趙軼峰，李明霞，張 超，胡小敏，王 雄，趙鐵軍

胃癌是世界范圍內(nèi)一種可致命的癌癥，具有復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移快的特點(diǎn)[1]。盡管胃癌的診斷和治療取得一定進(jìn)展，但是臨床預(yù)后依然很差，5年生存率僅為21.35%[2]。因此，深入了解胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制可以為改善其預(yù)后提供有價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。微小核糖核酸(miRNA)是一類由19～25個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，能夠參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化等許多生物過程[3]。最近研究表明，位于14號(hào)染色體上的抑癌基因miR-433-3p通過靶向生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖和侵襲[4]。然而，正如大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于miR-433-3p的研究?jī)H局限于靶基因的鑒定及對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響方面，而關(guān)于其自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究卻很少。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)第2類POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1(POU2F1)與miR-433-3p啟動(dòng)子區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，POU2F1作為POU同源域家族的一員，已有研究顯示其在肝癌組織中高表達(dá)，POU2F1過表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞增殖、集落形成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲，而沉默POU2F1表達(dá)則抑制了這些惡性表型[5]。但POU2F1調(diào)控miR-433-3p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移的影響鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探索POU2F1對(duì)miR-433-3p表達(dá)的調(diào)控作用及對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移的影響，以期進(jìn)一步闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1胃癌組織樣本及細(xì)胞：2021年6月—2022年4月在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院共收集45例胃癌組織及與之匹配的癌旁組織(距癌組織4 cm處)。其中男22例，女23例；年齡(57.25±3.45)歲；Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期21例。將所有臨床組織標(biāo)本在液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱中。所有臨床組織標(biāo)本的組織學(xué)診斷至少由2名病理專家證實(shí)。胃癌患者在手術(shù)或活檢前均未接受任何抗腫瘤治療。所有患者在本研究開始前簽署本研究知情同意書。人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和人胃癌細(xì)胞株BGC-823、MKN-28、SGC-7901均購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)分別為XY19167、XY19325、XY26331、XY23115。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑與儀器：POU2F1小干擾RNA(siRNA)、POU2F1 siRNA陰性對(duì)照、miR-433-3p siRNA、miR-433-3p siRNA陰性對(duì)照及miR-433-3p、POU2F1、U6引物均由上海基屹生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)KE1902)、Trizol試劑(批號(hào)KE13127)、RIPA裂解液(批號(hào)KE04361)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(批號(hào)KE90117)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，批號(hào)KE20035)均購(gòu)自上海創(chuàng)凌生物科技有限公司；胎牛血清(FBS，批號(hào)90170)、羊抗鼠二抗(批號(hào)33175)、化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)40219)均購(gòu)自北京威瑞谷生物技術(shù)有限公司；鼠源POU2F1(批號(hào)1076R)、GAPDH單克隆抗體(批號(hào)1013R)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(批號(hào)4159K)均購(gòu)自常州福生生物技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)Galaxy 48)、酶標(biāo)儀(型號(hào)Sunrise)、凝膠成像儀(型號(hào)ChampChemi 580)均購(gòu)自北京博勱行儀器有限公司；qRT-PCR儀(型號(hào)CG-05)、Transwell小室(型號(hào)PIEP12R48)均購(gòu)自北京明陽科華科技有限責(zé)任公司。

1.2研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1及人胃癌細(xì)胞株BGC-823、MKN-28、SGC-7901在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有10%FBS、鏈霉素100 U/ml和青霉素100 U/ml，置于含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)胃癌組織、癌旁組織和GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細(xì)胞中miR-433-3p、POU2F1 mRNA表達(dá)：將胃癌組織和癌旁組織勻漿，使用Trizol試劑從胃癌組織、癌旁組織和GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細(xì)胞中提取總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度后，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在PCR系統(tǒng)上使用TransStart? Green qPCR SuperMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-433-3p上游引物：5′-AGAAGTACGGTGAGCCTGTC-3′，miR-433-3p下游引物：5′-GCTCTCACTCTGTCACCCAG-3′；POU2F1上游引物：5′-ATCTGGACTACGCTAGCTGAC-3′，POU2F1下游引物：5′-CGTAGTCCGATCAAGCTAGCA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCACACA-3′，U6下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。以U6作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法分析miR-433-3p、POU2F1 mRNA的相對(duì)表達(dá)。每種細(xì)胞設(shè)置6個(gè)重復(fù)組。

1.2.3蛋白印跡法檢測(cè)胃癌組織、癌旁組織和GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細(xì)胞中POU2F1蛋白表達(dá)：將胃癌組織和癌旁組織勻漿，利用RIPA裂解液提取胃癌組織、癌旁組織和GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細(xì)胞中蛋白質(zhì)，定量蛋白濃度后，通過電泳分離等量蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉膜2 h，用TBST洗膜3次，再將膜分別與鼠源POU2F1(1︰2000)、GAPDH(1︰3000)一抗在4 ℃下孵育過夜。第2日用TBST洗膜3次后，將膜與羊抗鼠二抗(1︰2000)于室溫下孵育3 h，化學(xué)發(fā)光試劑盒可視化蛋白，采用Image軟件對(duì)灰度值進(jìn)行量化分析(內(nèi)參為GAPDH)。每種細(xì)胞設(shè)置6個(gè)重復(fù)組。

1.2.4BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為空白組(細(xì)胞未轉(zhuǎn)染)、POU2F1 siRNA組(POU2F1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、POU2F1 siRNA-NC組(POU2F1 siRNA陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、miR-433-3p siRNA組(miR-433-3p siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、miR-433-3p siRNA-NC組(miR-433-3p siRNA陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA-NC組(miR-433-3p siRNA和POU2F1 siRNA陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA組(miR-433-3p siRNA和POU2F1 siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.2.5MTT法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞增殖能力：將“1.2.4”中轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的各組BGC-823細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板上，向每孔中加入MTT 10 μl，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，然后向每孔中加入二甲基亞砜150 μl，使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，計(jì)算BGC-823細(xì)胞增殖率，增殖率=各轉(zhuǎn)染組OD值/空白組OD值×100%。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC-823細(xì)胞遷移能力：將“1.2.4”中轉(zhuǎn)染后的各組BGC-823細(xì)胞加入到無FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，取100 μl轉(zhuǎn)移至Transwell上室中，并使用600 μl含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基填充于Transwell下室中。48 h后，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.2.7qRT-PCR和蛋白印跡法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞中miR-433-3p、POU2F1 mRNA和蛋白表達(dá)：將“1.2.4”中轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的各組BGC-823細(xì)胞，按照“1.2.2”和“1.2.3”中的方法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞中miR-433-3p、POU2F1 mRNA和蛋白表達(dá)。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：使用TransmiR v2.0 database在線軟件預(yù)測(cè)POU2F1與miR-433-3p啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建miR-433-3p啟動(dòng)子區(qū)野生型(WT)和突變型(MUT)報(bào)告質(zhì)粒，標(biāo)記為miR-433-3p-WT、miR-433-3p-MUT。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將miR-433-3p-WT和miR-433-3p-MUT分別與POU2F1 siRNA陰性對(duì)照或POU2F1 siRNA共轉(zhuǎn)染于BGC-823細(xì)胞，分別記為：POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-WT組(POU2F1 siRNA陰性對(duì)照和miR-433-3p-WT共轉(zhuǎn)染)、POU2F1 siRNA+miR-433-3p-WT組(POU2F1 siRNA和miR-433-3p-WT共轉(zhuǎn)染)、POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-MUT組(POU2F1 siRNA陰性對(duì)照和miR-433-3p-MUT共轉(zhuǎn)染)、POU2F1 siRNA+miR-433-3p-MUT組(POU2F1 siRNA和miR-433-3p-MUT共轉(zhuǎn)染)。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)評(píng)估熒光素酶相對(duì)活性。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織、癌旁組織中miR-433-3p及POU2F1 mRNA、蛋白表達(dá)比較 與癌旁組織比較，胃癌組織miR-433-3p表達(dá)水平顯著降低，POU2F1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 胃癌組織、癌旁組織中miR-433-3p及POU2F1 mRNA、蛋白表達(dá)比較

2.2GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細(xì)胞中miR-433-3p及POU2F1 mRNA、蛋白表達(dá)比較 與GES-1細(xì)胞比較，BGC-823、MKN-28、SGC-7901細(xì)胞miR-433-3p表達(dá)水平均降低，POU2F1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)，其中BGC-823細(xì)胞miR-433-3p表達(dá)水平最低，POU2F1 mRNA和蛋白表達(dá)水平最高。見表2。因此選用BGC-823細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細(xì)胞中miR-433-3p及POU2F1 mRNA、蛋白表達(dá)比較

2.3沉默POU2F1對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖、遷移及miR-433-3p、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達(dá)的影響 與空白組和POU2F1 siRNA-NC組比較，POU2F1 siRNA組BGC-823細(xì)胞增殖率、遷移細(xì)胞數(shù)目、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達(dá)水平顯著降低，miR-433-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；空白組和POU2F1 siRNA-NC組上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 沉默POU2F1對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖、遷移及miR-433-3p、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達(dá)的影響

2.4沉默POU2F1逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-433-3p表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖、遷移及miR-433-3p、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達(dá)的影響 與空白組和miR-433-3p siRNA-NC組比較，miR-433-3p siRNA組和miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA-NC組BGC-823細(xì)胞增殖率、遷移細(xì)胞數(shù)目顯著升高(P<0.05)，miR-433-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，POU2F1 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與miR-433-3p siRNA組和miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA-NC組比較，miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA組BGC-823細(xì)胞增殖率、遷移細(xì)胞數(shù)目、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達(dá)水平顯著降低，miR-433-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 沉默POU2F1逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-433-3p表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖、遷移及miR-433-3p、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達(dá)的影響

2.5生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-433-3p上游轉(zhuǎn)錄因子 使用TransmiR v2.0 database預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)POU2F1與miR-433-3p啟動(dòng)子區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)位于14號(hào)染色體上的100881247～100881262區(qū)域，結(jié)合序列為GGGAGTGCAGAGCAT。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-WT組、POU2F1 siRNA+miR-433-3p-WT組、POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-MUT組及POU2F1 siRNA+miR-433-3p-MUT組熒光素酶相對(duì)活性分別為1.09±0.13、2.06±0.19、1.06±0.12、1.04±0.11，與POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-WT組比較，POU2F1 siRNA+miR-433-3p-WT組熒光素酶相對(duì)活性顯著升高(P<0.05)；POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-MUT組和POU2F1 siRNA+miR-433-3p-MUT組熒光素酶相對(duì)活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

胃癌是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，也是全球第五大癌癥[6]。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，東亞地區(qū)胃癌發(fā)病率急劇升高，該地區(qū)男女發(fā)病率在全球范圍內(nèi)最高[7-8]。由于缺乏特異性生物學(xué)標(biāo)志物，大多數(shù)新診斷的胃癌患者在確診時(shí)已處于晚期[9-10]。因此，迫切需要進(jìn)一步研究胃癌的發(fā)病機(jī)制并確定與胃癌相關(guān)的特異性標(biāo)志物。

miRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[11-12]。李燕等[13]發(fā)現(xiàn)miR-433-3p在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)，miR-433-3p過表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。萬智雙等[14]表明miR-433-3p可通過下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶8表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H的遷移和侵襲。楊艷等[15]闡明下調(diào)miR-433-3p可促進(jìn)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。SUN等[16]報(bào)道m(xù)iR-433-3p通過靶向環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白來抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲及遷移。本研究結(jié)果顯示，miR-433-3p在胃癌組織和胃癌細(xì)胞BGC-823、MKN-28、SGC-7901中呈低表達(dá)狀態(tài)，且miR-433-3p在BGC-823細(xì)胞中的表達(dá)水平最低，因此本研究選擇BGC-823細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，抑制miR-433-3p表達(dá)可明顯促進(jìn)BGC-823細(xì)胞的增殖和遷移，提示miR-433-3p在胃癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用。但關(guān)于miR-433-3p上游的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，據(jù)報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子可正向或負(fù)向調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)[17]，因此本研究通過使用TransmiR v2.0 database預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子POU2F1與miR-433-3p啟動(dòng)子區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。

POU2F1也稱為八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1，由染色體1q24.1上的基因位點(diǎn)編碼。它是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期相關(guān)靶基因的表達(dá)[18]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，POU2F1通過脂肪非典型鈣黏蛋白1信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，可作為肝癌治療的靶點(diǎn)[19]。敲低POU2F1表達(dá)可導(dǎo)致頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲數(shù)目顯著減少[20]。POU2F1在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移侵襲、增殖及克隆形成等生物學(xué)功能[21]。POU2F1在胃癌患者中上調(diào)并且與較差的存活率顯著相關(guān)[22]。有研究報(bào)道POU2F1可與miR-4490的啟動(dòng)子序列互補(bǔ)結(jié)合調(diào)節(jié)miR-4490在胃癌中的表達(dá)[23]。但POU2F1與miR-433-3p在胃癌中的調(diào)控關(guān)系尚不十分清楚。本研究結(jié)果顯示，POU2F1 mRNA和蛋白在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)POU2F1作為轉(zhuǎn)錄因子，通過與miR-433-3p啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控miR-433-3p表達(dá)的作用；沉默POU2F1可抑制BGC-823細(xì)胞的增殖與遷移能力，促進(jìn)miR-433-3p表達(dá)，下調(diào)miR-433-3p表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖、遷移的影響。提示沉默POU2F1后，低表達(dá)的POU2F1可促進(jìn)miR-433-3p表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抑癌效應(yīng)。

綜上，POU2F1可與miR-433-3p啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，低表達(dá)的POU2F1可促進(jìn)miR-433-3p表達(dá)，使miR-433-3p表達(dá)升高，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖與遷移。