kāi)，其靜態(tài)接觸角＜6°，展現(xiàn)出優(yōu)異的親水性。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在一定范圍內(nèi)粒徑越小的DDM 顆?；蛟S具備更優(yōu)的成骨性能和生物相容性。

現(xiàn)有研究顯示，羥基磷灰石晶體會(huì)阻礙牙本質(zhì)材料中生長(zhǎng)因子的釋放，導(dǎo)致其骨誘導(dǎo)性能降低或延遲表達(dá)，脫礦處理可去除部分羥基磷灰石晶體并加大牙本質(zhì)小管的管徑，利于生長(zhǎng)因子釋放，提升成骨性能，并消除免疫原性[11-12]。過(guò)度脫礦導(dǎo)致羥基磷灰石晶體過(guò)少也會(huì)導(dǎo)致材料的機(jī)械性能下降，不利于持續(xù)穩(wěn)定的成骨[13-14]。因此在對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行脫礦處理時(shí)，為達(dá)到材料的最佳成骨性能，脫礦程度的控制顯得尤為重要。衰減全反射紅外光譜檢測(cè)3 種不同脫礦程度的牙本質(zhì)基質(zhì)材料，結(jié)果顯示其特征峰與標(biāo)準(zhǔn)羥基磷灰石特征峰以及膠原特征峰基本相符，表明其主要成分為羥基磷灰石以及膠原。在一定范圍內(nèi)隨著脫礦程度的增加，羥基磷灰石的特征峰吸收度越來(lái)越低，而膠原的特征吸收峰變化較小，表明在一定范圍內(nèi)隨著脫礦程度的增加，脫礦牙本質(zhì)顆粒內(nèi)羥基磷灰石的含量越來(lái)越低，而膠原成分所受影響較小。鈣元素測(cè)定實(shí)驗(yàn)也同樣支持這一結(jié)果。

脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)材料成骨性能的影響因素是多方面的，脫礦處理利于生長(zhǎng)因子釋放的同時(shí)也會(huì)破壞骨誘導(dǎo)活性成分，兩者存在此消彼長(zhǎng)的矛盾，對(duì)于何種脫礦程度能更利于生長(zhǎng)因子釋放的同時(shí)盡可能少的影響其骨誘導(dǎo)活性，尚無(wú)定論。此外，本研究?jī)H限于對(duì)脫礦自體牙本質(zhì)顆粒性能的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，其生物體內(nèi)的成骨性能以及遠(yuǎn)期效果尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：粒徑較小的DDM 材料牙本質(zhì)小管暴露更充分，且具有更優(yōu)的親水性，脫礦程度的增加會(huì)降低DDM 材料中無(wú)機(jī)物的含量，但對(duì)膠原含量影響較小。