劉柏林, 趙紫微, 詹子悅, 戴雁羽,丁 剛, 謝繼安, 許相川, 孔洪濤

(1. 安徽省疾病預(yù)防控制中心, 安徽 合肥 230601; 2. 安徽啟威生物科技有限公司, 安徽 合肥 230000)

季銨鹽化合物(quaternary ammonium compounds, QACs)是一類由帶正電荷的季氨基和一個或兩個長烷基鏈組成的有機物[1],季銨鹽化合物作為消毒劑、抗菌劑和表面活性劑的活性成分,廣泛應(yīng)用于清潔與個人護(hù)理產(chǎn)品[1,2]、醫(yī)療衛(wèi)生[3]和食品工業(yè)領(lǐng)域[4],常見的季銨鹽化合物包括烷基二甲基芐基氯化銨類化合物(benzylalkyldimethyl ammonium compounds, BACs)、二癸基二甲基氯化銨類化合物(dialkyldimethyl ammonium compounds, DDACs)和烷基三甲基氯化銨類化合物(alkyltrimethyl ammonium compounds, ATMACs)[5]。美國允許這些常規(guī)季銨鹽化合物大規(guī)模生產(chǎn)和使用,我國GB/T 26369-2020《季銨鹽類消毒劑衛(wèi)生要求》中規(guī)定季銨鹽化合物的使用范圍包括物體與醫(yī)療器械表面、織物、外科手消毒、衛(wèi)生手消毒、皮膚與黏膜、食品加工設(shè)備與器皿的消毒[6]。研究表明,季銨鹽化合物可有效滅活包膜病毒[7,8], 2020年,美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)列出的430種可以殺滅新型冠狀病毒的消毒劑產(chǎn)品中,有216種含有季銨鹽活性成分[9]。因此,近年來大量的消毒劑被用于室內(nèi)外環(huán)境的消毒,以限制疾病的傳播[2]。此外,包括我國在內(nèi)的許多國家在冷鏈?zhǔn)称坊蛲獍b表面檢測到新冠病毒的核酸[10],因此冷鏈?zhǔn)称吩谏a(chǎn)經(jīng)營過程中需要進(jìn)行消毒工作。而季銨鹽類消毒劑可用于物體表面、低溫冷藏物體及冷凍物體表面的消毒，這使得季銨鹽類消毒劑在冷鏈?zhǔn)称分袕V泛應(yīng)用。

然而,季銨鹽類消毒劑的大規(guī)模生產(chǎn)和使用,會導(dǎo)致其殘留在環(huán)境中,地表水[11]、河流底泥[1,12,13]和土壤[14]均被報道檢出季銨鹽化合物,我國城市污水污泥中檢出ATMACs與BACs,其含量分別為0.38～293 μg/g與0.09～191 μg/g[15]。牛奶[16]、冷凍飲品[4]等食品中也檢出季銨鹽化合物。室內(nèi)粉塵中季銨鹽化合物含量達(dá)到了1.95～531 μg/g[17],人體血液中QACs含量大幅增加[5]?？梢?季銨鹽化合物殘留已通過飲食、空氣環(huán)境和皮膚吸收進(jìn)入人體。毒理學(xué)研究表明,季銨鹽化合物對水生生物具有較強的毒性[18],對生殖系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)有不良反應(yīng)[17]。長期暴露于季銨鹽,會引起哮喘病、皮膚過敏性反應(yīng)疾病[19,20],對人類身體健康產(chǎn)生風(fēng)險[21]。為此,歐洲食品安全局(EFSA)規(guī)定食品中季銨鹽化合物殘留限量為0.1 mg/kg[4],而我國還沒有制定食品中季銨鹽化合物殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,因此建立一種簡便快捷、靈敏、選擇性和準(zhǔn)確度高的檢測方法測定冷凍食品中季銨鹽化合物具有重要意義。

目前,針對季銨鹽化合物的檢測方法主要有離子色譜法[22]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[23]、高效液相色譜法(HPLC)[24-28]與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[4,29-31],這些方法滿足了消毒劑、食品等基質(zhì)中常規(guī)季銨鹽化合物的檢測要求。隨著對季銨鹽化合物殺菌效果的研究,新型季銨鹽化合物不斷被合成,并投入生產(chǎn)使用。2021年,Zhang等[32]合成了一種新型季銨鹽化合物2-甲基-1-十二烷基硫醇丙酸氯化膽堿(Ephemora),其具有與常規(guī)季銨鹽類似的結(jié)構(gòu)式,可以用作消毒劑的活性成分,且易降解、綠色環(huán)保，但目前缺少這類新型季銨鹽化合物的檢測方法。因超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)具有選擇性、靈敏度和分析效率高等優(yōu)勢,質(zhì)譜方法能夠提供待測物碎片離子信息,降低了假陽性率,成為季銨鹽化合物檢測分析的主要方法[31]。本研究在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上,優(yōu)化色譜與質(zhì)譜條件,改進(jìn)提取與凈化方法,降低基質(zhì)效應(yīng),以冷凍三文魚、雞肉為基質(zhì)樣品,采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量,建立了改進(jìn)QuEChERS法前處理樣品、UPLC-MS/MS快速定量測定冷凍食品中6種常規(guī)季銨鹽與1種新型季銨鹽共7種化合物的分析方法,為制定冷凍食品中季銨鹽化合物殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為新型季銨鹽類消毒劑產(chǎn)品上市后的監(jiān)測與監(jiān)管提供高效、便捷、準(zhǔn)確可靠的技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜-Xevo TQ質(zhì)譜儀、ACQUITYTMUPLC BEH C8色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、保護(hù)柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm)(美國Waters公司);多點振蕩器(德國Heidolph公司); Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司); Legend Mach 1.6R高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司)。

甲醇、乙腈與甲酸(均為色譜純,德國Merck公司);乙酸銨(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司);N-丙基乙二胺(PSA, 40 μm,美國Agilent公司);標(biāo)準(zhǔn)品芐基十二烷基二甲基氯化銨(benzyldimethyldodecylammonium chloride, C12-BAC,純度99%)、芐基十四烷基二甲基氯化銨(benzyldimethyltetradecylammonium chloride, C14-BAC,純度98%)、芐基十六烷基二甲基氯化銨(benzyldimethylhexadecylammonium chloride, C16-BAC,純度95%)、十二烷基三甲基溴化銨(dodecyl trimethyl ammonium bromide, C12-ATMAC,純度99%)、雙十烷基二甲基氯化銨(didecyldimethylammonium chloride, C10-DDAC,純度95%)與度米芬(domiphen bromide,純度97%)購自美國Sigma-Aldrich公司;Ephemora(純度99.0%)由安徽啟威生物科技有限公司提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC、C12-ATMAC、C10-DDAC、度米芬與Ephemora各10 mg(準(zhǔn)確至0.01 mg),分別用甲醇溶解并定容至10 mL,配制1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,-20 ℃下密封保存。

分別準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量于同一容量瓶中,加90%甲醇水溶液(含0.5%甲酸)稀釋至刻度,得到10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液;吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)使用液適量于10 mL容量瓶中,加90%甲醇水溶液(含0.5%甲酸)稀釋至刻度,得到100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液;密封后4 ℃保存。

分別準(zhǔn)確移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(100 ng/mL)5、10、50、100、500、1 000與5 000 μL到10 mL容量瓶中,用90%甲醇水溶液(含0.5%甲酸)定容至刻度,配制0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0與50.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

冷凍三文魚、雞肉樣品于室溫化凍后,取500 g可食用的肌肉部分,均質(zhì)機打碎混勻,稱取1.0 g(精確到0.001 g)均勻樣品于50 mL離心管中,加入18 mL 90%甲醇水溶液(含0.5%甲酸)提取液,渦旋振蕩20 min,超聲提取10 min,以10 000 r/min離心10 min,上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,加90%甲醇水溶液(含0.5%甲酸)定容至20 mL,混勻后,移取1 mL上清液置于裝有100 mg PSA凈化劑的15 mL離心管中,渦旋1 min后,10 000 r/min離心5 min,取上層凈化液直接用UPLC-MS/MS進(jìn)樣測定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:UPLC BEH C8柱(50 mm×2.1mm, 1.7 μm),保護(hù)柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:10 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;流動相A: 5 mmol/L乙酸銨水溶液;流動相B:甲醇。梯度洗脫程序:0～3.0 min, 50%A～20%A; 3.0～5.0 min, 20%A; 5.0～5.1 min, 20%A～50%A; 5.1～7.1 min, 50%A。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI+)源;毛細(xì)管電壓:3.50 kV;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:800 L/h;碰撞氣流量:0.12 mL/min;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。待測物的母離子、子離子及對應(yīng)的碰撞能量、錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 7種季銨鹽化合物的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇的7種季銨鹽化合物結(jié)構(gòu)式中均含有正電荷的N和負(fù)電荷的Cl或Br,在水溶液中易離解成離子,以[M-Cl]+或[M-Br]+的形式存在,采用電噴霧離子源易獲得高豐度的分子離子。配制500 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用直接進(jìn)樣方式,ESI+模式下進(jìn)行全掃描,確定待測物的分子離子,以分子離子峰作為母離子進(jìn)行子離子掃描,獲得各待測物的子離子。以新型季銨鹽化合物Ephemora為例,其相對分子質(zhì)量為410.1,分子離子峰[M-Cl]+(m/z374.2),結(jié)構(gòu)式如圖1所示,酯基和烷基易發(fā)生斷裂,產(chǎn)生豐度較強的m/z113.0碎片。按照歐盟委員會執(zhí)行條例(EU) 2021/808的要求,采用低分辨質(zhì)譜分析殘留時,至少滿足1個母離子和兩子離子進(jìn)行確證的要求,本實驗選擇離子豐度最強的子離子作為定量離子,兩個離子豐度較強的子離子作為定性離子。使用Waters TQ MS自動調(diào)諧分析功能,調(diào)節(jié)錐孔電壓,優(yōu)化子離子的碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù),經(jīng)優(yōu)化后的參數(shù)如表1所示。

圖1 新型季銨鹽化合物的分子結(jié)構(gòu)式

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實驗比較了Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters BEH T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Waters BEH C8(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱對7種待測物的分離、響應(yīng)值和峰形的影響,實驗表明,7種待測物在BEH C18色譜柱上無響應(yīng)值,無法分離出色譜峰,這與待測物含有較長的碳鏈有關(guān),容易被C18色譜柱中的填料吸附,較難洗脫[4]。采用BEH T3色譜柱時,待測物色譜峰嚴(yán)重拖尾,無法獲得滿意的峰形;采用BEH C8色譜柱時,待測物的峰形對稱尖銳,響應(yīng)值較高,7種待測物達(dá)到基線分離。故選擇BEH C8色譜柱作為分析柱。

實驗考察了0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇、5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈與5 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇等流動相對色譜分離及靈敏度的影響。實驗發(fā)現(xiàn),采用甲醇為有機相時,7種季銨鹽化合物的響應(yīng)值均高于乙腈。在水相中加入少量的甲酸或乙酸銨,能改善待測物的峰形,增加靈敏度,且5 mmol/L乙酸銨溶液的靈敏度高于0.1%(v/v)甲酸水溶液。確定甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相,優(yōu)化梯度洗脫程序,待測物的峰形尖銳對稱、靈敏度高。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

標(biāo)準(zhǔn)方法[33]采用酸化甲醇提取消毒劑中C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC、C12-ATMAC、C10-DDAC和度米芬。針對食品中的季銨鹽化合物,文獻(xiàn)報道的提取溶劑有乙腈[16]、乙腈-乙酸乙酯(50∶50, v/v)混合液[31]等。本實驗比較了甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈、甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等不同提取溶劑的提取效果,以陰性三文魚為基質(zhì)樣品,添加25.0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行加標(biāo)回收。結(jié)果顯示,提取溶劑中含有甲醇時7種待測物的響應(yīng)值高,回收率優(yōu)于乙腈。進(jìn)一步比較不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液(10%～90%)后發(fā)現(xiàn),隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加,待測物的峰面積逐漸增加,甲醇體積分?jǐn)?shù)為90%時7種待測物的響應(yīng)值最高。同時,正離子模式下,甲酸提供的H+,可提高離子化效率。在90%甲醇水溶液加入不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸(0.1%～0.5%)后發(fā)現(xiàn),隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的增加,待測物的靈敏度增加,甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.5%時靈敏度與回收率最高。因此,確定90%甲醇水溶液(含0.5%甲酸)為提取溶劑。

2.3.2凈化劑及含量的選擇

將提取液經(jīng)4 ℃下10 000 r/min離心5 min,取上清液直接進(jìn)樣,發(fā)現(xiàn)7種季銨鹽化合物的加標(biāo)回收率為107%～132%,除C16-BAC的回收率為107%之外,其余化合物的回收率均大于120%,超出60%～120%的范圍,且未經(jīng)過凈化的進(jìn)樣液顏色較深,高速離心無法除去色素等雜質(zhì),存在共提物干擾響應(yīng),同時易造成污染,影響儀器與色譜柱的壽命。針對復(fù)雜食品基質(zhì)的凈化處理,有固相萃取柱法、QuEChERS法、分散固相萃取法(dSPE)、PRiME HLB柱一步凈化法等,而QuEChERS法以快速、簡單、廉價、有效、安全的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用[34]。常見的凈化劑有PSA、C18和石墨化炭黑(GCB)。針對季銨鹽化合物的凈化,已發(fā)現(xiàn)C18和GCB會吸附季銨鹽,導(dǎo)致回收率降低,僅采用PSA凈化時,回收率高[29]。本實驗考察了不同PSA用量(50、75、100、150 mg)下的凈化效果。以陰性三文魚為基質(zhì)樣品,添加7種季銨鹽混合標(biāo)準(zhǔn)液,使其含量為25.0 μg/kg,按照1.3節(jié)樣品前處理方法提取后上機測定,比較加標(biāo)回收率。結(jié)果表明,提取液未經(jīng)PSA凈化,C14-BAC的回收率為113%,其余待測物的加標(biāo)回收率均大于120%;經(jīng)50 mg PSA凈化后,各待測物的回收率為105%～116%,基質(zhì)增強效應(yīng)得到改善;增加PSA用量,各待測物的回收率有所降低;當(dāng)PSA用量增加到100 mg時,各待測物的回收率為94.0%～109%,滿足GB/T 27417-2017的相關(guān)要求(回收率為60%～120%)。綜合考慮凈化效果和待測物回收率,選用100 mg PSA為最佳凈化劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

選用冷凍陰性三文魚與雞肉為基質(zhì)樣品,按1.3節(jié)方法處理,獲得空白基質(zhì)液,用該空白基質(zhì)液配制系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時,采用90%甲醇水溶液(含0.5%甲酸)溶劑配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)文獻(xiàn)[35]報道的方法,采用公式ME=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的斜率-1)×100%來計算7種季銨鹽化合物的基質(zhì)效應(yīng),以評價食品基質(zhì)中共提物對季銨鹽化合物響應(yīng)值的影響。按照|ME|> 50%為強基質(zhì)效應(yīng),20%<|ME|<50%為中等基質(zhì)效應(yīng),|ME|<20%為弱基質(zhì)效應(yīng)的判定依據(jù)，結(jié)果顯示,三文魚樣品對Ephemora具有基質(zhì)抑制效應(yīng)(ME為-4.83%),對C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC、C12-ATMAC、C10-DDAC和度米芬均具有基質(zhì)增強效應(yīng),其ME值分別為11.9%、19%、33.4%、18.3%、2.92%和8.29%, C16-BAC在三文魚樣品基質(zhì)中為中等基質(zhì)效應(yīng),其余6種均為弱基質(zhì)效應(yīng)。雞肉樣品對C12-ATMAC與C16-BAC具有基質(zhì)增強效應(yīng),對C12-BAC、C14-BAC、C10-DDAC和度米芬具有基質(zhì)抑制效應(yīng),雞肉樣品中7種季銨鹽化合物的ME范圍為-27.5%～14.9%,除Ephemora為中等基質(zhì)效應(yīng)外,C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC、C12-ATMAC、C10-DDAC和度米芬均為弱基質(zhì)效應(yīng)。7種季銨鹽化合物在實際樣品中的基質(zhì)效應(yīng)大小如圖2所示。可見不同的食品基質(zhì)樣品對7種季銨鹽化合物有基質(zhì)效應(yīng)的影響,在實際樣品的檢測中,本實驗采用陰性空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量進(jìn)一步補償基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖2 雞肉、三文魚基質(zhì)樣品中7種季銨鹽化合物的基質(zhì)效應(yīng)

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

取適量的7種季銨鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液,采用陰性三文魚與雞肉樣品的基質(zhì)液配制0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,優(yōu)化的儀器條件下上機測定,以待測物峰面積(y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x, ng/mL)為橫坐標(biāo),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線,外標(biāo)法定量。7種季銨鹽化合物在0.1～100 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)(r2)范圍為0.997 1～0.998 3(見表2)。

表2 7種季銨鹽化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

選擇陰性三文魚基質(zhì)樣品,添加適量濃度的7種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照上述1.3節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理,上機測定,分別以3倍信噪比與10倍信噪比對應(yīng)的含量為檢出限(LOD)與定量限(LOQ),該方法的LOD為0.5～1.0 μg/kg, LOQ為1.5～3.0 μg/kg(見表2)。

2.5.2準(zhǔn)確度與精密度

選擇陰性的基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,以驗證方法的準(zhǔn)確度和精密度。標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008規(guī)定,已制定食品最大殘留限量(MRL)的物質(zhì),選擇濃度水平為方法定量限、MRL值與合適濃度點進(jìn)行加標(biāo),未制定MRL的物質(zhì),選擇濃度水平為方法定量限、常見限量值與合適濃度點進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。目前我國還沒有制定食品中季銨鹽化合物的最大殘留限量,歐盟規(guī)定食品中季銨鹽化合物殘留限量為0.1 mg/kg。本研究依據(jù)上述相關(guān)規(guī)定進(jìn)行加標(biāo)試驗,具體方法如下:準(zhǔn)確稱取1.0 g陰性樣品,添加不同濃度水平(低、中、高)的7種季銨鹽混合標(biāo)準(zhǔn)液,使其添加量分別為3.0(Ephemora為1.50)、10.0與100.0 μg/kg,按照1.3節(jié)方法處理樣品后,上機測定,每個添加水平平行測定6次,結(jié)果如表3所示,平均回收率范圍為65.4%～101%,均在60%～120%范圍內(nèi),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍為0.64%～16.8%,符合GB/T 27417-2017的相關(guān)要求。

表3 冷凍雞肉、三文魚樣品中7種季銨鹽化合物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 實際樣品的測定

采用建立的分析方法對從超市采集的15份冷凍水產(chǎn)品進(jìn)行檢測,包括凍羅非魚片、凍三文魚、凍南美對蝦等品種。僅1份樣品中檢出季銨鹽化合物,含量值為27.6 μg/kg,未超出EFSA規(guī)定的食品中季銨鹽化合物殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。冷凍水產(chǎn)品中檢出季銨鹽化合物有可能來自環(huán)境的污染或消毒處理時的殘留。

3 結(jié)論

基于QuEChERS法,改進(jìn)樣品前處理與色譜-質(zhì)譜條件,通過一次性前處理對6種常見季銨鹽化合物和1種新型季銨鹽化合物進(jìn)行提取、凈化,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定,可在5.0 min內(nèi)完成7種季銨鹽化合物的快速定量檢測。該方法簡便快捷,靈敏度高,選擇性強,基質(zhì)效應(yīng)低,適用于批量冷凍食品中季銨鹽化合物的測定,同時,該方法彌補了新型季銨鹽化合物Ephemora檢測方法的空白,為新型季銨鹽消毒劑產(chǎn)品的監(jiān)管提供了檢測技術(shù),為制定我國食品中季銨鹽化合物的最大殘留限量提供了數(shù)據(jù)支持。