許 磊,曹 璐,胡平國

(四川省內(nèi)江市動植物疫病防控和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心,四川 內(nèi)江 610200)

隨著社會的不斷發(fā)展,畜牧養(yǎng)殖業(yè)越來越現(xiàn)代化、規(guī)?；图s化。為了降低動物的發(fā)病率和死亡率,促進動物的生長,改善動物源食品的品質(zhì),獸藥的使用已成為畜牧養(yǎng)殖業(yè)不可缺少的基礎(chǔ)?；前奉愃幬锸侵妇哂袑Π被交酋０方Y(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱,由于其抗菌譜較廣、價格低廉、使用簡便、性質(zhì)較穩(wěn)定、方便長期儲存等諸多優(yōu)點,常作為獸藥應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中預防和治療細菌感染性疾病[1]。但近年來,由于科學知識的缺乏和經(jīng)濟利益的驅(qū)使,濫用、非法使用和超標使用磺胺類藥物的情況普遍存在,許多動物源食品中常常存在該類藥物的殘留問題,導致人類往往成為該類藥物的“被動吸收者”,極大可能引發(fā)過敏反應、血液系統(tǒng)反應、肝功能損害以及泌尿道損害等,危害人類的身體健康。因此,中國、歐盟、美國、國際食品法典委員會均規(guī)定了動物源性食品中磺胺類藥物的最大殘留限量值[2]。

通常動物源食品的原形樣品種類繁多、成分復雜、干擾因素多,不適合直接用于分析檢測,因而在進行磺胺類藥物殘留分析檢測前必須對樣品進行前處理操作。樣品前處理是為了去除樣品中的微小顆粒,減少干擾物質(zhì),將樣品中的磺胺類藥物殘留提取出來并進行濃縮凈化,從而提高分析檢測的靈敏度、選擇性、準確度及精密度,保護色譜柱及儀器,改善和優(yōu)化色譜分析等。由此可見,樣品前處理技術(shù)是分析檢測及其關(guān)鍵的環(huán)節(jié),占用近70%的檢測工作量,樣品前處理的好壞直接影響分析結(jié)果的準確性[3]。文章重點簡述QuEChERs方法、SPE法和傳統(tǒng)前處理方法三類常用的磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的前處理方法,通過分析比較,尋找出高效、快速的前處理方法,對縮短磺胺類藥物殘留的檢測時間,提高檢測分析結(jié)果的準確性提供參考。

1 QuEChERs方法

QuEChERs方法是2003年由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades M等人開發(fā)的一種基于固相萃取和基質(zhì)固相分散技術(shù)的前處理方法。該方法具有快速(Quick)、簡單(Easy)、低廉(Cheap)、有效(Effective)、穩(wěn)定(Rugged)和安全(Safe)的特點,將這六個特點的英文字母簡寫組合在一起,由此命名 QuEChERs[4]。近年來,QuEChERs方法發(fā)展迅速,目前已在多個檢測領(lǐng)域廣泛應用。隨著技術(shù)不斷改進,QuEChERs方法在磺胺類藥物的分離中有很好的提取效果。以下介紹一個磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的QuEChERs前處理方法作為參考。

1.1 實驗原理

選擇5%甲酸乙腈溶液作為萃取溶劑,實現(xiàn)高效的蛋白質(zhì)沉淀,將磺胺類藥物殘留萃取到有機相中。再利用增強型脂質(zhì)去除凈化管(dSPE EMR-Lipid)和反萃管(EMR-Polish)凈化鹽析萃取步驟相結(jié)合進行凈化,經(jīng)濃縮后定容裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.2 試劑和材料

乙腈(色譜純)、甲酸(分析純)、dSPE EMR-Lipid增強型脂質(zhì)去除凈化管、EMR-Lipid Polish反萃管、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水,0.22μm濾膜。

1.3 儀器設(shè)備

電子天平(感量:0.01g)、移液器、渦旋震蕩器、離心機、氮吹儀。

1.4 實驗操作

稱取2g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,置于50mL離心管中,加入10mL 5%甲酸乙腈提取溶液,渦旋振蕩5min,5000r/min離心5min,上清液備用。dSPE EMR-Lipid 凈化管先用3mL水充分活化,再加入上述備用液,渦旋振蕩5min,5000r/min離心5min,上層溶液轉(zhuǎn)入EMR-Polish反萃管中,渦旋震蕩5min,5000r/min離心5min,上清液全部轉(zhuǎn)移至干凈離心管中,于40～50℃水浴氮吹至干。最后用0.5mL水和0.5mL 5%甲酸乙腈溶液定容,過0.22μm濾膜,裝入上機小瓶,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.5 分析結(jié)論

從前處理過程可以看出此方法操作步驟簡單,使用儀器設(shè)備較少,裝置簡單,花費時間較短,利于大批量操作。使用的試劑毒性較小,消耗量少,價格低廉,并且大部分操作都在封閉的離心管內(nèi)進行,對人體危害較小,對環(huán)境友好。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析結(jié)果可以得出:此方法的精密度和準確度都較高。但是,針對脂肪含量高的樣品,此方法的凈化效果不理想,提取效率較低以及凈化過程損失較大。

2 SPE法

SPE法是從80年代中期開始發(fā)展起來的一種樣品前處理方法,通過選擇不同類型的固相萃取柱將液體樣品中的目標化合物進行吸附后,再經(jīng)過洗脫從而分離和富集目標化合物[5]。以下介紹一個磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的SPE前處理方法作為參考。

2.1 實驗原理

選擇乙酸乙酯作為提取溶液,將組織樣品中的磺胺類藥物殘留提取出來,氮吹濃縮后用0.1mol/L鹽酸溶液溶解殘渣,再經(jīng)過固相萃取凈化后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

2.2 試劑和材料

乙酸乙酯(色譜純)、正已烷(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、鹽酸(分析純)、氨水(分析純)、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水,MCX固相萃取柱(150mg,6mL)、0.22μm濾膜。

2.3 儀器設(shè)備

電子天平(感量:0.01g)、移液器、渦旋震蕩器、離心機、氮吹儀、固相萃取裝置。

2.4 實驗操作

稱取5g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,置于50mL離心管中,加入15mL乙酸乙酯溶液,渦旋振蕩5min,5000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管,殘渣中再加入15mL乙酸乙酯溶液,重復上述操作,合并兩次提取液,于45℃水浴中氮吹至干。加入5mL 0.1mol/L的鹽酸溶液溶解殘渣,再加入5mL正己烷溶液,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液。鹽酸溶液中再加入5mL正己烷溶液,重復上述操作,下層溶液備用。MCX固相萃取柱先用3mL甲醇溶液和3mL 0.1mol/L鹽酸溶液活化和平衡,將上述備用液以自然滴液速度過柱,然后分別用2mL 0.1mol/L鹽酸溶液和2mL(水∶甲醇∶乙腈=55∶25∶20)溶液淋洗小柱,真空抽干。最后用2mL(水∶甲醇∶乙腈∶氨水=75∶10∶10:5)溶液洗脫,真空抽干,收集洗脫液,于45℃水浴中氮吹至干。準確加入1mL水定容,過0.22μm有機濾膜后,裝入上機小瓶,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測分析。

2.5 分析結(jié)論

從前處理過程可以看出此方法使用的溶劑毒性較小,有機溶劑消耗量較少,對操作人員健康危害較小,對環(huán)境友好。但操作復雜,勞動強度較大,手工操作居多,容易損失樣品,周期時間較長,不利于大批量操作,成本較高,完成一個樣品處理需要較高的價格。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析結(jié)果可以得出:此方法精密度和準確度都較低。

3 傳統(tǒng)前處理方法

傳統(tǒng)前處理方法包括液液萃取法或溶劑萃取法,是利用2種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離目的的方法?；前奉愃幬餁埩魴z測的傳統(tǒng)前處理方法比較多,以下主要介紹3個磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的傳統(tǒng)前處理方法,為提高檢測分析效率和檢測分析結(jié)果的準確性提供參考性意義。

3.1 方法一

3.1.1 實驗原理 將C18填料加入到組織樣品中,研磨均勻,選擇乙腈水(乙腈∶水=1000∶30)溶液作為提取溶液,在微波輻射輔助下將組織樣品中的磺胺類藥物提取出來,再加入乙腈飽和的正己烷溶液分離凈化后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

3.1.2 試劑和材料 C18填料(40μm)、乙腈(色譜純)、正已烷(色譜純)、乙腈飽和的正己烷溶液(將200mL正己烷溶液裝入250mL分液漏斗中,加入少量乙腈溶液,劇烈振搖幾分鐘后,靜置分層,棄去下層乙腈溶液)、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水、0.22μm濾膜。

3.1.3 儀器設(shè)備 電子天平(感量:0.01g)、玻璃研缽、移液器、渦旋震蕩器、家用微波爐、離心機、氮吹儀。

3.1.4 實驗操作 稱取2g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,裝入玻璃研缽,再稱取6g C18填料同樣裝入玻璃研缽,用玻璃杵輕輕研磨將組織樣品與C18填料混合均勻。混合均勻后的樣品轉(zhuǎn)移至干凈的50mL離心管,加入25mL乙腈水(乙腈∶水=1000∶30)溶液,渦旋振蕩5min,放入家用微波爐,用光波模式微波輻照30s,5000r/min離心5min,乙腈層轉(zhuǎn)入100mL分液漏斗。殘渣中再加入25mL乙腈溶液,渦旋振蕩5min,微波爐光波模式微波輻照30s,5000r/min離心5min,合并乙腈提取液,待凈化。往裝有乙腈提取液的分液漏斗中加入25mL乙腈飽和正己烷溶液,振搖5min,靜置2min,將下層乙腈溶液轉(zhuǎn)入干凈的50mL玻璃試管,于45℃水浴氮吹至干。準確加入1mL乙腈水(乙腈∶水=1∶1)溶液溶解殘渣后,轉(zhuǎn)移至10mL離心管中,再加入1mL乙腈飽和正己烷溶液,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液,下層乙腈水溶液過0.22μm濾膜后,裝入上機小瓶,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

3.1.5 結(jié)果分析 從前處理過程可以看出此方法無需特殊裝置,成本也較低,但是操作繁瑣,費時費力,不利于大批量操作。使用的溶劑毒性較小,但有機溶劑消耗量大,不但對操作人員的健康有一定影響,還會造成環(huán)境污染。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)此方法的精密度和準確度都較低。

3.2 方法二

3.2.1 實驗原理 選擇乙酸乙酯溶液作為提取溶液,將組織樣品中的磺胺類藥物殘留提取出來,分取適量提取液氮吹至干,再用定溶液(甲醇∶5mmol/L甲酸溶液=20∶80)定容,經(jīng)正己烷溶液去脂后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

3.2.2 試劑和材料 乙酸乙酯(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸(分析純)、正己烷(色譜純)、定溶液(甲醇∶5mmol/L甲酸溶液=20∶80)、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水、0.22μm濾膜。

3.2.3 儀器設(shè)備 分析天平(量感:0.01g)、移液器、均質(zhì)機、渦旋震蕩器、離心機、氮吹儀。

3.2.4 實驗操作 稱取5g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,置于50mL離心管中,加入15mL乙酸乙酯溶液,超聲10min,14000r/min均質(zhì)30s,5000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)入25mL比色管。殘渣中再加入10mL乙酸乙酯溶液,超聲10min,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,合并上清液至比色管中,用乙酸乙酯定容至25mL,搖勻后,分取5mL于15mL離心管中,40℃水浴氮吹至干。用2mL定溶液(甲醇∶5mmol/L甲酸溶液=20∶80)溶解殘渣,渦旋振蕩1min,超聲5min,加入5mL正己烷溶液,渦旋振蕩30s,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液,再加入5mL正己烷溶液,渦旋振蕩30s,10000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液,下層清液過0.22μm濾膜后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

3.2.5 分析結(jié)論 從前處理過程可以看出此方法操作簡單,無需特殊的儀器設(shè)備便能完成整個處理過程,花費時間較短,適合大批量操作,使用的溶劑較少,毒性較小,對人體健康危害較小,對環(huán)境友好,成本較低,用較低的價格就能完成樣品處理。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析結(jié)果可以得出:此方法的精密度和準確度均中等。

3.3 方法三

3.3.1 實驗原理 選擇乙腈溶液作為提取溶液,將組織樣品中磺胺類藥物殘留提取出來,氮吹濃縮后,再用流動相(乙腈∶0.01mol/L乙酸銨溶液=12∶88)定容,正己烷溶液去脂后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

3.3.2 試劑與材料 乙腈(色譜純)、正已烷(色譜純)、乙酸銨(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、流動相(乙腈∶0.01mol/L乙酸銨溶液=12∶88)、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水、0.22μm濾膜。

3.3.3 儀器設(shè)備 分析天平(量感:0.01g)、移液器、均質(zhì)機、渦旋震蕩器、離心機、氮吹儀。

3.3.4 實驗操作 稱取5g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,置于50mL離心管,加入15mL乙腈溶液,再加入10g無水硫酸鈉,均質(zhì)2min,5000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)入干凈離心管中。殘渣中再加入10mL乙腈溶液,渦旋振蕩5min,5000r/min離心5min,合并上清液。50℃水浴氮吹至干,準確加入1mL流動相(乙腈∶0.01mol/L乙酸銨溶液=12∶88)和1mL正己烷溶溶液解殘渣,轉(zhuǎn)移至10mL離心管,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液。再加入1mL正己烷溶液,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液,下層清液過0.22μm濾膜后,裝入上機小瓶,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

3.3.5 結(jié)果分析 從前處理過程可以看出此方法操作簡單,使用儀器設(shè)備較少,無需良好訓練和較高技能便能很好地完成,花費時間較少,效率高,有利于大批量操作,使用的試劑毒性較小,有機溶劑使用量較少,對操作人員危害較小,以及對環(huán)境友好,成本較低,用較低的價格就能完成一個樣品的處理。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測分析結(jié)果可以得出:此方法的精密度和準確度都較高。

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展,人們對動物源食品的質(zhì)量和安全提出了更高的要求,獸藥殘留檢測已成為和民生息息相關(guān)的工作?；前奉愃幬镒鳛樽钇毡槭褂玫墨F藥種類之一,其殘留檢測也一直是獸藥殘留檢測工作的重點之一。為了保證磺胺類獸藥殘留檢測工作的效率和質(zhì)量,科學建立高效、準確的樣品前處理方法是及其重要和關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。